長鏈非編碼RNA linc00261在非小細胞肺癌組織中的表達及意義

王蕾 王心曉 陳忠仁 沈彬 歐宗興

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院呼吸內(nèi)科570208

非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌最常見的組織類型,約占所有肺癌患者的80%～85%,該病的發(fā)病率和病死率均位居前列[1]。近年來,盡管NSCLC的臨床診治方法已得到不斷提高與更新,但患者的整體預(yù)后仍不理想,5年生存率一直較低[2]。NSCLC的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素共同參與的復(fù)雜性生物學(xué)過程[3],目前尚不清楚確切的發(fā)病機制,因此,探究NSCLC的分子生物學(xué)特點及發(fā)病機制,對于提高NSCLC的臨床診治療效具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200核苷酸的不編碼蛋白質(zhì)的RNA[4]。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn),lnc RNA可在表觀遺傳學(xué)、基因組轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多個層面上調(diào)控基因的表達[5-6],同時,lnc RNA也與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生有關(guān)[7-8]。本研究重點分析了一種新 的lncRNA,即 位 于20p11的lncRNA linc00261[9],盡管有研究表明lncRNA linc00261在多種癌癥進展中發(fā)揮作用[10-11],但lncRNA linc00261在NSCLC中的作用如何尚未被發(fā)現(xiàn)。因此,本研究初步探討了lncRNA linc00261在NSCLC組織中的表達及其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究納入中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院2017年2月至2018年9月收治的100例NSCLC患者,其中男59例,女41例;年齡(61.35±11.07)歲,年齡范圍為42～79歲。本研究符合 《赫爾辛基宣言》的原則,患者及其家屬均簽署臨床研究知情同意書。所有患者均接受手術(shù)治療,經(jīng)手術(shù)病理確診為原發(fā)性NSCLC,術(shù)前均未接受任何放療、化療等輔助治療,同時術(shù)中取對應(yīng)癌旁組織(距癌組織邊緣≥1 cm)為對照組織,所有癌旁組織樣本均經(jīng)病理證實為正常肺組織。所有經(jīng)手術(shù)取出的新鮮NSCLC組織及癌旁組織均立即經(jīng)液氮冷凍處理,并于-80℃的冰箱中保存待用。

NSCLC細胞系A(chǔ)549細胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中,37℃、5% CO2常規(guī)培養(yǎng),每2 d換液1次。

1.2 方法

1.2.1 實時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測NSCLC組織及癌旁組織中l(wèi)ncRNA linc00261的表達 取50 mg左右樣本組織超聲勻漿,嚴格按RNA提取試劑盒(美國GeneCopoeia公司)說明書提取組織中總RNA,使用紫外分光光度計(美國賽默飛公司)測定RNA質(zhì)量和濃度。嚴格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國ABI公司)操作說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)體系為20μl,冰上依次加入以下試劑:1μmol/L逆轉(zhuǎn)錄特異性引物3μl、10×RT buffer 1.5μl、100 mmol/L d NTPs 0.15μl、50 U/μl MultiScribeTM Reverse Transcriptase 1.0μl、20 U/μl RNA酶 抑 制 劑0.19μl、總RNA 1μl,加DEPC水補至20μl。反應(yīng)條件:25℃反應(yīng)10 min,37℃反應(yīng)60 min,85℃反應(yīng)5 min,產(chǎn)物4℃保存。按照STBR Premix Ex Taq試劑盒(大連寶生物有限公司)操作說明書進行qPCR擴增。反應(yīng)體系為20μl,冰上依次加入以下試劑:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 1μl、引物1μl、Taq Man GEx MASTER Mix 10μl,加雙蒸水補至20μl。反應(yīng)條件:95℃反應(yīng)5 min預(yù)變性,95℃反應(yīng)15 s,56℃反應(yīng)30 s,72℃反 應(yīng)30 s,共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法計算lncRNA linc00261表達水平,以GAPDH為內(nèi)參,計算3個復(fù)孔均值,根據(jù)各樣本的平均Ct值,以2-ΔΔCt表示目的基因表達水平,lncRNA linc00261相對表達 量=2-ΔΔCt值(lnc RNA linc00261)-2-ΔΔCt值(GAPDH)。

1.2.2 lnc RNA linc00261表達質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染及鑒定 根據(jù)GenBank中l(wèi)ncRNA linc00261基因序列,由大連寶生物有限公司合成lncRNA linc00261表達質(zhì)粒。嚴格按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(上海書吉生物科技有限公司)操作說明書將lncRNA linc00261表達質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染至A549細胞,轉(zhuǎn)染48 h后,收集細胞,采用qRT-PCR檢測重組質(zhì)粒在A549細胞中l(wèi)ncRNA linc00261的表達水平。

1.2.3 細胞增殖檢測 轉(zhuǎn)染lncRNA linc00261表達質(zhì)粒、空載體的A549細胞及未轉(zhuǎn)染的A549細胞分別為lncRNA linc00261組、陰性對照組、空白對照組,均培養(yǎng)于96孔板上,每組設(shè)置5個復(fù)孔,使用MTT法檢測培養(yǎng)0、24、48、72、96 h后的細胞增殖情況。

1.2.4 細胞凋亡檢測 收集轉(zhuǎn)染48 h后的A549細胞及未轉(zhuǎn)染的A549細胞,嚴格按照Annexin VFITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(北京凱瑞基生物科技有限公司)操作說明書進行細胞染色,于染色30 min內(nèi)使用流式細胞儀(美國BD公司)進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.00處理數(shù)據(jù),計量資料用表示,采用t檢驗或單因素方差分析進行數(shù)據(jù)比較;計數(shù)資料以例數(shù)表示,采用χ2檢驗進行數(shù)據(jù)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA linc00261在NSCLC組織及癌旁組織中的表達 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,100例NSCLC患者癌組織中l(wèi)nc RNA linc00261的相對表達量(0.15±0.06)明顯低于癌旁組織(1.19±0.23),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.753,P＜0.05)。

2.2 lncRNA linc00261的表達與NSCLC患者臨床病理特征的關(guān)系 不同性別、年齡、腫瘤直徑及病理組織類型的NSCLC患者癌組織中l(wèi)ncRNA linc00261相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＞0.05),但不同組織分化程度、臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中l(wèi)ncRNA linc00261相對表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＜0.05),見表1。

2.3 lnc RNA linc00261對A549細胞增殖及凋亡的影響 qRT-PCR法檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染lncRNA linc00261表 達 質(zhì) 粒 的A549細 胞 中l(wèi)ncRNA linc00261的相對表達量顯著高于轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組及空白對照組(F=5.196,P＜0.001),見圖1。MTT檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染24 h后,3組之間細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.183,P＞0.05);轉(zhuǎn)染48、72、96 h后,轉(zhuǎn)染lnc RNA linc00261表達質(zhì)粒的A549細胞的細胞增殖能力顯著低于轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組及空白對照組(t=3.187、5.549,P值均＜0.05),見圖2。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染48 h后,轉(zhuǎn)染lnc RNA linc00261表達質(zhì)粒的A549細胞的凋亡比例顯著高于轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組及空白對照組(χ2=4.175、6.093,P值均＜0.05),見圖3。

3 討論

lnc RNA在發(fā)現(xiàn)初期曾一度被認為是基因組轉(zhuǎn)錄過程中的 “噪音”[12],然而,隨著研究的深入,人們開始發(fā)現(xiàn)lncRNA可在表觀遺傳學(xué)、基因組轉(zhuǎn)錄水平及轉(zhuǎn)錄后水平等多個層面上調(diào)控基因的表達[13-14]。據(jù)報道,lncRNA可通過影響腫瘤細胞增殖、遷移、抵抗凋亡、逃避生長抑制因子及促進血管生成等方面參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[15-16]。近年來,盡管NSCLC治療規(guī)范己逐步完善,開始出現(xiàn)新的化療藥物即靶向藥物,但NSCLC的總體治療效果并不理想[17]。因此,尋找新的研究方向,進一步探究NSCLC的分子生物學(xué)特點及發(fā)病機制,明確其早期診斷及治療靶標,對于提高NSCLC的臨床診治具有重要意義,而目前引起廣泛關(guān)注的lncRNA可能正是我們所要尋找的NSCLC研究的突破口。

表1 lncRNA linc00261的表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系()

表1 lncRNA linc00261的表達與非小細胞肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系()

病理特征 例數(shù)lncRNA linc00261相對表達量 統(tǒng)計值 P值性別 t=0.082 0.718 59 0.16±0.04女41 0.13±0.03年齡 t=0.592 0.431＜60歲 38 0.17±0.04≥60歲 62 0.14±0.03腫瘤直徑 t=0.087 0.916＜5 cm 49 0.16±0.03≥5 cm 51 0.14±0.05病理組織類型 F=0.273 0.360腺癌 63 0.13±0.04鱗癌 28 0.14±0.05大細胞癌 9 0.16±0.05組織分化程度 F=6.117＜0.001低分化 49 0.06±0.02中分化 22 0.12±0.02高分化 29 0.24±0.07臨床分期 F=5.269＜0.001Ⅰ期 14 0.19±0.06Ⅱ期 41 0.13±0.03Ⅲ期 45 0.07±0.03淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 t=4.893＜0.001是53 0.09±0.03否47 0.21±0.06男

目前,在NSCLC中新發(fā)現(xiàn)多種lnc RNA[18],但迄今為止,lncRNA與NSCLC的關(guān)系尚不明確。lncRNA linc00261是近年來發(fā)現(xiàn)的一種在多種癌癥進展中發(fā)揮抑癌作用的長鏈非編碼RNA[19-20],但迄今有關(guān)lnc RNA linc00261在NSCLC中的作用尚未被研究。本研究通過qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),100例NSCLC患者癌組織中l(wèi)nc RNA linc00261的平均相對表達量明顯低于癌旁組織(P＜0.05),表明lnc RNA linc00261在NSCLC組織中表達下調(diào),可能與NSCLC的發(fā)病有關(guān)。本研究進一步分析了lnc RNA linc00261的表達與NSCLC組織中患者臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性,結(jié)果顯示,不同性別、年齡、腫瘤直徑及病理組織類型的NSCLC患者癌組織中l(wèi)ncRNA linc00261相對表達量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,但不同組織分化程度、臨床分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中l(wèi)ncRNA linc00261相對表達量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,這提示lncRNA linc00261的表達與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),可能在NSCLC中發(fā)揮抑癌作用。由于lncRNA linc00261表達下調(diào)促進NSCLC的惡性轉(zhuǎn)化,因此我們推測上調(diào)lnc RNA linc00261的表達可能是臨床治療NSCLC的一個潛在靶點。

圖1 3組細胞中l(wèi)ncRNA linc00261表達水平的比較

圖2 MTT法檢測過表達lncRNA linc00261對A549細胞增殖的影響

圖3 流式細胞術(shù)檢測過表達lncRNA linc00261對A549細胞凋亡的影響 A:空白對照組;B:陰性對照組;C:lncRNA linc00261組

基于上述臨床標本研究結(jié)果,本研究進行了體外細胞實驗,初步探討了過表達lnc RNAlinc00261對NSCLC細胞系增殖及凋亡的影響。MTT檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染24 h后,3組細胞增殖能力之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;轉(zhuǎn)染48、72、96 h后,轉(zhuǎn)染lnc RNA linc00261表達質(zhì)粒的A549細胞的細胞增殖能力顯著低于轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組及空白對照組(P＜0.05);流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染48 h后,轉(zhuǎn)染lncRNA linc00261表達質(zhì)粒的A549細胞的凋亡比例顯著高于轉(zhuǎn)染空載體的陰性對照組及空白對照組(P＜0.05),提示上調(diào)lncRNA linc00261的表達可抑制NSCLC細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。

綜上所述,lnc RNA linc00261在NSCLC患者癌組織中表達下調(diào),并與NSCLC的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),其在NSCLC中可能發(fā)揮抑癌基因作用,過表達lnc RNA linc0026可抑制NSCLC細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡,有可能成為NSCLC潛在的治療靶點。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突