NADPH氧化酶4與非小細(xì)胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性研究

李艷 胡進(jìn)秀 崔節(jié)達(dá) 郝斌威 郝永發(fā) 張紅 陳娟

1寧夏醫(yī)科大學(xué),銀川750004;2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,銀川750004;3廣州醫(yī)科大學(xué)510000

根據(jù)2014年惡性腫瘤死亡數(shù)得出死亡前十位惡性腫瘤依次是肺癌、肝癌、胃癌、食管癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、腦腫瘤、白血病、淋巴瘤。肺癌是最常見(jiàn)的死亡原因,2014年,我國(guó)新發(fā)肺癌約78.1萬(wàn),死亡病例約62.6萬(wàn),居同期惡性腫瘤死亡原因第1位[1]。2017年全球預(yù)計(jì)新增癌癥病例16.8萬(wàn),癌癥死亡60萬(wàn)例,其中肺癌死亡人數(shù)占全部癌癥死亡總數(shù)的12%左右[2]。非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要組成部分,對(duì)于晚期NSCLC,化療、靶向治療和新興免疫治療仍是主要治療手段,但5年相對(duì)生存率僅為19.7%[3-4]。造成肺癌患者死亡的主要原因之一是肺癌的遠(yuǎn)隔臟器的轉(zhuǎn)移[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)相比局部和/或遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的早期肺癌相比,晚期肺癌的生存率僅為19.7%[4],明顯降低。因此深入研究肺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制,探索可能的早期干預(yù)靶點(diǎn)是肺癌防控工作的重點(diǎn),也是改善肺癌生存率的關(guān)鍵。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transformation,EMT)是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞與細(xì)胞間連接,喪失上皮細(xì)胞的極性,細(xì)胞失去上皮細(xì)胞特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞的特質(zhì),具備遷移和侵襲能力的一個(gè)過(guò)程[6-8]。EMT是胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷愈合重要的組織修復(fù)過(guò)程,同時(shí)也是器官纖維化和癌癥進(jìn)展的重要過(guò)程[6-8]。在腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展中,癌細(xì)胞可以通過(guò)EMT逃離原有的癌灶,侵入周?chē)M織,并通過(guò)血液或淋巴途徑在遠(yuǎn)處定植,從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)移[6,9-10]。EMT的發(fā)生和發(fā)展使腫瘤細(xì)胞極性喪失,降低細(xì)胞與細(xì)胞間黏連,細(xì)胞骨架重組,上皮表型的標(biāo)志物如E-鈣粘連蛋白(E-cadherin,E-Ca)下調(diào),間質(zhì)表型的標(biāo)志物如N-鈣粘連蛋白(N-cadherin,N-Ca)等上調(diào),增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞抵御凋亡的能力。越來(lái)越多的證據(jù)表明EMT在許多病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)及其下游信號(hào)通路是EMT重要的誘導(dǎo)因子[12]。TGF-β1在腫瘤進(jìn)展中有兩方面作用,在腫瘤起始,TGF-β1作為抑制因子誘導(dǎo)細(xì)胞分化和凋亡,阻止不可控的增殖和凋亡;而在癌癥晚期,TGF-β1/TGF-β受體Ⅱ型/TGF-β受體Ⅰ型復(fù)合體誘導(dǎo)smad依賴(lài)和smad非依賴(lài)通路驅(qū)動(dòng)EMT重構(gòu),導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移[13-14]。

正常條件下,細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化等生理過(guò)程中起著重要的作用,并且作為第二信使參與信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。但過(guò)量的ROS聚集就會(huì)造成氧化/抗氧化失衡并由此產(chǎn)生氧化損傷[15-16]。NADPH氧化酶(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)是體內(nèi)ROS的主要來(lái)源,是一類(lèi)質(zhì)膜相關(guān)的酶蛋白家族,由DUOX1-2、NOX1-5 7個(gè)家族成員組成,其中NOX4分布最為廣泛,尤其在肺臟表達(dá)尤為豐富,研究證明:NOX4在人肺成纖維細(xì)胞、肺動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞、肺氣道平滑肌細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞中均有不同程度的表達(dá)[17-18]。研究表明,TGF-β1在人類(lèi)胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高,進(jìn)而誘導(dǎo)NOX1和NOX4的表達(dá),增加細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。與此同時(shí),伴隨E-Ca表達(dá)降低和N-Ca表達(dá)升高,以及EMT進(jìn)程相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子如Snail等的表達(dá)變化,提示EMT參與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展,且NADPH氧化酶與EMT相關(guān)[19]。此外,多量研究發(fā)現(xiàn),TGF-β介導(dǎo)的細(xì)胞EMT與ROS的產(chǎn)生相關(guān)[19-21]。因此,本研究擬探討:NSCLC是否存在EMT現(xiàn)象及肺癌EMT的發(fā)生與NOX4的相關(guān)關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象與分組 選取2015～2018年在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院年齡范圍為38～75歲病理確診的NSCLC患者的石蠟包埋手術(shù)標(biāo)本和或纖支鏡取材肺組織標(biāo)本為肺癌組(29例),病理切片HE染色后,再經(jīng)2名病理執(zhí)業(yè)醫(yī)師雙盲法二次復(fù)核診斷。肺癌的分類(lèi)依據(jù)最新(2015)WHO肺癌分類(lèi)方法,相關(guān)分期按照IASLC分期方法[22]。選取同期入院年齡范圍為30～80歲病理確診的肺部良性病變石蠟包埋手術(shù)標(biāo)本和或纖支鏡取材組織標(biāo)本為對(duì)照組(20例),經(jīng)HE染色病理切片證實(shí)為良性病變。所有石蠟包埋標(biāo)本均取自寧夏醫(yī)科大學(xué)病理科。

本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院科研倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2019-447),獲得患者知情同意書(shū)。

1.2 試劑 兔抗NOX4抗體購(gòu)自美國(guó)Novus公司,兔抗E-Ca抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司,兔抗Vimentin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司,山羊抗兔、兔辣根過(guò)氧化物酶抗體、血清封閉液等免疫組化試劑購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 研究方法 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺組織內(nèi)NOX4、E-Ca、波形蛋白(Vimentin)的表達(dá),肺組織切片經(jīng)脫蠟、水化、高壓修復(fù)5 min后待修復(fù)液自然冷卻,3% H2O2清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,山羊血清封閉1 h,一抗4℃過(guò)夜孵育(1∶200稀釋NOX4抗體,1∶200稀釋E-Ca抗體,1∶250稀釋Vimentin抗體);次日37℃復(fù)溫1 h后,滴加二抗37℃孵育30 min,DAB顯色(顯微鏡下監(jiān)測(cè))、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明、封片、鏡下采圖。陰性對(duì)照以PBS代替一抗。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野,采用Image.J軟件對(duì)肺組織切片進(jìn)行分析,求得每個(gè)視野下NOX4、E-Ca及Vimentin蛋白著色的平均光密度值(average optical density,AOD)后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示,方差齊性檢測(cè)后結(jié)果比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法及Spearman相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組與對(duì)照組一般情況比較 收集2015～2018年寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理確診的NSCLC 29例。其中,男21例,女8例;年齡(54.67±8.63)歲,年齡范圍為38～75歲(其中＜60歲者15例,≥60歲者14例);吸煙者16例,不吸煙者13例;無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者18例,有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者11例;組織學(xué)分型腺癌13例(其中高中分化4例,低分化9例),鱗癌16例(其中高中分化3例,低分化13例)。選取同期病理確診的20例肺部良性病變組織作為對(duì)照(其中肺結(jié)核6例,炎性腫塊8例,良性囊變2例,3例血管瘤,1例錯(cuò)構(gòu)瘤)。2組一般情況比較見(jiàn)表1。

2.2 肺癌組及對(duì)照組EMT相關(guān)蛋白及NOX4蛋白的表達(dá)情況 免疫組織化學(xué)結(jié)果示:E-Ca主要表達(dá)部位為細(xì)胞的胞膜,E-Ca蛋白在肺癌組及對(duì)照組肺組織中表達(dá)的平均光密度值分別為(5.15±6.67)和(14.97±7.68),2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-4.819,P＜0.001);Vimentin主要表達(dá)部位為細(xì)胞胞漿及間質(zhì),Vimentin在肺癌組及對(duì)照組肺組織中表達(dá)的平均光密度值分別為(26.42±8.40)和(11.66±8.30),2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.078,P＜0.001)。NOX4主要表達(dá)部位為細(xì)胞胞漿及胞核,NOX4在肺癌組及對(duì)照組肺組織表達(dá)的平均光密度值分別為(29.36±11.60)和(11.27±7.36),2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.160,P＜0.001)。見(jiàn)圖1。

2.3 NOX4蛋白表達(dá)與NSCLC患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)關(guān)系 肺癌組NOX4蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率為79.3%(23/29),陰性率為20.7%(6/29),NOX4蛋白的表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)(P=0.018);而與性別、年齡、吸煙史、腫瘤分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P值均＞0.05),表2。

2.4 2組NOX4與E-Ca及Vimentin蛋白表達(dá)的相關(guān)性 肺癌組NOX4蛋白的表達(dá)與E-Ca的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.612,P=0.001),NOX4的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.593,P=0.001);在對(duì)照組,NOX4蛋白的表達(dá)與E-Ca的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.101,P=0.671),NOX4與Vimentin的表達(dá)無(wú)相關(guān)性(r=0.109,P=0.649),見(jiàn)圖2。

表1 肺癌組及對(duì)照組一般情況比較

表2 非小細(xì)胞肺癌患者中NOX4表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系(例)

圖1 2組肺組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白及NADPH氧化酶4表達(dá)的病理圖片 免疫組織化學(xué)染色 ×400 A:肺癌組E-鈣粘連蛋白的表達(dá);B:對(duì)照組E-鈣粘連蛋白的表達(dá);C:肺癌組波形蛋白的表達(dá);D:對(duì)照組波形蛋白的表達(dá);E:肺癌組NADPH氧化酶4的表達(dá);F:對(duì)照組NADPH氧化酶4的表達(dá)

圖2 2組NOX4與E-Ca、Vimentin表達(dá)的相關(guān)性 A:肺癌NOX4與Vimentin表達(dá)的相關(guān)性;B:肺癌組NOX4與E-Ca表達(dá)的相關(guān)性;C:對(duì)照組NOX4與Vimentin表達(dá)的相關(guān)性;D:對(duì)照組NOX4與E-Ca表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

肺癌是嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康的惡性腫瘤之一,也稱(chēng)為當(dāng)今世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤。雖然NSCLC的治療在手術(shù)、放療、化療與靶向治療中都取得了一定的進(jìn)展,但五年生存率仍低,由于NSCLC缺乏典型的臨床表現(xiàn),往往在初次診斷時(shí)多已經(jīng)是晚期[2]。

越來(lái)越多的證據(jù)表明EMT參與腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[11]。EMT可分為3型,其中Ⅰ型EMT,主要發(fā)生在胚胎和胎兒發(fā)育期間,誘發(fā)上皮胚胎細(xì)胞發(fā)育進(jìn)入間充質(zhì)結(jié)構(gòu)反映其在胚胎發(fā)生[23-24]。Ⅱ型EMT是自然發(fā)生的正常傷口愈合,本質(zhì)上不是病理性的過(guò)程[25]。Ⅲ型EMT本質(zhì)上是具有病理性的,由于新生血管的形成而與Ⅱ型EMT有過(guò)不同。Ⅲ型EMT與許多纖維化疾病有關(guān),如肺纖維化[26]、腎纖維化[27]和眼纖維化[28];同時(shí)與乳腺癌、肺癌、和胃癌等癌癥疾病也密切相關(guān)[29]。肺組織上皮細(xì)胞在受到外界因素比如空氣污染中的苯并芘、PM2.5以及香煙中的尼古丁等致癌物質(zhì)刺激后,細(xì)胞在癌變的過(guò)程中經(jīng)歷EMT進(jìn)程,細(xì)胞表型發(fā)生變化[30],上皮細(xì)胞標(biāo)志比如E-Ca、緊密連接蛋白等表達(dá)下降甚至丟失,同時(shí)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白比如N-Ca、Vimentin、纖連蛋白、細(xì)胞角蛋白等表達(dá)升高,上皮細(xì)胞更多的具有間質(zhì)細(xì)胞的特征[31-32],本研究結(jié)果顯示上皮表型的標(biāo)志物E-Ca在NSCLC患者腫瘤組織中表達(dá)降低,而間質(zhì)表型的標(biāo)志物Vimentin在NSCLC患者腫瘤組織中表達(dá)增高,且E-Ca和Vimentin的異常表達(dá)與NSCLC腫瘤病理類(lèi)型無(wú)關(guān),提示EMT參與了NSCLC不同類(lèi)型腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。

ROS在腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、增殖、凋亡和遷移中起著重要的作用,ROS在體內(nèi)的作用主要分為兩方面:有益的一方面是其可以作為第二信使,傳遞轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的生物信號(hào),調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、遷移以及黏附等生理過(guò)程,還可以清除入侵體內(nèi)的微生物,起到防御功能;有害的一方面是大量ROS使機(jī)體組織遭受氧化損傷,造成疾病發(fā)生[33]。在哺乳動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi),ROS主要來(lái)源于NADPH氧化酶[34]。研究發(fā)現(xiàn),在TGF-β過(guò)量存在時(shí),NOX家族蛋白高表達(dá)以及ROS水平增加,細(xì)胞會(huì)發(fā)生EMT進(jìn)程,最終促進(jìn)細(xì)胞的遷移[35-37]。研究表明:氧化劑可以誘導(dǎo)TGFβ1上調(diào)NOX4,進(jìn)而再產(chǎn)生ROS,誘導(dǎo)肺纖維母細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化進(jìn)而引起纖維化進(jìn)程[32]。本研究結(jié)果顯示:NOX4在NSCLC患者腫瘤組織中表達(dá)增高。并且NOX4蛋白表達(dá)與患者腫瘤低分化程度有顯著相關(guān)性,NOX4蛋白的表達(dá)與E-Ca的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性,NOX4的表達(dá)與Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)性,以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明NOX4可能在NSCLC EMT的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

綜上,NSCLC組織存在以上皮表型向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的EMT。同時(shí),伴有NOX4的高表達(dá),且NOX4的表達(dá)與腫瘤分化程度相關(guān)。提示NOX4介導(dǎo)的ROS可能參與到肺癌細(xì)胞EMT的發(fā)展過(guò)程。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突