龍金通淋膠囊中龍膽苦苷ＨＰＬＣ測定結果的不確定度分析

荀秀彪 張順平

【摘 要】 目的：建立高效液相色譜法（HPLC）測定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量測定的不確定度評定方法。方法：通過建立高效液相色譜法（HPLC）測定龍金通淋中龍膽苦苷含量的數(shù)學模型，分析不確定度的來源，并對各個不確定度分量、合成不確定度進行評估，得出擴展不確定度。結果：高效液相色譜法（HPLC）測定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量為4.57mg/粒，置信概率P為95%時，其擴展不確定度為0.18mg，測定結果可以表示為（4.57±0.18）mg，k=2。結論：該法可用于高效液相色譜法（HPLC）測定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量的不確定度分析。

【關鍵詞】 高效液相色譜法;龍金通淋膠囊;龍膽苦苷;含量測定;不確定度

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2020）3-0052-04

Abstract：Objective To establish the general method of Uncertainty analysis on gentiopicrin content determination of longjin tonglin capsule by HPLC. Methods By establishing the mathematical model for the determination of gentiopicrin in longjintonglin capsule was established by HPLC， The source of uncertainty is analyzed， and the uncertainty component and synthetic uncertainty are evaluated， and the extended uncertainty is obtained.Results HPLC external standard method showed gentiopicrin content determination of longjin tonglin capsule 4.57 mg/grains，when the fiducial probability P was 95%，the extended uncertainty is 0.18mg， and the measurement result can be expressed as （4.57±0.18）mg， k=2.Conclusion The method can be used to determine the uncertainty of gentiopicrin content determination of longjin tonglin capsule by HPLC.

Keywords：HPLC;Longjin Tonglin Capsule;Gentiopicrin;Content Determination;Uncertainty

龍金通淋膠囊由龍膽、魚腥草、白花蛇舌草、金錢草、梔子、茯苓等12味藥組成，具有清熱利濕、化瘀通淋的功效，臨床用于濕熱瘀阻所致的淋證、尿急、尿頻、尿痛、前列腺炎、前列腺增生見上述證候者[1]。其質量標準[2]（WS-10375（ZD-0375）-2002-2012Z）中龍膽苦苷含量測定方法為高效液相色譜法。該實驗根據(jù)相關文獻及資料[3-5]，對高效液相色譜法測定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量的不確定度進行分析，初步建立適用于高效液相色譜法（HPLC）測定龍金通淋膠囊中龍膽苦苷含量的不確定度評定方法，消除在檢驗過程中可能帶來的誤差，以控制測定結果的有效性和適宜性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本島津LC-20A型高效液相色譜儀（四元泵，自動進樣器，柱溫箱， 紫外檢測器）;KQ-300UDB型雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;MS205DU電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）;PURELAB Flex 3一體式超純水儀（英國ELGA公司）。

1.2 藥品與試劑 龍金通淋膠囊（批號：190503，云南希陶綠色藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：0.46g/粒，）;龍膽苦苷對照品（批號：110770-201918，含量為97.1%，中國食品藥品檢定研究院）。甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-水（22∶78）為流動相;檢測波長為274nm;柱溫35℃。理論板數(shù)按龍膽苦苷峰計算不低于5000。

2.2 對照品溶液的制備 取龍膽苦苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1mL中約含0.1mg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取市售的龍金通淋膠囊裝量差異項下的內容物，研細，混勻，取0.6g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理30min（功率150W，頻率55Hz），放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，棄出濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各5uL，注入液相色譜儀，測定，即得。測定結果見表1，色譜圖如圖1所示。

3 結果分析

3.1 數(shù)字模型 按照《中國藥典》2015版二部規(guī)定，含量計算公式：

Y=A供×W對×P對×V供×W平均裝量A對×W供×V對

公式中Y為每粒中龍膽苦苷的含量（mg＼粒）;A供為供試品溶液峰面積;W對為對照品稱樣量（mg）;P對為對照品純度;V供為供試品溶液的稀釋倍數(shù);W平均裝量供試品的平均裝量（g）;A對為對照品溶液峰面積;W供為供試品稱樣量（g）;V對為對照品溶液的稀釋倍數(shù)。

3.2 不確定度的來源分析 從公式中可以看出龍膽苦苷的含量測定不確定度主要來源于供試品溶液峰面積;供試品稱樣量;供試品溶液的稀釋倍數(shù);供試品的平均裝量;對照品純度;對照品稱樣量;對照品溶液峰面積;對照品溶液的稀釋倍數(shù)以及高效液相色譜儀測量帶來的不確定度。

3.3 各分量不確定度的量化評定

3.3.1 對照品純度引起的不確定度urel（PR） 龍膽苦苷對照品假定其分布期間為±0.05%，按照B類不確定度，矩形分布分析，其相對不確定度urel（PR）=0.05%/3/0.971=2.97×10-4。

3.3.2 對照品稱量引起的相對不確定度urel（WR） 主要來源于天平的示差和天平稱量的重復性。天平示差的不確定度：電子天平（d=0.01mg）檢定檢定證書：918023718-001給出示差誤差為±0.05mg，按B類不確定度，矩形分布分析，其不確定度為：Ua=0.05/3=0.029mg;天平稱量重復性的不確定度：電子天平檢定證書：918023718-001給出天平示值重復性標準偏差0.15mg，按B類不確定度，矩形分布分析，其不確定度為：Ub=0.15/3=0.087mg。則單次稱量的標準不確定度為：0.0292+0.0872=9.17×10-2mg。采用減重稱量，需2次稱量，所以標準不確定度為：2×（9.17×10-2）2=1.30×10-1mg。兩份對照品稱樣量為10.01mg和10.16mg，則對照品稱重引入的相對不確定度：urel（WR）=（1.30×10-110.01）2+（1.30×10-110.16）2=1.83×10-2。

3.3.3 對照品稀釋引起的相對標準不確定度urel（VR） ①對照品溶液配制過程使用的A級100mL容量瓶，按照JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[6]A級的100mL容量瓶的容量允差為±0.10mL，因多年校準結果實際誤差較小，按照三角分布，屬于B類不確定度，其標準不確定度為：u允差（100）=0.106=4.08×10-2mL。②溫度效應：實驗時環(huán)境溫度為23℃，按照JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[6]水的體積膨脹系數(shù)為0.00021mL/℃，因此產生的體積變化為100×0.00021×3=0.063mL，按照矩形分布，屬于B類不確定度，其相對不確定度為：u溫度（100）=0.0633=3.64×10-2，于是由對照品稀釋引起的標準不確定度由以上2項合成得到u（VR）=（4.08×10-2）2+（3.64×10-2）2=5.47×10-2，則urel（VR）=5.47×10-2＼100=5.47×10-4。

3.3.4 對照品峰面積引入的相對不確定度urel（AR） 樣品在測試過程中受進樣體積重復性、泵流速的穩(wěn)定性、分離的重復性、組分在色譜柱滯留變化、檢測器的穩(wěn)定性、積分變動性等隨機變化的影響，可合并為進樣重復性進行測量[7]，屬于A類不確定度。對照品1重復進樣5次，峰面積為534.5、534.2、537.6、535.8、535.3，平均值為535.5，對照品1峰面積的標準不確定度：

3.3.7 供試品稀釋引起的相對不確定度urel（Vx） ①供試品溶液配制過程使用一支A級的50mL單標線吸量管，按照JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[6]A級的50mL單標線吸量管的容量允差為±0.05mL，因多年校準結果實際誤差較小，按照三角分布，屬于B類不確定度，其標準不確定度為： u允差（50）=0.056=2.04×10-2mL。②溫度效應：實驗時環(huán)境溫度為23℃，按照JJG196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[6]水的體積膨脹系數(shù)為0.00021mL/℃，因此產生的體積變化為50×0.00021×3=0.0315（mL）按照矩形分布，屬于B類不確定度，其相對不確定度為：u溫度（50）=0.03153=1.82×10-2mL。

于是供試品制備過程引入的合成標準不確定度u（Vx）∶u（Vx）=（2.04×10-2）2+（1.92×10-2）2=2.80×10-2，其相對不確定度：urel（Vx）=2.80×10-2＼50=5.60×10-4。

3.3.8 供試品峰面積的相對不確定度urel（Ax） 供試品溶液測定含量時平行進樣4針，記錄峰面積1為327.7、326.1，平均值為326.9，極差值為1.6，取n=2時的極差系數(shù)C=1.13，用極差法計算[10-11]其不確定度為u（Ax1）=RC=1.42，相對不確定度urel（Ax1）=4.34×10-3，2為324.8、325.8，平均值為325.3，相對不確定度urel（Ax2）=2.72×10-3，故供試品溶液峰面積的相對不確定度為：urel（Ax）=（4.34×10-3）2+（2.72×10-3）2=5.12×10-3。

3.3.9 高效液相色譜儀測量引入的不確定度urel（HPLC） 高效液相色譜儀測量引入的不確定度[12]由計量檢定機構檢定校準得來，日本島津LC-20A型高效液相色譜儀檢定證書（證書編號：918028710）給出的相對不確定度為0.002。

3.4 合成相對不確定度 不確定度各分量分析結果[13]，見表2。

3.5 擴展不確定度U 測量結果符合正態(tài)分布，取置信概率為95%，包含因子k=2，則U=k×uc（Y）=2×0.088=0.18mg，含量測定結果可以表示為：Y=（4.57±0.18）mg（k=2，置信概率為95%）。

4 討論

雖然一切測量結果都不可避免具有誤差，且由于測量誤差的存在，需要對被測量值的不能肯定的程度和結果的可信賴程度進行評定，即不確定度的評定。不確定度越小，測結果與被測量的真值愈接近，質量越高，水平越高，其使用價值越高;不確定度越大，測量結果的質量越低，水平越低，其使用價值也越低。不確定度是測量結果質量的重要參數(shù)指標。在報告物理量測量的結果時，必須給出相應的不確定度，一方面便于使用它評定其可靠性，另一方面增強測量結果之間的可比性。因此測量不確定度評定成為檢測和校準實驗室必不可少的工作之一，使用“不確定度”代替“誤差”更為科學。因此，不確定度在測量領域內越來越受到社會重視，被廣泛應用。

通過對龍膽苦苷含量測定的不確定度來源進行分析，列出了檢測過程中各影響因素，雖然高效液相色譜法中高效液相色譜儀本身對測量結果的影響因素就很多[14]，但可以盡量減少影響主要來自于對照品稱量的相對不確定度[15]，同時按照標準操作規(guī)程進行檢驗，減少不必要的稀釋步驟，嚴格控制實驗環(huán)境和條件，定期做好天平、液相色譜儀、玻璃儀器的校驗工作，盡量減少不確定度的影響因素，進而提高含量測定結果的質量。

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