獨山石楠幼莖的離體組織培養(yǎng)

趙立軍　李茂林　宋麗莎

摘要：以獨山石楠屬的幼莖作為外植體，對其進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)與分化、幼芽增殖、生根培養(yǎng)等技術(shù)的較為系統(tǒng)的研究。

關(guān)鍵詞：獨山石楠;幼莖;組織培養(yǎng)

中圖分類號：S-3

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200215024

收稿日期：2019-12-24

作者簡介：趙立軍（1974-），男，講師，碩士。研究方向：轉(zhuǎn)基因植物、植物組織培養(yǎng)等。

獨山石楠不僅具有觀賞性，還具有藥用價值，市場需求量大，但我國的獨山石楠主要以國外引進(jìn)為主。面對國內(nèi)苗圃公司對獨山石楠苗木的需求，通過組織培養(yǎng)建立經(jīng)濟(jì)、有效的繁殖體系，能有效適應(yīng)市場需求，對培育具有我國自主產(chǎn)權(quán)的苗木具有重要的意義。

以MS作為組培的基本培養(yǎng)基，通過相關(guān)技術(shù)手段，記錄獨山石楠腋芽的消毒時間、植物激素比例、初代培養(yǎng)、繼代培養(yǎng)的相關(guān)數(shù)據(jù)，試著建立獨山石楠的組培技術(shù)方法與規(guī)范。

1 獨山石楠的組織培養(yǎng)

1.1 實驗原材料

獨山石楠的腋芽。于2018年7月15日在獨山縣采摘的獨山石楠的腋芽部位作為外植體，用于建立獨山石楠的快速繁殖體系。

1.2 組織培養(yǎng)

1.2.1 實驗材料預(yù)處理

將帶腋芽的枝條剪去多余的莖和葉，分割成包括腋芽在內(nèi)的莖段，約為1.5cm左右，用4.9%的洗潔精水溶液浸泡18min，把莖段用鑷子夾到事先備好的容器中，放在流水下洗滌2.5h備用。

1.2.2 對腋芽的消毒

把經(jīng)過預(yù)處理后的獨山石楠腋芽置于容器中，經(jīng)過紫外殺菌35min后，往容器內(nèi)置入濃度為75%的乙醇消毒35s，然后用無菌水沖洗4～5次備用。取出腋芽置于濃度為0.1%HgCl2消毒劑中消毒。設(shè)置不同的時間梯度進(jìn)行不同的處理，最后得到不同消毒時間對外植體發(fā)芽成活率的影響結(jié)果，20d后統(tǒng)計污染率及萌芽率。

1.2.3 進(jìn)行初代培養(yǎng)

進(jìn)行初代培養(yǎng)采用NAA、6-BA 2種植物激素，以2種植物激素及不同濃度的配比作為自變量，篩選出最佳的初代培養(yǎng)基。取消毒后的多個腋芽，分別接種在不同激素及不同濃度配比的培養(yǎng)基中，每組各處理15個，采用正交試驗設(shè)計。23d后統(tǒng)計叢生芽萌芽率、芽高及生長情況。

1.2.4 進(jìn)行繼代培養(yǎng)

進(jìn)行繼代培養(yǎng)采用NAA、6-BA、IBA、KT 4種植物激素，用4種植物激素、不同濃度的配比作自變量，來篩選最優(yōu)的繼代培養(yǎng)基。將從初代培養(yǎng)基中培育得出的叢生芽，接種在不同植物激素及不同濃度配比的繼代培養(yǎng)基內(nèi)，每組各處理15個，仍然采用正交試驗設(shè)計方案。23d后統(tǒng)計萌發(fā)率、芽高、生長情況。

1.3 實驗結(jié)果及分析

1.3.1 對獨山石楠腋芽的消毒處理

在無菌操環(huán)境中用濃度0.1%的HgCl2對獨山石楠的幼莖腋芽進(jìn)行消毒時，以消毒時間（5min、8min、10min）為自變量，把消毒后的幼莖腋芽接種在配制好的初代培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，23d后統(tǒng)計污染率、萌發(fā)率。

從實驗結(jié)果看，消毒用時對獨山石楠腋芽誘導(dǎo)發(fā)芽成活率有極其顯著的影響。如果對腋芽消毒不到位，會引起大面積污染情況。用0.1%HgCl2對獨山石楠腋芽進(jìn)行消毒處理時，時間太短會導(dǎo)致腋芽消毒不徹底，致使污染率太高;但是消毒時間太長又會導(dǎo)致HgCl2對腋芽的組織及其表層細(xì)胞造成不同程度的傷害，最后造成獨山石楠幼莖的腋芽損傷，甚至使其死亡，導(dǎo)致死亡率增高。

方差分析結(jié)果可以看出，消毒時間長短對腋芽發(fā)芽率的影響有著顯著差異性（P=0.042），但對污染率的影響沒有顯著差異性（P=0.059）。而且在用HgCl2對腋芽消毒的過程中，可以看到發(fā)芽率會隨著消毒時間的延長而逐漸下降，所以對獨山石楠腋芽的最佳消毒時間是 8min。

1.3.2 進(jìn)行初代培養(yǎng)

對腋芽用0.1%HgCl2消毒8min，分別接種到處理分組中，每組各處理12個，統(tǒng)計叢芽的發(fā)芽率，選擇芽量芽高作為觀察指標(biāo)，觀察芽的生長狀況，如表1所示。當(dāng)腋芽接種到初代培養(yǎng)基后9d，腋芽處長出嫩黃色的芽點，其插在初代培養(yǎng)基的葉柄處會開始膨脹，萌發(fā)愈傷組織。

進(jìn)行方差分析后，篩選出2種不同植物，葉片比較大，出芽量比較少，愈傷組織多，不同激素及不同濃度比例對獨山石楠腋芽的發(fā)芽率沒有顯著差異性（P=0.061），對芽高的影響有顯著性差異性（P=0.042），因此2種不同植物激素濃度的比例對獨山石楠腋芽的生長影響比較大。NAA和6-BA都是誘導(dǎo)獨山石楠腋芽萌發(fā)和生長的主要因素，其中6-BA在腋芽萌發(fā)率中起著主效應(yīng)的作用，隨著6-BA濃度的升高，腋芽萌發(fā)率也隨之而升高，但是隨著生長素NAA濃度的增加，發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。生長素NAA濃度的變化也會影響腋芽的發(fā)芽率，出現(xiàn)了先升高后又降低的趨勢。6-BA也是影響伸長生長的因子，隨著6-BA濃度的增加，平均芽高也隨之而增加。在對初代培養(yǎng)中這9種實驗處理分組的結(jié)果觀察過程中，可初步得獨山石楠腋芽的啟動培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+瓊脂9g/L+蔗糖30g/L，PH=6.0。

1.3.3 進(jìn)行繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)基中不同植物激素的不同濃度配比對叢生芽的增值有不同的影響結(jié)果，見表2所示。

在處理組1～3中，當(dāng)使用液體濃度不變時，會導(dǎo)致其他植物激素濃度逐漸增加，增值倍數(shù)和有效芽率、芽高都出現(xiàn)先升后降，其中第2組達(dá)到最高，增值倍數(shù)為0.67，有效芽率為87.5%，芽高達(dá)到2.15cm。處理組4～6中，其增值倍數(shù)和有效發(fā)芽率、芽高都呈現(xiàn)了逐漸降低的趨勢，在第4組中達(dá)到最低，增值倍數(shù)為1.00，有效芽率為83.3%，芽高為2.15cm。處理組7～9中，隨著植物激素濃度的升高，其增值倍數(shù)漸低，有效芽率呈增加趨勢，在第9組中達(dá)到最大為66.7%。第2、4、9處理分組中，第4處理組的效果是最好的，有效芽率達(dá)到83.3%，其組培瓶中組培苗生長健壯，根基部有較多的愈傷組織，有利于組培苗的生長。通過方差分析可得出，不同植物激素濃度配比對獨山石楠外植體的增值倍數(shù)的影響有顯著差異（P=0.032），對發(fā)芽數(shù)的影響無顯著差異（P=0.058），對芽高的影響有顯著差異（P=0.034）?？沙醪降贸?，獨山石楠繼代培養(yǎng)基為MS加1.0mg/L 6-BA加0.05mg/L NAA加2.0 mg/L KT加0.1mg/L IBA加蔗糖30g/L加瓊脂9g/L、PH=6.0。

2 對實驗結(jié)果的討論

2.1 不同消毒時間對外植體腋芽消毒效果的影響

植物組培過程中最大的難點是控制污染，組培過程中，操作環(huán)境、組織切段、接種用的各種工具、各種培養(yǎng)基、接種過程中每個步驟是否按常規(guī)進(jìn)行操作都可能引起不同程度的污染。如何在接種過程中降低污染率，最大程度地提高成活率，便于進(jìn)行各個階段的組培，減小實驗誤差，消毒這個流程在組培過程中占有重要的地位。

從野外采摘的獨山石楠帶腋芽附著很多微生物，那么選擇消毒劑就至關(guān)重要。要除掉莖段外體的微生物，不能損害莖段本體上的腋芽，腋芽需放入無菌水中徹底清洗，否則會影響最后實驗結(jié)果。在組培全過程中，消毒時間對腋芽的影響也很大，如果消毒時間不足，導(dǎo)致消毒不徹底，在后續(xù)的組培過程中可能導(dǎo)致高污染率，影響最后組培的結(jié)果;如果消毒用時過長可能會導(dǎo)致腋芽失去活性，最后影響組培的結(jié)果。所以，消毒時間長短對腋芽的組培起著至關(guān)重要的作用。

2.2 不同種類的植物激素及不同濃度的植物激素在初代培養(yǎng)中的影響

培養(yǎng)獨山石楠組培苗的各種環(huán)境條件、所用的培養(yǎng)基等都會影響腋芽組培的最終結(jié)果，而組培過程中誘導(dǎo)脫分化、生根和發(fā)芽的植物激素發(fā)揮著不可替代的作用。不同種類的植物激素及激素的分配比例，對誘發(fā)植物體內(nèi)細(xì)胞分裂的活動，促進(jìn)萌發(fā)，促進(jìn)芽和根的發(fā)育和生長起著非常重要的作用。在初代培養(yǎng)基及繼代培養(yǎng)基中加入不同植物激素的比例會影響到愈傷組織是先生芽還是先生根。

參考文獻(xiàn)

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[2] 李幸紅.紅葉石楠（Photinia fraseri）的組織培養(yǎng)及其3種藥用成分含量研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2016.

（責(zé)任編輯 賈燦）