紅花木蓮組織培養(yǎng)外植體消毒方法初步研究

高宇瓊+郭春喜+田鵬

摘 要：該文以紅花木蓮為試驗(yàn)材料，研究了不同消毒劑、不同消毒時(shí)間及不同外植體對(duì)紅花木蓮組織培養(yǎng)外植體的消毒效果的影響。結(jié)果表明：用75%酒精浸30s后，以0.1% HgCl2消毒10min，消毒效果最好；腋芽是組織培養(yǎng)的良好材料。研究結(jié)果為紅花木蓮組培快繁提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紅花木蓮；外植體；消毒劑；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào) S79 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）20-0017-03

Study on Disinfection for the Explants of Manglietia insignis in Tissue Culture

Gao Yuqiong et al.

（College of Agroforestry Engineering and Planning，Tongren University，Tongren 554300，China）

Abstract：Manglietia insignis was taken as material，the effect of different disinfectants，disinfection time and different explants on Manglietia insignis was studied. The results showed that the most optimal method of sterilization was dipping axillary bud in 75% alcobol for about 30s and then in the solution 0.1% HgCl2 for 10min；the axillary bud was the optimal explant. These results provide the basis for tissue culture and rapid propagation of Manglietia insignis.

Key words：Manglietia insignis；Explant；Disinfectants；Tissue culture

紅花木蓮（Manglietia insignis（wall）Blume）為木蘭科（Magnoliaceae）木蓮屬常綠闊葉喬木樹種中較原始的種類，自然分布于我國(guó)云南、廣西、貴州等地，尼泊爾、印度東北部、緬甸北部也有零星分布。紅花木蓮樹干通直，樹態(tài)優(yōu)美，葉形秀麗，花大呈紅色，是優(yōu)良的城市園林綠化樹種[1]；其生長(zhǎng)迅速，木材紋理通直，結(jié)構(gòu)細(xì)密，有光澤、香味，心材耐腐，不翹不裂，加工容易，也是優(yōu)良的裝飾用材和膠合板材樹種。但是，由于其分布零星、數(shù)量較少，且不斷被砍伐，目前遭遇了瀕臨滅絕的境地，被列為國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物[2-3]。組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為保護(hù)和繁殖珍貴樹種的有效措施之一，而外植體的消毒是組織培養(yǎng)成功的前提。本文就紅花木蓮組織培養(yǎng)中的外植體選擇和消毒進(jìn)行了研究，為紅花木蓮組培提供無菌材料，并為紅花木蓮組培快繁技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)材料取自貴州省銅仁市梵凈山自然保護(hù)區(qū)。選取生長(zhǎng)旺盛、健壯、無病害的成年紅花木蓮植株實(shí)生苗植株，取腋芽作為外植體進(jìn)行消毒試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的處理 將采集的外植體用流水沖10min，用洗衣粉浸泡3～4min，漂洗數(shù)次，再用流水沖洗30min。

1.2.2 不同消毒劑及消毒濃度試驗(yàn) 在超凈工作臺(tái)上，先用75%的酒精浸泡外植體30s，用無菌水沖洗1次，轉(zhuǎn)入消毒劑中消毒，然后按照下面處理方式對(duì)外植體進(jìn)行消毒試驗(yàn)，以不同濃度的消毒劑設(shè)計(jì)以下6種處理：（1）0.1%HgCl2消毒劑浸泡8min；（2）0.2%HgCl2消毒劑浸泡8min；（3）3%NaClO消毒劑浸泡8min；（4）4%NaClO消毒劑浸泡8min；（5）9%Ca（ClO）2消毒劑浸泡8min；（6）10%Ca（ClO）2消毒劑浸泡8min。處理后，用無菌水沖洗4～5次，濾紙吸凈外植體材料表面多余水分，然后接到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。每處理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)腋芽，試驗(yàn)重復(fù)3次，25d后分別觀察并統(tǒng)計(jì)污染率、殺傷率、存活率。

1.2.3 不同消毒時(shí)間試驗(yàn) 以上步試驗(yàn)選出的最宜濃度的消毒劑按照以下時(shí)間進(jìn)行消毒處理，消毒時(shí)間分別為2min、4min、6min、8min、10min、12min。每處理接種30瓶，每瓶接種1個(gè)腋芽，試驗(yàn)重復(fù)3次，25d后分別觀察并統(tǒng)計(jì)污染率、殺傷率、存活率。

1.2.4 不同外植體消毒試驗(yàn) 分別將紅花木蓮的嫩葉片、腋芽、帶芽的莖段、去皮種子經(jīng)0.1%HgCl2消毒8min后，用無菌水沖洗4～5次，濾紙吸凈外植體材料表面多余水分，將葉片切成1～2cm2的塊狀、帶芽莖段切成2～3cm的段狀，然后接到啟動(dòng)培養(yǎng)基上。每種外植體接種30瓶，每瓶接種1個(gè)，試驗(yàn)重復(fù)3次，25d后分別觀察并統(tǒng)計(jì)污染率、殺傷率、存活率。

1.3 培養(yǎng)條件 接種培養(yǎng)基為：MS+6-BA 1.5mg·L-1+NAA 1.0mg·L-1+2，4-D 1.0mg·L-1+3%蔗糖+0.7%瓊脂的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基滅菌前用1moL·L-1 NaOH將pH調(diào)至5.6～6.0。培養(yǎng)基于121℃、1.1kg/cm2條件下滅菌20min，自然冷卻凝固后使用。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度1 000～2 000Lx，光照時(shí)間12h/d。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用Microsoft Excel統(tǒng)計(jì)污染率、殺傷率、存活率。按照下列公式統(tǒng)計(jì)污染率及存活率：

污染率（%）=污染數(shù)/接種總數(shù)×100；

殺傷率（%）=受殺傷數(shù)/接種總數(shù)×100；

存活率（%）=（接種總數(shù)-污染數(shù)-受殺傷數(shù)）/接種的莖段總數(shù)×100

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒劑對(duì)外植體消毒效果的影響 不同濃度的消毒劑對(duì)紅花木蓮?fù)庵搀w消毒效果的影響，結(jié)果見表1。由表1可知：HgCl2比NaClO、Ca（ClO）2的存活率都高，污染率也較其他消毒劑低，經(jīng)HgCl2處理后的紅花木蓮腋芽外植體，存活數(shù)相對(duì)高、污染程度小，但是殺傷數(shù)比其他消毒劑大。不同濃度的NaClO、Ca（ClO）2的存活率相差不大，但污染率相差較大。不同濃度的相同消毒劑相比，均是高濃度的消毒效果比低濃度的好，但殺傷率也隨之增大?？傮w來說，3種消毒劑之間HgCl2與NaClO、Ca（ClO）2存在顯著差異，消毒效果為HgCl2>Ca（ClO）2>NaClO。在HgCl2兩個(gè)濃度處理時(shí)，隨著濃度的增大，污染率隨之下降，但殺傷率也提高，存活率反而降低。因此，綜合考慮污染率、殺傷率及存活率三者因素，本試驗(yàn)最適宜的消毒處理為處理1即0.1%HgCl2消毒8min的外植體存活率最高，達(dá)到81.1%。

2.2 消毒時(shí)間對(duì)外植體消毒效果的影響 以0.1% HgCl2為消毒劑，進(jìn)行不同消毒時(shí)間對(duì)外植體效果的影響，結(jié)果見表2。由表2可知，隨著消毒時(shí)間的增加，紅花木蓮腋芽外植體的存活率越來越高，在10min時(shí)紅花木蓮腋芽的成活率最高，達(dá)到84.4%。消毒時(shí)間太短，外植體的殺傷度較輕但其污染個(gè)數(shù)較多，而消毒時(shí)間太長(zhǎng)，外植體的殺傷度較重但其污染個(gè)數(shù)較少。因此選用污染個(gè)數(shù)較少，殺傷率中等的，成活率相對(duì)較高時(shí)間，作為紅花木蓮腋芽外植體消毒時(shí)間的適宜時(shí)間。

2.3 不同外植體對(duì)消毒效果的影響 以0.1% HgCl2消毒時(shí)間10min為消毒處理，用紅花木蓮當(dāng)年生嫩葉片、腋芽、帶芽的莖段、去皮種子進(jìn)行不同外植體消毒效果試驗(yàn)，結(jié)果見表3。由表3可知，腋芽作為外植體時(shí)，存活率達(dá)到84.4%且能夠發(fā)生分化，其次是去皮種子，而嫩葉片和帶芽的莖段相差不大。這可能是由于腋芽處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，腋芽?jī)?nèi)部帶菌較少，因而消毒效果比較好。帶芽的莖段存活率低的原因可能是莖段帶的細(xì)菌較多，以致消毒較難。去皮種子、嫩葉殺傷率較大，可能是消毒時(shí)間太長(zhǎng)，HgCl2對(duì)幼嫩組織殺傷力較大。對(duì)于植物幼嫩組織可適當(dāng)減少消毒時(shí)間。

3 結(jié)論與討論

木本植物組織培養(yǎng)中的困難之一是獲得無菌材料[4]。因此，外植體消毒成功與否，不僅關(guān)系到能否獲得無菌材料，更關(guān)系到紅花木蓮組培快繁技術(shù)的獲得。研究表明：不同的消毒劑對(duì)外植體消毒效果有不同的影響。本試驗(yàn)中，用腋芽作外植體時(shí)，HgCl2的消毒效果優(yōu)于NaClO、

Ca（ClO）2，獲得的無菌材料最多。這與蛇足石杉[5]、青榨槭[6]、四倍體刺槐[7]、大榕[8]、金銀花[9]、麻櫟[10]等植物外植體消毒研究結(jié)果一致。這是因?yàn)镠g2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)相結(jié)合，使細(xì)菌蛋白變性，酶失活[11]。

不同的消毒時(shí)間對(duì)于外植體消毒效果有明顯影響，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染率降低，但殺傷率升高，導(dǎo)致外植體存活率降低。因此，不能靠延長(zhǎng)滅菌時(shí)間來改善消毒效果，最佳消毒時(shí)間確立應(yīng)在綜合考慮污染率、殺傷率基礎(chǔ)上，以外植體存活率為最終判定依據(jù)[12-13]。本試驗(yàn)得到的最適宜的消毒時(shí)間為10min，此時(shí)達(dá)到了較好的消毒效果，

消毒劑對(duì)不同外植體的作用也不相同，這可能與外植體材料的組織部位、植株年齡、取材季節(jié)以及植株的生理狀態(tài)、質(zhì)量有關(guān)系。通過試驗(yàn)結(jié)果得出，腋芽是紅花木蓮?fù)庵搀w消毒最好的外植體，可能是腋芽所帶的污染相對(duì)較少，且腋芽處于萌動(dòng)時(shí)期，易分化，存活率高。

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