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    組織培養(yǎng)誘發(fā)玉米自交系H99、A188和黃早四的變異研究

    2017-01-06 19:25:41于曉明王霞
    吉林農(nóng)業(yè) 2016年12期
    關(guān)鍵詞:遺傳變異組織培養(yǎng)玉米

    于曉明 王霞

    摘要:本實驗利用AFLP技術(shù)對這三個玉米自交系的愈傷組織和再生苗進行遺傳變異分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),H99的再生率最低,并且具有最多的遺傳變異;而A188和黃早四的愈傷組織再生率都很高,而且愈傷組織和再生苗的變異較少。說明玉米愈傷組織在組織培養(yǎng)過程中的基因組穩(wěn)定性是與愈傷組織分化再生過程密切相關(guān)。

    關(guān)鍵詞:玉米;組織培養(yǎng);遺傳變異;AFLP

    基金項目:吉林省教育廳科學技術(shù)研究項目(吉教科合字〔2012〕第475號)

    中圖分類號: S513.03;S336 文獻標識碼: A DOI編號: 10.14025/j.cnki.jlny.2016.23.051

    組織培養(yǎng)誘發(fā)的植物體細胞變異(也稱植物體細胞克隆變異),一般是指在植物細胞、組織或器官的離體培養(yǎng)狀態(tài)下發(fā)生的遺傳變異或表觀遺傳變異[1],這些變異可以通過細胞分裂和植物再生而傳遞給后代。植物體細胞克隆變異的產(chǎn)生沒有種屬特異性,出現(xiàn)的頻率一般比較高,一個組織培養(yǎng)周期內(nèi)可產(chǎn)生1%~3%的無性系變異,有時甚至能高達90%以上[2]。植物通過體細胞克隆變異,可產(chǎn)生一系列有益的新性狀,對植物品種改良和新品種選育具有重要的意義[3]。然而體細胞胚或通過不定芽繁殖的植株經(jīng)常出現(xiàn)高頻率的體細胞克隆變異現(xiàn)象[4,5],又使其成為微繁和遺傳轉(zhuǎn)化工作中需要克服的重大難題。本試驗通過AFLP分子標記技術(shù)對玉米玉米自交系H99、A188和黃早四在組織培養(yǎng)過程中發(fā)生的DNA序列變異的頻率和狀態(tài)進行分析,探討分析玉米體細胞克隆遺傳變異的發(fā)生規(guī)律。

    1 材料和方法

    1.1實驗材料

    玉米自交系黃早四H99、A188和黃早四的種子苗、愈傷組織和再生苗。

    1.2組織培養(yǎng)和再生

    各玉米自交系在授粉后12天,取幼胚,誘導愈傷組織。誘導培養(yǎng)基:N6基本培養(yǎng)基+2.8克/升脯氨酸+1毫克/升 2,4-D+100毫克/升 水解酪蛋白+10毫克/升 硝酸銀+2%蔗糖+0.7%瓊脂(pH5.8),于25±1℃條件下,暗培養(yǎng)4周。繼代培養(yǎng)基:誘導培養(yǎng)基中添加2毫克/升 2,4-D,暗培養(yǎng)4周。分化培養(yǎng)基:N6基本培養(yǎng)基+1毫克/升 NAA+6%蔗糖+0.7%瓊脂(pH5.8),25±1℃、80umol·m-2·s-1光照強度、光照時間為14小時/天的條件下誘導再生苗。待再生苗長至2~3厘米高時取材。

    1.3 DNA提取

    分別采集種子苗、愈傷組織和再生苗的葉片,用改良的CTAB法[6]提取上述植物材料的基因組DNA。

    1.4 AFLP分子標記分析

    AFLP分子標記技術(shù)主要包括以下幾個環(huán)節(jié):酶切連接、預擴增、選擇性擴增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染檢測[7]。使用的限制性內(nèi)切酶為MseI和EcoRI。

    2 結(jié)果

    2.1 愈傷組織的誘導和植株再生

    玉米幼胚接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上以后,2天后幼胚開始膨脹,6天后就可見到開始生成愈傷組織,以后半個月內(nèi)都可陸續(xù)見到愈傷組織的產(chǎn)生,黃早四的出愈率最低(42%),A188的最高(80%)(見表1)。雖然H99表現(xiàn)出了較好出愈率但是再生率很低,僅為22.9%。

    2.2 AFLP分子標記檢測的遺傳變異

    本實驗以20對引物分別對各基因型玉米的種子苗、愈傷組織(愈傷)和隨機選取的4株再生苗(R1-R4)DNA樣品進行了AFLP分析。結(jié)果表明A188、H99、黃早四分別產(chǎn)生826,790,904條帶,呈多態(tài)性的帶的條數(shù)分別為30,62,38(表2)。

    以種子苗作為對照,供體來源相同的愈傷組織或再生植株,表現(xiàn)變異的遺傳位點在各個材料中表現(xiàn)并不一致(圖1):其中A188在愈傷組織和再生苗中變異的頻率比較接近(1.5%~2.7%);而H99的愈傷組織檢測到了較多的變異(6.2%),4株再生苗的變異相對下降(4.0%~4.5%);黃早四來源的愈傷組織發(fā)生變異比較少(2.5%),而在其再生苗中的檢測到的變異更少(0.8%~1.5%)。另外,在A188的愈傷組織和再生苗中檢測到的變異中,以條帶新增的變異為主,而H99和黃早四的愈傷組織和再生苗的變異條帶沒有表現(xiàn)出這樣的傾向。

    3 討論

    在組織培養(yǎng)過程中,為排除由于激素濃度或外部條件的不同或是離體培養(yǎng)時間不同而造成的遺傳變異頻率的不同,本實驗對各個材料均采用一致的誘導、繼代、分化培養(yǎng)基和一致的培養(yǎng)條件,并且選擇相同培養(yǎng)時間的愈傷組織和再生苗。結(jié)果表明,玉米愈傷組織在組織培養(yǎng)過程中的基因組穩(wěn)定性是與愈傷組織分化再生過程密切相關(guān)的,而且不同基因型玉米由組織培養(yǎng)誘導的遺傳變異頻率有較大差異。本實驗結(jié)果對于理解不同基因型玉米在組織培養(yǎng)并誘導再生過程中表現(xiàn)出來的巨大差異有很大幫助。

    參考文獻

    [1] Larkin P J, Scowcroft W R. Somaclonal variation - a novel source of variability from cell cultures for plant improvement[J]. Theo Appl Genet,1981, 60:443-455.

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    [3] Bouman H, De Klerk GJ.Somaclonal variation. In: Geneve RL, Preece SE and Merkle SA (eds) Biotechnology of ornamental plants[M]. CAB Int, Wallingford, UK, 1997,165-189.

    [4] 肖輝海, 陳良碧. 植物體細胞無性系變異育種[J], 湖南文理學院學報(自然科學版), 2003,15(04):40-46.

    [5] 刁現(xiàn)民, 孫敬三. 植物體細胞無性系變異的細胞學和分子生物學的發(fā)展. 植物學通報[J], 1999, 16(04):372~377.

    [6] Moller E., et al., A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi, fruit bodies, and infected plant tissues. Nucleic Acids Research, 1992. 20(22): p. 6115.

    [7] 羅洋. 肥料和密度對玉米生長發(fā)育及DNA甲基化的影響[D]. 哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學, 2014.

    作者簡介:于曉明,吉林農(nóng)業(yè)科技學院,講師,研究方向:遺傳學與基因工程。

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