我國北美紅杉組織培養(yǎng)研究進展

尹麗莎　辛雅萱　李斌等

摘要：北關(guān)紅杉主要分布于我國華東、西南地區(qū)，是一種速生珍貴大徑級用材樹種和木材工業(yè)原料。從北美紅杉外植體的選擇、消毒、腋芽的誘導、增殖培養(yǎng)以及生根、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)使用等方面，闡述了我國紅杉組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進展，以期為促進北美紅杉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供參考。

關(guān)鍵詞：北美紅杉；組織培養(yǎng)；研究進展

植物組織（離體）培養(yǎng)是指利用植物離體器官（如根、莖、葉、莖尖、花、果實）或者植物組織（如分生組織、表皮組織、薄壁組織等）為培養(yǎng)對象，通過對材料誘導，使其產(chǎn)生愈傷組織或者芽等植物器官，進一步發(fā)育成完整植株的技術(shù)。植物體的每一個具有完整細胞核的細胞（不管性細胞還是體細胞）都含有該物種的全部遺傳信息，在適合的光照、溫度和一定的營養(yǎng)物質(zhì)與激素等條件下，愈傷組織便開始分化，產(chǎn)生出植物的各種器官和組織，進而發(fā)育成1棵完整的植株。

植物離體快速繁殖不僅保持了常規(guī)營養(yǎng)繁殖的全部優(yōu)點，還獨具以下優(yōu)點：首先，遺傳基礎(chǔ)一致，能保持母體優(yōu)良性狀，可以一次性獲得大量基因型相同、表現(xiàn)型一致的植株。其次，利用組織培養(yǎng)法進行繁殖周期短、繁殖快，節(jié)省空間，繁殖系數(shù)高。離體下的培養(yǎng)，擴繁倍數(shù)的提高，有利于縮短一個新品種的選育到推廣所需的時間。例如：利用植物某一個極微的組織或器官進行離體培養(yǎng)，在短時間內(nèi)就能產(chǎn)生數(shù)百萬以上植株，如此快的繁殖速度是其他傳統(tǒng)無性繁殖方法所不能比擬的。由于在人工控制條件下進行，根據(jù)不同植物、不同離體部位的要求提供不同的培養(yǎng)條件，不受地區(qū)和氣候的影響，無季節(jié)之分，能進行周年生產(chǎn)。最后，通過組織培養(yǎng)可以獲得無毒苗木無性系。無毒苗有利于恢復原品種的性能和增加產(chǎn)量等。由于植物栽培過程中易感染病毒，從而導致生產(chǎn)力降低、品種退化，嚴重時導致植株死亡，對生產(chǎn)者造成難以估量的損失。利用植物脫毒技術(shù)可去除植物病毒，從而恢復植株原有種性，這是其他營養(yǎng)繁殖所不能達到的。

北美紅杉（Sequoia sempervirens Endll）又稱美國紅杉，起源于美國加利福尼亞州，現(xiàn)廣泛分布于我國華東、西南各省，其適應性強，在各引種點都能較好地生長，廣泛應用于造林、城市綠化，是我國華東、西南地區(qū)的重要速生用材樹種。紅杉生長神速、木材材積量高、分布廣阻捌，木材材質(zhì)韌性好、結(jié)構(gòu)均勻，紋理清晰、易于加工、可用于家具、建筑、紙漿等用材，具有廣泛的市場發(fā)展前景。紅杉的繁殖方式以傳統(tǒng)的種子播種繁育為主，此方式成本高，耗時耗力，且出苗質(zhì)量不高，高矮不一致，分化現(xiàn)象嚴重。當代生物技術(shù)不僅能有效地克服傳統(tǒng)育苗的不足，而且培育出的苗木具有母本的優(yōu)良特征，是取得優(yōu)質(zhì)壯苗的有效方法。

1外植體選擇

植物組織培養(yǎng)中作為離體培養(yǎng)材料的器官或組織的片段，如莖尖、莖段、皮層及維管組織、髓細胞、表皮、塊莖的貯藏薄壁細胞、花瓣、根、葉、子葉、鱗莖、胚珠和花藥等為材料，稱為外植體。外植體的選取是否恰當對植物組織離體快繁起著至關(guān)重要的作用。

1.1取材部位

由于植物細胞具有全能性，因此任何組織或器官在條件適應的情況下均可再生成完整植株。但不同種類的植物以及同一植物的不同器官對外界誘導的條件反應敏感程度是不同的。取材時應考慮外材再生能力強、遺傳穩(wěn)定性好、來源豐富、容易滅菌等方面，對于大多數(shù)植物來說，莖尖是最佳的外材，其形態(tài)已基本建成，生長速度快，遺傳性穩(wěn)定，是獲得無病毒苗的重要途徑。通常年幼組織比年老組織有較高的形態(tài)發(fā)生能力，容易培養(yǎng)，有較大的再生能力。

1.2取材時間

一般選擇植株生長旺季取材，若在生長衰老期或已進入休眠期取樣，則外植體可能對誘導反應遲鈍或無反應，連續(xù)晴朗天氣取材，避免陰雨天。材料太大，易污染；材料太小，難于成活；材料大小適中，一般為2～3cm。

2外植體的消毒

植物組織培養(yǎng)能否順利進行，取決于外植體的滅菌、消毒環(huán)節(jié)。不同取材部位對滅菌劑的種類、濃度以及處理時間長短有所不同，因此視材料敏感情況而定。在北美紅杉組培試驗研究中，最常用的消毒試劑是升汞。首先，把取回來的樣放在流水下沖洗30min以上，可酌量加入洗滌劑；其次，剪下所需材料用75%的無水乙醇噴灑植株表面2～3s，倒入0.1%升汞溶液處理20min；最后，用無菌水涮洗4～5次，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基，該消毒方法效果顯著，污染率5%，出苗率90%。常見的消毒劑有次氯酸鈉、次氯酸鈣、漂白粉、氯化汞、酒精、過氧化氫、溴水、硝酸銀、抗菌素等。外植體的消毒是整個組培試驗中的重中之重，消毒是否徹底關(guān)系到后續(xù)的進行，不同來源及不同老化程度的外植體對消毒試劑的選擇不同。

3離體培養(yǎng)技術(shù)

培養(yǎng)基的篩選是組織培養(yǎng)的必經(jīng)過程。培養(yǎng)基不僅為外植體創(chuàng)造內(nèi)部小環(huán)境，而且為植物提供基本營養(yǎng)物質(zhì)。培養(yǎng)基的選擇不同以及所加入植物激素種類及濃度不同，對外植體腋芽啟動、增殖、分化培養(yǎng)及壯苗生根產(chǎn)生的效果不同。在快繁過程中，人們應根據(jù)不同的需求來選擇不同培養(yǎng)基種類、激素濃度。

3.1腋芽誘導

在紅杉組培快繁試驗中，利用莖段為外植體獲取芽是最快最直接最有效的途徑之一。紅杉誘導芽比較容易，對植物激素的選擇不專一。同一激素不同濃度以及同一濃度不同激素種類的搭配使用對芽的誘導生長有不同的影響。在紅杉腋芽誘導過程中，MS為常用的培養(yǎng)基，6-BA和KT為主要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，6-BA、KT均能促進培養(yǎng)體上不定芽的分化和形成，在基本培養(yǎng)基上單獨使用1.0～2.0mg/L的6-BA可成功誘導新生芽發(fā)生；將6-BA與KT配合使用則需適當降低6-BA的使用濃度，且KT濃度應以較低（0.5～1.5mg，L）為宜。另外，不同的季節(jié)取材對不定芽的誘導也具有一定影響。

3.2繼代增殖培養(yǎng)

北美紅杉增殖培養(yǎng)中，出苗率、出苗質(zhì)量、繁殖系數(shù)的高低直接影響到組織培養(yǎng)的經(jīng)濟效益，因此篩選增殖培養(yǎng)基顯得十分重要。6-BA、KT和NAA是北美紅杉增殖培養(yǎng)中常用的植物生長調(diào)節(jié)劑。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，附加0.05～0.15mg/L6-BA、0.05～0.1mg/LKT和0.1～0.2mg/LNAA的MS培養(yǎng)基均可滿足北美紅杉不同種源、不同無性系的增殖培養(yǎng)。通過對3個優(yōu)良無性系品種進行增殖培養(yǎng)研究，進一步證明了MS+0.15mg/L6-BA+0.1 mg/LKT+0.1 mg/LNAA具有較好的增殖效果。在紅杉增殖培養(yǎng)中，除NAA外，將生長調(diào)節(jié)物質(zhì)IBA、2，4-D和Zt配合使用，也具有較好的增殖效果。本實驗中利用莖段不帶芽為起始外植體采用MS+6-BA2.0mg/L+KT2.0mg/L進行分化培養(yǎng)，成功地誘導愈傷組織出芽，該研究發(fā)現(xiàn)1/2MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L也比較適合紅杉不定芽的增殖培養(yǎng)。

3.3生根與壯苗

根據(jù)研究表明，添加0.4～2.5mg/LNAA（萘乙酸）和2.0～3.5mg/LIBA（吲哚丁酸）可誘導北美紅杉生根，根的誘導與芽相比較困難，還有待進一步的研究。利用紅杉徒長枝幼苗生根培養(yǎng)45d后，發(fā)現(xiàn)1/4MS培養(yǎng)基中芽的基部首先有乳白色的小根長出，隨后在其他不同無機鹽濃度培養(yǎng)基中陸續(xù)也有根長出。2個月后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，紅杉生根明顯受無機鹽濃度的影響，生根率順序為：I/4MS>1/2MS>MS，其中發(fā)現(xiàn)1/4MS培養(yǎng)基中生根數(shù)量較多，顏色鮮嫩。1/2MS培養(yǎng)基中根系相對較長，但苗的生長情況不好，基部出現(xiàn)少量的愈傷、莖稈出現(xiàn)枯黃現(xiàn)象。MS培養(yǎng)基生根率較低，基部愈傷較嚴重且枯頂、枯黃現(xiàn)象較嚴重。結(jié)果表明，不同無機鹽濃度培養(yǎng)基，不僅影響根的分化而且影響植株的健康生長狀況?；蛐鸵仓萍s著根系的形成，不同無性系間根的誘導也明顯存在不同的差異。外植體的選擇對生根的影響也很重要，由于不同的取材部位其內(nèi)源抑制物的積累不同，制約著植物生長素的吸收。

壯苗與生根對后期的移栽、煉苗以及提高苗木質(zhì)量十分關(guān)鍵，而影響生根的因素較多，生根環(huán)節(jié)是紅杉組織培養(yǎng)中的難點，雖然前人已在生根方面做了大量的研究，但由于不同無性系間基因型不同，外植體的內(nèi)源抑制物的積累不同等原因，至今尚未研究出最佳生根配方，因此仍需進一步的研究。

4問題與展望

（1）目前北美紅杉組織培養(yǎng)技術(shù)已在我國取得了良好的進展，且在一些省份已建立了紅杉組織培養(yǎng)體系并用于生產(chǎn)化。但由于紅杉不是我國特有的樹種，在取材上范圍過于局限，不具有代表陛。因此在今后的研究中，應大量引種栽培，對全國范圍不同地區(qū)不同優(yōu)良無性系間取材進行離體培養(yǎng)，建立具有穩(wěn)定性高、更具廣譜性的紅杉快繁體系。

（2）紅杉外植體的消毒、滅菌還需進一步的研究。在滅菌劑的種類、濃度以及處理時間上相關(guān)研究報道較少。目前較常用的是采用75%的乙醇和0.1%升汞二步法滅菌。研究發(fā)現(xiàn)，乙醇的處理時間對莖段腋芽的誘導起著至關(guān)重要作用。在紅杉組織培養(yǎng)中，腋芽的誘導是獲取不定芽的主要途徑，目前在滅菌劑種類選擇上單一，因此應加大滅菌技術(shù)方面的研究。

（3）在紅杉增殖培養(yǎng)過程中，出現(xiàn)枯頂現(xiàn)象影響著組織培養(yǎng)的后續(xù)進行。目前紅杉枯頂現(xiàn)象尚未解決，有關(guān)報道較少見。