UPLC-MS/MS法檢測(cè)潔白制劑中沉香的使用情況

武嘉庚，楊鳳梅，張 煒，范瑩瑩

0 引言

“潔白”系列品種分為丸劑和膠囊劑2種劑型，皆為生粉入藥，其中水丸規(guī)格為0.8 g/丸，薄膜衣丸規(guī)格為0.8 g/4丸，膠囊劑規(guī)格為0.4 g/粒。潔白膠囊(丸)系治療消化道疾病的經(jīng)典驗(yàn)方，因其療效確切，應(yīng)用于藏醫(yī)臨床有近千年的歷史，2種劑型處方一致，皆由訶子(煨)、寒水石、翼首草、五靈脂膏、土木香、石榴子、木瓜、沉香、丁香、石灰華、紅花、肉豆蔻、草豆蔻、草果仁等14味中、藏藥材組成。主要功效為健脾和胃，止痛止吐，分清泌濁。用于胸腹脹滿、胃脘疼痛、消化不良、嘔逆泄瀉、小便不利等癥。沉香在方中雖然用量不大，卻是潔白膠囊(丸)中重要的一味藥[1]。

沉香為瑞香科植物白木香Aquilariasinensis(Lour.)Gilg含有樹脂的木材，功能為行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘。沉香主治胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急[2-3]。其價(jià)格近年來逐步攀升。不少企業(yè)為了追求利潤(rùn)，不惜以次充好，有意無意使用劣質(zhì)沉香。筆者經(jīng)過前期調(diào)研和考查藏族用藥習(xí)慣，發(fā)現(xiàn)部分藏藥企業(yè)在生產(chǎn)過程中以山沉香代替沉香入藥，鑒于目前約有數(shù)百種中成藥需要沉香進(jìn)行復(fù)方配伍，這一情況嚴(yán)重影響了成藥的療效[4-7]。

《中國(guó)藥典》2015年版一部收載的潔白丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第二十冊(cè))WS3-175(Z-165)-98(Z)和《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn) 第十五冊(cè))WS3-175(X-165)-97(Z)收載的潔白膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均無沉香藥材質(zhì)量控制手段。在前期實(shí)驗(yàn)中，筆者使用HPLC法測(cè)定沉香四醇含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)陰性制劑在沉香四醇色譜峰處有干擾，為了控制潔白膠囊(丸)中沉香質(zhì)量，對(duì)廠家的沉香投料情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，我們建立了UPLC-MS/MS測(cè)定潔白膠囊(丸)中沉香四醇的方法，以檢測(cè)潔白膠囊(丸)中沉香的使用情況[8]。

1 儀器與材料

THERMO TSQ QUANTUM ULTRA液質(zhì)聯(lián)用儀。電子天平(Sartrious BSA 224S-CW,德國(guó)Sartrious公司);超聲波清洗器(KQ5200B，昆山市超聲儀器有限公司);沉香四醇對(duì)照品(購自中檢院，批號(hào):16032214，純度99.96%);乙腈為色譜純，水為超純水;其他試劑均為分析純;沉香、山沉香、訶子(煨)、寒水石、翼首草、五靈脂膏、土木香、石榴子、木瓜、沉香、丁香、石灰華、紅花、肉豆蔻、草豆蔻、草果仁等藥材購自亳州康美中藥城，經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院楊鳳梅主任鑒定為正品;潔白膠囊(丸)均為市售樣品，涉及4家企業(yè)，共50個(gè)批次。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Zorbax Eclipse Pluse C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm);以乙腈-0.1%甲酸溶液(75∶25)為流動(dòng)相;等度洗脫;體積流量：0.3 ml/min;柱溫:40 ℃，進(jìn)樣量2 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI±)，離子源溫度:350 ℃;毛細(xì)管溫度:270 ℃;鞘氣流速:10 L/min;輔助氣流速:5 L/min;毛細(xì)管電壓:3 600 V;透鏡補(bǔ)償電壓 55 V;掃描模式為質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，具體參數(shù)設(shè)置見表1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沉香四醇對(duì)照品0.013 2 g，置200 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，取對(duì)照品溶液4 ml，置50 ml量瓶中，加乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得，按純度99.96%計(jì)，每1 ml約含沉香四醇5.28 μg。

2.3.2 供試品溶液的制備 潔白膠囊(丸)供試品溶液的制備方法一致，皆為取潔白膠囊(丸)樣品(過三號(hào)篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇20 ml，稱定重量，浸泡0.5 h，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)1 h，放冷，再稱定重量，用乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液，用微孔濾膜(0.26 μm)濾過，即得。

2.3.3 陰性及陽性溶液的制備 取按潔白膠囊(丸)的處方比例除去沉香制成陰性樣品，依照“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，模擬制成沉香陰性對(duì)照溶液。取原料藥材，按處方、工藝制得潔白膠囊(丸)陽性樣品，同“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液制備法制成陽性溶液。

2.3.4 山沉香藥材溶液的制備 取山沉香藥材(過三號(hào)篩)約2 g，精密稱定，依照“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，制成山沉香藥材溶液。

2.3.5 測(cè)定條件 分別精密吸取上述5種溶液各2 μl，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。色譜圖見圖1。由測(cè)定結(jié)果得知，沉香對(duì)照藥材及陽性樣品溶液分別僅檢測(cè)出與沉香四醇對(duì)照品保留時(shí)間相同的MRM選擇離子峰，子離子豐度比基本一致。山沉香藥材溶液和陰性樣品圖譜中未出現(xiàn)與沉香四醇對(duì)照品一致的離子峰，可見陰性在此位置上無干擾。

2.4 沉香四醇方法學(xué)考察

2.4.1 穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性 取“2.3.1”項(xiàng)下沉香四醇對(duì)照品溶液(5.28 μg/ml)，連續(xù)進(jìn)樣6次并記錄峰面積。結(jié)果顯示，沉香四醇峰面積RSD為0.25%(n=6)，表明儀器的精密度良好;取“2.3.2”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào):21141)，室溫放置2、3、8、12、18、20 h時(shí)進(jìn)樣并記錄峰面積，結(jié)果顯示，沉香四醇的峰面積RSD為0.65%，表明樣品在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定;取供試品適量(批號(hào):21141)，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備6份平行樣品，分別進(jìn)樣并記錄峰面積，結(jié)果顯示，沉香四醇峰面積的RSD為0.58%，表明此方法重復(fù)性良好，見表2。

表1 沉香四醇含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)譜庫信息

圖1 對(duì)照品及樣品HPLC-MS/MS 分析圖

2.4.2 加標(biāo)回收率 取已知含量樣品(批號(hào):21141)2 g，共6份，分別加入一定量的沉香四醇對(duì)照品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4.3 線性關(guān)系考察 將沉香四醇用乙醇稀釋制成不同濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以沉香四醇質(zhì)量濃度(X，μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=526.35 X+71.79(r=0.999 8)。結(jié)果表明，沉香四醇檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍為0.52～151 μg/ml。

2.4.4 定量限考察 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品，采用逐漸稀釋對(duì)照品溶液的方法來確定定量限，結(jié)果表明，沉香四醇的定量限為0.50 ng/ml，證明此方法具有較好的靈敏度。

2.4.5 定量限考察 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對(duì)照品，采用逐漸稀釋對(duì)照品溶液的方法來確定定量限，結(jié)果表明，沉香四醇的定量限為0.50 ng/ml，證明此方法具有較好的靈敏度，供試品溶液(潔白膠囊，批號(hào):21154)色譜圖見圖2。

圖2 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下潔白膠囊(批號(hào):21154)中沉香四醇UPLC-MS/MS色譜圖

2.5 樣品中沉香四醇含量測(cè)定 取50批樣品各適量，分別按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表4。

表4 潔白膠囊(丸)中沉香四醇含量測(cè)定(n=50)

3 結(jié)論

沉香作為藥物記載最早見于《名醫(yī)別錄》[9]，并列為上品，其中記載:“沉香、薰陸香、雞舌香、藿香、詹糖香、楓香并微溫。療風(fēng)水毒腫，去惡氣”[10]。《本草綱目》[11]對(duì)沉香的功效應(yīng)用也有全面的記載，《中國(guó)藥典》2015年版收載的沉香功效為行氣止痛，溫中止嘔，納氣平喘，主治胸腹脹悶疼痛，胃寒嘔吐呃逆，腎虛氣逆喘急，沉香在潔白膠囊(丸)處方中雖然用量不大，卻是重要的一味藥。

潔白膠囊(丸)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中尚無對(duì)沉香的檢驗(yàn)項(xiàng)目，不少企業(yè)以次充好，使用劣質(zhì)沉香或以山沉香代替沉香投料，直接影響了潔白膠囊(丸)的藥效和臨床療效。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同廠家潔白膠囊(丸)中沉香四醇含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同企業(yè)、相同企業(yè)不同批號(hào)間沉香四醇含量差異較大，提示沉香藥材質(zhì)量不穩(wěn)定;某企業(yè)潔白膠囊中沉香四醇的含量相對(duì)偏低，提示沉香藥材質(zhì)量較差;三批潔白丸中未檢出沉香四醇，結(jié)合對(duì)企業(yè)的前期調(diào)研，提示可能存在用山沉香替代沉香投料的情況。該方法選擇性強(qiáng)，靈敏度高，可用于測(cè)定潔白膠囊(丸)中沉香四醇含量，檢測(cè)潔白膠囊(丸)中沉香使用情況，確保潔白膠囊(丸)質(zhì)量可控。