大孔吸附樹脂純化大黃中游離蒽醌的工藝

李鳳　劉蕓蕓　李愛峰　孫愛玲　柳仁民

摘要：擬研究大孔吸附樹脂純化大黃中游離蒽醌的最佳工藝。先以大黃中總游離蒽醌和苯乙烯酸的靜態(tài)吸附率和解吸率為指標(biāo)，對6種不同型號的大孔吸附樹脂進行篩選，然后通過靜態(tài)和動態(tài)吸附解吸試驗優(yōu)化純化工藝。結(jié)果表明，HPD-400型大孔吸附樹脂對大黃中游離蒽醌和苯乙烯酸的吸附與解吸性能較好，且其吸附等溫線方程較符合Langmuir模型;確定最佳吸附條件如下：pH值4.5，上樣液濃度4 mg/mL，最大上樣量7 BV;最佳洗脫條件如下：先用70 BV的0.2 mol/L NaHCO3溶液從大黃中分離出苯乙烯酸及雜質(zhì)，再用15 BV的95%乙醇洗脫游離蒽醌;總游離蒽醌純度由41.17%提高到了82.60%。HPD-400型大孔吸附樹脂可以有效純化大黃游離蒽醌。

關(guān)鍵詞：大黃;游離蒽醌;大孔吸附樹脂;純化;Langmuir模型

中圖分類號： R284.2文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0203-06

收稿日期：2018-07-10

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：21675071）;山東省重點研發(fā)計劃（編號：2016GSF202007）。

作者簡介：李 鳳（1990—），女，山東菏澤人，碩士研究生，主要從事藥物分離與分析研究。E-mail：lifeng8129@163.com。

通信作者：柳仁民，博士，教授，主要從事藥物分離與分析研究。E-mail：renminliu@126.com。

大黃（Radix et Rhizoma Rhei）為臨床常用的傳統(tǒng)中藥，具有清熱退火、活血化瘀、減肥降脂等功效[1-2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃具有保肝、利膽、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功能[3]。大黃的主要藥用成分為蒽醌類衍生物，分為游離型蒽醌和結(jié)合型蒽醌，游離型蒽醌主要有大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚[4-5];結(jié)合型蒽醌有番瀉苷A、B、C、D及大黃酸-8-葡萄糖苷、大黃素葡萄糖苷等[4-5]。

近年來，大孔吸附樹脂的應(yīng)用越來越廣泛，尤其是在天然產(chǎn)物有效成分分離方面，它具有分離純化效果優(yōu)良的應(yīng)用特點[6-8]。目前，國內(nèi)利用大孔吸附樹脂對大黃成分的研究主要集中在對總蒽醌的純化，方法是使用大孔吸附樹脂以不同濃度的乙醇進行洗脫[9-10]，但以大孔吸附樹脂用NaHCO3除去大黃中的苯乙烯酸和雜質(zhì)進而純化蒽醌類化合物的研究尚未見報道。本研究采用無水乙醚和20%硫酸水溶液混合液（體積比1 ∶5）回流提取，以HPD-400型大孔吸附樹脂使用NaHCO3溶液就可以將雜質(zhì)以及苯乙烯酸分離出來，然后用95%乙醇純化得到高純度的總蒽醌類化合物。采用高效液相色譜法同時測定其中的苯乙烯酸和5種蒽醌類物質(zhì)的峰面積，從而對其進行定量分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

粗提物制備及大孔吸附樹脂分離純化所用的溶劑均為分析純，購自煙臺遠東精細(xì)化工有限公司;所用試劑NaHCO3、Na2CO3、NaOH為分析純，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;HPLC（高效液相色譜法）分析用的甲醇為色譜純，購自美國TEDIA試劑公司;試驗用水為娃哈哈純凈水。ADS-7型、HPD-500型、HPD-826型、HPD-400型、HPD-100型和AB-8型大孔吸附樹脂，購自滄州恩寶化工有限公司。大黃藥材購于聊城利民大藥店總店，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為正品藥材。

1.2 試驗儀器

Thermo UitiMate 3000高效液相色譜儀，美國戴安公司;色譜柱SPHERIGEL ODS C18（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），大連江申分離科學(xué)技術(shù)公司;RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;THZ-82水浴恒溫振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司。

1.3 分析方法

采用高效液相色譜儀測定目標(biāo)成分的峰面積進行定量分析（成分的峰面積與濃度呈線性關(guān)系）。SPHERIGEL ODS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm ID，5 μm），流動相使用甲醇-水（含0.1%磷酸）梯度洗脫（甲醇0～30 min，65%～85%;30～50 min，85%～95%），流速為1.0 mL/min，檢測波長為 254 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為15 μL。

1.4 大黃提取物溶液的制備

稱取約200 g大黃藥材，經(jīng)高速藥物粉碎機粉碎至約40目，采用無水乙醚和20%硫酸水溶液混合液（體積比1 ∶5）回流提取3次，每次1.5 h，料液比為1 g ∶6 mL，合并乙醚回流提取液，濃縮得浸膏，冷藏備用。

1.5 大孔吸附樹脂型號的篩選

1.5.1 大孔樹脂的預(yù)處理

新購的大孔樹脂用95%乙醇浸泡24 h，裝玻璃層析柱。先用乙醇洗脫至洗脫液加水不出現(xiàn)混濁，接著用去離子水洗至洗脫液無乙醇味，備用。

1.5.2 靜態(tài)吸附解吸性能的比較

因為成分的峰面積與濃度呈線性關(guān)系，因此對6個目標(biāo)成分的峰面積進行定量分析。大孔樹脂吸附率和解吸率的計算公式如下：

吸附率=（原液的總峰面積-吸附后藥液的總峰面積）/原液的總峰面積×100%;（1）

解吸率=解吸后藥液的總峰面積/（原液的總峰面積-吸附后藥液的總峰面積）×100%。（2）

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的6種型號的大孔樹脂：ADS-7型、HPD-500型、HPD-826型、HPD-400型、HPD-100型和AB-8型各5 g，分別裝入100 mL具塞磨口三角瓶中，各加入相同濃度的大黃提取物溶液50 mL。置于水浴恒溫振蕩器上，30 ℃恒溫振蕩12 h，分別取吸附后的溶液，用高效液相色譜儀檢測。經(jīng)計算得到各樹脂對6個目標(biāo)成分的吸附量和吸附率。分別取上述吸附飽和的樹脂，各加入95%乙醇 50 mL，用與吸附試驗同樣的條件進行解吸12 h。解吸完全后，取解吸液用高效液相色譜儀檢測。經(jīng)計算得到各樹脂對6個目標(biāo)成分的解吸率。

1.6 靜態(tài)吸附解吸工藝的考察

1.6.1 靜態(tài)吸附pH值的考察

準(zhǔn)確稱取7份預(yù)處理過的HPD-400型大孔樹脂各5 g，分別加入含藥量相同的pH值分別為1、3、4.5、6.5、8.5、10.5、11.5的溶液50 mL進行靜態(tài)吸附。

1.6.2 吸附動力學(xué)的考察

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理過的HPD-400型大孔樹脂10 g，加入大黃提取物溶液100 mL，按在“1.6.1”節(jié)中確立的最佳pH值下進行靜態(tài)吸附，每隔30 min取樣1 mL，用HPLC進行分析檢測。

1.6.3 吸附等溫線的考察

取濃度分別為0.25、0.30、0.35、0.40、0.50、0.60 g/mL的大黃提取物溶液各20 mL，各加入1 g HPD-400樹脂，分別置于25、35、45 ℃恒溫?fù)u床上振搖進行靜態(tài)吸附至飽和，測其吸附量，繪制吸附等溫線。為進一步了解樹脂對大黃中目標(biāo)成分的吸附，選擇2種標(biāo)準(zhǔn)理論模型（Langmuir和Freundlich模型[11]），對25 ℃時的吸附等溫線進行擬合，來探討25 ℃下樹脂與大黃蒽醌的吸附行為。Langmuir吸附等溫線模型，假定吸附劑的孔隙表面是均勻的，并且吸附分子之間的相互作用力可忽略不計，它適用于單分子層吸附[11];Freundlich模型，假設(shè)表面具有吸附熱不均勻分布的異質(zhì)表面，用于描述單分子層以及多分子層的吸附行為[11]。2種吸附等溫線模型的公式如下：

式中：qe為平衡吸附量，g/g;Ce為平衡濃度，g/mL;qm為最大吸附量，g/g;KL為Langmuir吸附平衡常數(shù)，L/g;Kf為Freundlich系數(shù)，L/g;n為表觀常數(shù)。

1.6.4 純化溶劑的考察

取18 g樹脂置于60 mL大黃提取物溶液中，在“1.6.3”節(jié)中確立的最優(yōu)吸附溫度下靜態(tài)吸附至飽和（其余吸附條件同“1.6.3”節(jié)），從中取3份吸附飽和的樹脂各5 g，分別加入60 mL、0.2 mol/L NaHCO3、Na2CO3、NaOH溶液進行靜態(tài)解吸，在1 min、5 min、10 min、30 min、1 h、2 h各取1 mL溶液，調(diào)節(jié)pH值至中性后用甲醇定容，用HPLC進行檢測。

1.7 動態(tài)吸附及洗脫行為的考察

1.7.1 上樣液濃度的考察

取3份20 g預(yù)處理過的HPD-400樹脂分別裝柱（30 cm×1.7 cm），分別加入含藥量為3、4、5 mg/mL的大黃提取物溶液，調(diào)節(jié)流速為1 mL/min，分別收集流出液，以1/2個柱體積作為1個流份，收集至流出液中各目標(biāo)成分含量不再變化。分別經(jīng)HPLC測定各流份中苯乙烯酸和5種蒽醌類物質(zhì)的峰面積。繪制HPD-400型樹脂在不同濃度下的動態(tài)吸附曲線。

1.7.2 泄漏曲線的考察

準(zhǔn)確稱取20 g預(yù)處理過的HPD-400樹脂裝柱（30 cm×1.7 cm），加入含藥量為4 mg/mL的大黃提取物溶液，調(diào)節(jié)流速為1 mL/min，收集流出液，以1/2個柱體積作為1個流份，收集至流出液中6個目標(biāo)成分含量不再變化。

1.7.3 洗脫劑用量的考察

取HPD-400樹脂按“1.7.2”節(jié)確立的吸附條件進行上柱吸附至飽和。使用0.2 mol/L NaHCO3溶液動態(tài)洗脫苯乙烯酸及雜質(zhì)，收集流出液，直到流出液中幾乎不含有苯乙烯酸。再用95%乙醇動態(tài)洗脫蒽醌類物質(zhì)，收集流出液，直到5種蒽醌類物質(zhì)被洗脫完全。

1.8 驗證試驗

準(zhǔn)確稱取20 g預(yù)處理的HPD-400樹脂，裝柱（30 cm×1.7 cm），在各項優(yōu)選條件下進行試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

如圖1所示，采用“1.3”節(jié)確立的HPLC條件，各成分分離良好，主要得到6個目標(biāo)成分。由前人研究結(jié)果可知，峰1至峰6分別是苯乙烯酸、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、大黃素，其中峰2至峰6為蒽醌類物質(zhì)[12-13]。

2.2 大孔吸附樹脂型號的篩選

由表1可知，HPD-400型、HPD-100型和AB-8型樹脂的靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸率均高于其他3種樹脂。其中 HPD-400型樹脂靜態(tài)吸附率最高，且HPD-400型樹脂對目標(biāo)成分的靜態(tài)解吸率也在65%以上。因此，選擇HPD-400型樹脂純化大黃中的游離蒽醌。

2.3 靜態(tài)吸附解吸工藝的考察

2.3.1 靜態(tài)吸附pH值的考察

從圖2中可以看出，在pH值為4.5時，6個目標(biāo)成分的吸附率均達到了最高值，之后呈現(xiàn)下降趨勢，主要原因是蒽醌類物質(zhì)大多含有酚羥基因而呈現(xiàn)一定的酸性，在弱酸性條件下游離蒽醌容易被HPD-400型樹脂吸附，而在堿性條件下游離蒽醌則易發(fā)生分解及氧化，故不易被HPD-400型樹脂吸附。因此，確立HPD-400型樹脂靜態(tài)吸附的pH值為4.5。

2.3.2 吸附動力學(xué)的考察

由圖3可知，初始階段吸附量增長幅度大，隨著時間的延長，吸附量增長幅度變得緩慢，在3 h以后樹脂吸附達到平衡，吸附量基本保持不變。因此，吸附時間確定為3 h。

2.3.3 吸附等溫線的考察

由圖4可知，隨著大黃提取物溶液濃度的增加，吸附量先迅速增加，然后增長幅度越來越緩慢。同時可以看出，隨著溫度的升高，樹脂的吸附量降低?？赡艿慕忉屖牵瑯渲瑢Υ簏S蒽醌的吸附過程是放熱的，溫度的升高不利于吸附。由表2可知，Langmuir吸附等溫線模型擬合的r2（0.971 3～0.998 7）大于用Freundlich模型擬合的 r2（0.862 2～0.950 6）。因此，Langmuir吸附等溫線模型能更好地描述HPD-400型大孔樹脂對大黃蒽醌的吸附作用。

2.3.4 純化溶劑的考察

如圖5所示，與使用Na2CO3、NaOH溶液相比，使用NaHCO3溶液只有苯乙烯酸被解吸出來，蒽醌類化合物完全沒有被解吸出來。因此，使用 0.2 mol/L NaHCO3作為純化蒽醌類物質(zhì)的溶劑，能夠使苯乙烯酸與蒽醌類物質(zhì)分離，從而提高蒽醌類物質(zhì)的純度。

2.4 動態(tài)吸附及洗脫行為的考察

2.4.1 上樣液濃度的考察

從圖6可以看出，隨著大黃提取物溶液濃度的增加，大黃中6個目標(biāo)成分對HPD-400樹脂的穿透點提前，即達到飽和吸附量的吸附時間減少;吸附速率隨著溶液濃度的增加而增加。但是如果濃度太大，會造成傳質(zhì)阻力增加，上樣困難，為提高效率最終選擇4 mg/mL上樣濃度。

2.4.2 泄露曲線的考察

從圖7可以看出，在4 BV時出現(xiàn)了少量的6個目標(biāo)成分，到7～8 BV時，達到泄漏點，即達到平衡濃度時的1/10，16 BV時，HPD-400樹脂對目標(biāo)成分的吸附達到飽和。因此，確定上樣量為7 BV的樣品液。

2.4.3 洗脫劑用量的考察

由圖8-a可知，70 BV的 0.2 mol/L NaHCO3溶液可以將大黃中的苯乙烯酸完全洗脫下來。由圖8-b可知，當(dāng)用95%乙醇洗脫到3 BV時，大黃中總游離蒽醌洗脫量最大;當(dāng)用95%乙醇洗脫到[KG*5]15[KG*3]BV[KG*5]時，

HPD-400樹脂將大黃總游離蒽醌基本洗脫完全。因此，選擇70 BV的0.2 mol/L NaHCO3溶液洗脫大黃中的苯乙烯酸和雜質(zhì)，選擇15 BV的95%乙醇洗脫大黃中的總游離蒽醌。

2.5 驗證試驗

稱取20 g預(yù)處理好的HPD-400型大孔吸附樹脂裝柱，量取7 BV濃度為4 mg/mL的大黃提取物溶液（pH值為4.5左右）上樣，吸附飽和后，先用70 BV的0.2 mol/L NaHCO3溶液洗脫并收集洗脫液，再用15 BV的95%乙醇洗脫并收集洗脫液，然后用高效液相色譜儀檢測（圖9），采用HPLC面積歸一化法計算95%乙醇洗脫部分的游離蒽醌的純度。由圖9可知，本驗證試驗較好地實現(xiàn)了苯乙烯酸與大黃中總游離蒽醌的分離， 提高了總游離蒽醌的純度，其純度由41.17%提高到了82.60%。

3 結(jié)論

本研究通過對大孔樹脂分離純化的主要工藝參數(shù)進行考察，確立了最佳工藝，并對優(yōu)選工藝進行了驗證試驗，結(jié)果表明，選擇的最佳工藝達到了純化大黃中游離蒽醌類物質(zhì)的目的，總游離蒽醌類物質(zhì)的純度由41.17%提高到了82.60%。使用本試驗確立的分離純化方法，只需2步洗脫就可以純化大黃中的總游離蒽醌。第1步洗脫使用NaHCO3溶液作為洗脫劑，只有苯乙烯酸被洗脫出來，蒽醌類化合物完全沒有被洗脫出來，第2步使用15 BV的95%乙醇洗脫游離蒽醌，避免了大黃游離蒽醌不必要的損失，與依次使用不同濃度的乙醇進行洗脫來純化總游離蒽醌相比，洗脫步驟更加便捷，且方法操作簡單、重復(fù)性好、純化效果優(yōu)良。本試驗確立的純化方法可以為進一步研究大黃中的成分提供參考。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：282.

[2]童婷婷，譚玉柱，趙高瓊，等. 大孔樹脂純化大黃地上部位總蒽醌的工藝研究[J]. 中成藥，2013，35（4）：848-852.

[3]葉殷殷，曾元兒，曹 騁，等. 不同型號大孔樹脂分離大黃蒽醌類成分的研究[J]. 中成藥，2011，33（1）：168-170.

[4]劉月紅，黃政海，董 玲，等. 高效液相色譜法同時測定大黃中14種成分的含量[J]. 中國中藥雜志，2017，42（23）：4514-4519.

[5]顏永剛，尹立敏，王紅艷，等. HPLC法同時測定大黃炮制品中10種化學(xué)成分的含量[J]. 中國藥房，2016，27（27）：3839-3842.

[6]樊 秦，夏鵬飛，彭雪晶，等. 大孔吸附樹脂分離純化黨參中蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的工藝研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017，29（9）：1602-1607.

[7]賴紅芳，潘立衛(wèi)，呂貴密，等. 大孔樹脂純化翠云草中穗花杉雙黃酮的工藝[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（7）：201-204.

[8]師仁麗，于文龍，梁 娜，等. 大孔吸附樹脂分離純化金絲小棗總黃酮工藝研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（8）：172-175.

[9]鐘 旭，王 麗，徐廣濤，等. 大黃游離蒽醌的大孔吸附樹脂純化工藝研究[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（6）：1402-1404.

[10]曹 騁，葉殷殷，王浩龍，等. DM301型大孔吸附樹脂分離純化大黃總蒽醌的研究[J]. 中國現(xiàn)代中藥，2010，12（8）：37-40.

[11]Zhu S，Bo T T，Chen X Y，et al. Separation of succinic acid from aqueous solution by macroporous resin adsorption[J]. Journal of Chemical and Engineering Data，2016，61（2）：856-864.

[12]孫愛玲，于琳琳，李愛峰，等. 一種從大黃中分離純化蒽醌類化合物和苯乙烯酸的方法：104909999B[P]. 2015-09-16.

[13]毛春芳，施 忠，羅 琳，等. HPLC法同時測定大黃中蘆薈大黃素等11種成分的量[J]. 中草藥，2014，45（16）：2400-2403.