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    肉豆蔻-8散通過JAK2/STAT3信號通路減輕缺氧/復氧心肌細胞的損傷

    2019-10-30 08:54:46錢新宇肖云峰王玉華楊秀華
    中國藥科大學學報 2019年5期
    關鍵詞:肉豆蔻阻斷劑培養(yǎng)液

    錢新宇,肖云峰,王玉華,楊秀華,王 娜

    (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學 1藥學院;2新藥安全評價研究中心,呼和浩特 010010)

    在全球范圍內(nèi),缺血性心臟病(ischemic cardiomyopathy,ICM)的發(fā)病率和病死率不斷增加。缺血性心臟病是指由冠狀動脈粥樣硬化引起的長期心肌缺血,從而導致心肌彌漫性纖維化臨床綜合征。而再灌注治療是目前治療缺血性心臟病最有效的治療策略。然而當缺血組織恢復灌注后,會發(fā)生代謝功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷。這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)。MIRI會影響治療效果,增加惡性心律失常和心臟猝死等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生風險[1-2]。在MIRI期間,線粒體氧化損傷會增加線粒體氧化應激從而加劇心肌損傷。線粒體氧化損傷導致線粒體結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生一系列變化,如線粒體通透性改變,線粒體腫脹和促凋亡蛋白的釋放[3],從而導致線粒體功能障礙,離子穩(wěn)態(tài)失衡及收縮功能障礙,最終引起心肌細胞凋亡和壞死。因此,保護線粒體免受氧化損傷可能是改善MIRI的合理方法之一[4]。

    肉豆蔻-8散是由肉豆蔻、沉香、丁香、廣棗、木香、旋覆花、阿魏和牦牛心八味蒙藥組成,該方最早被經(jīng)典醫(yī)學著作《普濟方集》[5]收錄,目前該方被《內(nèi)蒙古蒙藥制劑規(guī)范》[6]第二冊所收錄。該方應用于蒙藥臨床已超過兩百多年,通常用于心煩、氣短、心供血不足、風濕性心臟病等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),肉豆蔻具有抗心肌缺血[7]和抗氧化作用[8]。因此,肉豆蔻-8散減輕MIRI可能與抑制線粒體氧化損傷有關。此外,本課題組還用外標法測定了肉豆蔻-8散提取物主要成分的含量,其包括丁香酚(10.755 8 mg/g)、去氫木香內(nèi)酯(2.041 8 mg/g)、木香烴內(nèi)酯(1.691 5 mg/g)、鞣花酸(0.690 4 mg/g)和去氫二異丁香酚(0.189 3 mg/g)等。

    JAK2/STAT3是調(diào)節(jié)細胞存活和細胞功能的重要信號通路,與心肌細胞損傷密切相關。此外,JAK2/STAT3信號的激活可以減少氧化應激[9]并維持線粒體功能[10]。然而,肉豆蔻-8散是否可以通過JAK2/STAT3信號通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷尚未闡明。因此,本研究旨在探討肉豆蔻-8散對MIRI心臟的保護作用和肉豆蔻-8散對線粒體功能的影響。同時探究這些作用是否與JAK2/STAT3信號通路有關。

    1 材 料

    1.1 細胞及試劑

    H9c2心肌細胞(上海富恒細胞庫);肉豆蔻-8散(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學藥學院制備);連二亞硫酸鈉(天津永晟精細化工有限公司);CCK-8、細胞裂解液(武漢博士德生物工程有限公司);Hoechst(上海碧云天生物技術公司);AG490,β-actin,AG490阻斷劑(純度大于99%),JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bax、Bcl-2一抗(英國Abcam公司);胰蛋白酶、DMSO(北京索萊寶技術有限公司);DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司);超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)檢測試劑盒(寧波美康生物科技股份有限公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京天根生化科技有限公司);山羊抗兔二抗(美國Abbkine公司)。

    1.2 儀 器

    倒置式生物顯微鏡(德國Leica公司);全自動酶標儀(美國賽默飛世爾儀器有限公司);紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司);臺式高速冷凍離心機(德國Sigma公司);全自動生化分析儀(愛爾蘭Sapphire公司);電泳儀(美國Bio-Rad公司);紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)。

    2 方 法

    2.1 肉豆蔻-8散及提取物的制備

    通過文獻[6]中肉豆蔻-8散處方進行制備,藥材均購自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院中藥房,由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學渠弼教授鑒定。選取肉豆蔻、沉香、丁香、廣棗、木香、旋覆花和阿魏各250 g,以及牦牛心150 g,以上八味藥材,粉碎成細粉,過篩,混勻,分裝,保存?zhèn)溆谩?/p>

    稱取肉豆蔻-8散10.0 g,精密稱定,置于500 mL圓底燒瓶中,加入75%乙醇250 mL,加熱回流提取30 min,提取2次,合并濾液,蒸干,得到肉豆蔻-8散提取物5 g。稱取一定量的肉豆蔻-8散提取物,首先用DMSO溶解至一定濃度,然后用DMEM稀釋至相應濃度么,最后用0.22 μm微孔濾膜除菌,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.2 AG490阻斷劑的制備

    稱取AG490阻斷劑2.95 mg,精密稱定,置于棕色玻璃小瓶中,加入DMSO 100 μL,使用渦旋儀將其完全溶解,加入無血清培養(yǎng)液900 μL,配成10 mmol/L AG490阻斷劑。使用0.22 μm微孔濾膜除菌,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.3 分組及給藥

    實驗共分為6組,空白組使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h,換為無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h;模型組使用無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h,換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h;AG490阻斷劑組加入終濃度為40 mg/L肉豆蔻-8散提取物及1 mol/L AG490阻斷劑的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h,換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h;肉豆蔻-8散提取物低劑量組加入終濃度為10 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h,換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4,的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h;肉豆蔻-8散提取物中劑量組加入終濃度為20 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h,換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4,的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h;肉豆蔻-8散提取物高劑量組加入終濃度為40 mg/L含肉豆蔻-8散提取物的無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h,換為終濃度為2 mmol/L Na2S2O4,的無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)1 h后使用無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

    2.4 CCK-8法檢測細胞活力

    取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞。消化后以每孔1×104個細胞接種于96孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組,完成相應處理后,每孔加入CCK-8溶液10 μL,37 ℃孵育1 h,使用酶標儀在450 nm處檢測吸收度,計算細胞活力,實驗平行測定3次。

    2.5 Hoechst染色法

    取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞,消化后以每孔1×105個細胞接種于24孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組,完成相應處理后,每孔加入Hoechst 33342染液250 μL,避光培養(yǎng)30 min,棄去染色液,PBS清洗3次,每次1 min。使用熒光顯微鏡觀察細胞凋亡情況。

    2.6 生化指標的檢測

    2.6.1 細胞培養(yǎng)液中LDH、CK、AST 含量的檢測 取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞,消化后以每孔6×105個細胞接種于6孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組,完成相應處理后,收集細胞培養(yǎng)液。1 000 r/min,離心7 min,吸取上清液。使用全自動生化分析儀進行檢測LDH、CK和AST水平,實驗平行測定6次。

    2.6.2 細胞中CAT、SOD、GSH-Px含量的檢測 取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞,消化后以每孔6×105個細胞接種于6孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組,完成相應處理后,棄去細胞培養(yǎng)液,使用細胞裂解液收集各組細胞。BCA蛋白定量法測定各組蛋白濃度,進而根據(jù)試劑盒操作說明書測定細胞中CAT、SOD、GSH-Px水平,實驗平行測定3次。

    2.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)

    取生長狀態(tài)良好的H9c2細胞,消化后以每孔6×105個細胞接種于6孔板上。根據(jù)實驗要求進行分組,完成相應處理后,使用細胞裂解液提取各組細胞蛋白,BCA蛋白定量法測定細胞蛋白濃度,在樣品中加入5×蛋白質(zhì)上樣緩沖液使用100 ℃金屬浴加熱10 min進行蛋白變性;按照SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒說明書進行SDS聚丙烯酰胺凝膠的制備;以80 V,30 min電泳濃縮膠,以120 V,90 min電泳分離膠,當指示帶電泳至分離膠底部停止電泳;轉(zhuǎn)膜2 h至PVDF膜上,使用Western blot封閉液封閉10 min;一抗(β-actin,JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,Bax,Bcl-2,1∶1 000)4 ℃孵育過夜;使用TBST清洗3次,每次10 min,二抗(1∶5 000)搖動孵育1 h;TBST清洗3次,使用紅外激光成像系統(tǒng)進行檢測,Image J軟件獲得灰度,實驗平行測定3次。

    2.8 統(tǒng)計學分析

    3 結(jié) 果

    3.1 Na2S2O4誘導心肌細胞缺氧/復氧損傷模型的建立

    實驗結(jié)果顯示,與空白組比較,不同濃度的Na2S2O4均可顯著降低細胞存活率(P<0.01),并隨Na2S2O4劑量增大,H9c2心肌細胞存活率不斷下降,其中Na2S2O4對H9c2細胞活力的半數(shù)抑制量為2 mmol/L。因此,選擇2 mmol/L Na2S2O4作為心肌細胞缺氧/復氧損傷模型。結(jié)果見圖1。

    Figure1 Effects of different concentrations of sidoum dihionite on myocardial cell viability

    ##P<0.01vscontrol group

    3.2 肉豆蔻-8散提取物對Na2S2O4誘導心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響

    實驗結(jié)果顯示,與模型組比較,不同濃度肉豆蔻-8散提取物均可顯著提高細胞存活率(P<0.01),并隨肉豆蔻-8散提取物劑量增大,H9c2心肌細胞存活率不斷提高。其中,肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)與肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)、高劑量組(40 mg/L)均有顯著差異(P<0.01);肉豆蔻-8散中劑量組與高劑量組有顯著差異(P<0.05);AG490阻斷劑組可減弱肉豆蔻-8散提取物的作用,結(jié)果見圖2。

    Figure2 Effects of different concentrations of sidoum dihionite on myocardial cell viability

    A:Control;B:Model;C:AG490 blocker;D:Roudoukou-8San(10 mg/L);E:Roudoukou-8San(20 mg/L);F:Roudoukou-8San(40 mg/L)

    ##P<0.01vsmodel group;*P<0.05,**P<0.01

    3.3 肉豆蔻-8散提取物對心肌細胞形態(tài)改變的影響

    Hoechst熒光細胞核染色,可直接反映細胞的存活量,其熒光強度可反映細胞的凋亡狀態(tài)。結(jié)果見圖3。熒光倒置顯微鏡下觀察,空白組細胞呈均一核染,且未見核異常,結(jié)果見圖3-A;模型組細胞形態(tài)變化明顯,細胞出現(xiàn)核破裂、細胞數(shù)量變少及細胞核呈碎塊狀致密濃染等凋亡形態(tài)學特征,結(jié)果見圖3-B;AG490阻斷劑組細胞狀態(tài)與模型組相似,結(jié)果見圖3-C;肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)可見核固縮、核破裂等現(xiàn)象減弱,細胞數(shù)量較模型組明顯增多,但細胞間隙較大,結(jié)果見圖3-D;肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)可見核固縮、核破裂等現(xiàn)象減弱,細胞數(shù)量較模型組明顯增多,結(jié)果見圖3-E;肉豆蔻-8散高劑量組(40 mg/L)可見核固縮、核破裂等現(xiàn)象明顯減弱,細胞數(shù)量較模型組明顯增多,結(jié)果見圖3-F。

    3.4 肉豆蔻-8散提取物對生化指標檢測結(jié)果的影響

    實驗結(jié)果顯示,與模型組比較,不同濃度肉豆蔻-8散組細胞培養(yǎng)液中CK、LDH、AST含量顯著降低(P<0.01),其中,與肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)比較,肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高劑量組(40 mg/L)細胞培養(yǎng)液中CK、LDH、AST含量顯著降低(P<0.01);AG490阻斷劑組可減弱肉豆蔻-8散提取物的作用,結(jié)果見表1。

    Figure3 Hoechst staining to observe the apoptotic morphology of cardiomyocytes

    A:Control;B:Model;C:AG490 blocker;D:Roudoukou-8San(10 mg/L);E:Roudoukou-8San(20 mg/L);F:Roudoukou-8San(40 mg/L)

    GroupCK/(U/L)LDH/(U/L)AST/(μmol/L)Control5.64±1.18##27.83±5.26##5.43±0.73##Model9.46±1.2777.37±8.3813.92±0.16AG490blocker9.53±1.54##71.32±5.74##13.62±0.23##Roudoukou-8San(10mg/L)8.48±1.23##64.45±5.78##11.36±0.22##Roudoukou-8San(20mg/L)7.41±1.24##??47.45±4.78##??7.26±0.48##??Roudoukou-8San(40mg/L)6.54±1.04##??36.57±4.42##??6.21±0.36##??

    ##P<0.01vsmodel group;**P<0.01vsRoudoukou-8San(10 mg/L) group

    實驗結(jié)果顯示,與模型組比較,不同濃度肉豆蔻-8散組細胞中CAT、SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.01),其中,與肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)比較,肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高劑量組(40 mg/L)細胞中CAT、SOD、GSH-Px含量顯著升高(P<0.01);AG490阻斷劑組可減弱肉豆蔻-8散提取物的作用,結(jié)果見表2。

    GroupCAT/(U/mgprot)SOD/(U/mgHb)GSH-Px/(U/mgprot)Control7.67±1.65##309.89±21.28##28.83±5.73##Model2.47±0.25172.34±12.988.42±2.16AG490blocker2.93±0.24171.82±13.758.47±2.27Roudoukou-8San(10mg/L)4.26±0.21##207.35±12.98##15.26±1.98##Roudoukou-8San(20mg/L)5.99±1.01##??233.50±19.49##??20.94±1.39##??Roudoukou-8San(40mg/L)6.56±0.69##??285.26±17.69##??27.23±5.18##??

    ##P<0.01vsmodel group;**P<0.01vsRoudoukou-8San(10 mg/L) group

    3.5 肉豆蔻-8散提取物對心肌細胞JAK2、p-JAK2、STAT3、p-JAK2、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

    實驗結(jié)果顯示,與模型組比較,不同濃度肉豆蔻-8散組可使p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達增加(P<0.01)、Bax蛋白表達減少(P<0.01);其中,與肉豆蔻-8散低劑量組(10 mg/L)比較,肉豆蔻-8散中劑量組(20 mg/L)和肉豆蔻-8散高劑量組(40 mg/L)細胞中p-JAK2、p-STAT3、Bcl-2蛋白表達增加(P<0.01)、Bax蛋白表達減少(P<0.01);AG490阻斷劑組可減弱肉豆蔻-8散提取物的作用,結(jié)果見圖4。

    4 討 論

    本實驗的結(jié)果顯示,2 mmol/L Na2S2O4可顯著降低細胞活力,同時可顯著增加LDH、CK和AST的水平,說明本實驗的H9c2細胞缺氧/復氧模型建立成功。與模型組相比,肉豆蔻-8散提取物可增加受損細胞的活力、顯著降低LDH、CK和AST的水平。故肉豆蔻-8散可減輕MIRI。MIRI的氧化應激增加會造成線粒體氧化損傷,反過來,線粒體氧化損傷又會加劇MIRI。SOD、GSH-Px和CAT是3種重要的抗氧化酶。SOD可阻斷氧自由基對細胞的損傷,并且能夠及時修復受損的細胞。CAT可將H2O2直接分解為H2O和O2,從而抑制脂質(zhì)過氧化反應。GSH-Px可維持機體氧化與抗氧化平衡,從而保護細胞膜的結(jié)構(gòu)免受過氧化物損傷。實驗結(jié)果說明,肉豆蔻-8散可使心肌細胞SOD、GSH-Px和CAT的活性提高,抑制脂質(zhì)過氧化反應、修復受損細胞。故肉豆蔻-8散可減輕由心肌缺血再灌注損傷造成的氧化損傷,發(fā)揮心臟保護作用。

    Figure4 Effect ofRoudoukou-8Sanon the protein expression of JAK2,p-JAK2,STAT3,p-STAT3,Bax and Bcl-2 in cardiomyocytes

    1:Control;2Model;3:AG490 blocker;4:Roudoukou-8San(10 mg/L);5:Roudoukou-8San(20 mg/L);6:Roudoukou-8San(40 mg/L)

    ##P<0.01vsmodel group;*P<0.05,**P<0.01

    在這項研究中,肉豆蔻-8散不僅對心肌細胞具有保護作用同時也顯著減少模型組p-JAK2和p-STAT3表達,使抗凋亡因子Bcl-2增加和促凋亡因子Bax減少。但這些作用可被JAK2特異性阻斷劑AG490消除。Bcl-2和Bax在MIRI的凋亡過程中起重要作用并且是內(nèi)在線粒體途徑的重要組成部分[11]。之前研究已證明,多種藥物可作用于JAK2/STAT3信號通路,調(diào)節(jié)內(nèi)在線粒體途徑進而誘導細胞凋亡[12-14]。故肉豆蔻-8散激活JAK2/STAT3信號通路可促進心肌細胞中抗凋亡信號傳導,進而發(fā)揮心肌保護作用。

    總之,實驗結(jié)果表明,肉豆蔻-8散可減輕心肌缺血再灌注損傷,對心臟具有保護作用。而這種保護作用主要與JAK2/STAT3信號的激活和線粒體氧化損傷的減輕有關。肉豆蔻-8散可通過激活JAK2/STAT3信號通路減弱MIRI誘導的線粒體氧化損傷。這些結(jié)果表明,肉豆蔻-8散可能成為治療心肌缺血再灌注損傷的有效藥物之一。

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