苦木總生物堿的化學成分分析及其對大鼠膠原誘導性關(guān)節(jié)炎的作用

劉博文，劉富壘,，王如意，薛經(jīng)緯，柳文媛，馮 鋒,4,5*，曲 瑋,5**

(1中國藥科大學中藥學院天然藥物化學系，南京 210009；2山東省泰安市中心醫(yī)院，泰安 271000；3中國藥科大學藥學院藥物分析系，南京 210009；4江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學院，淮安 223003；5中國藥科大學生物材料重點實驗室，南京 210009)

類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病[1]，該疾病會導致患者關(guān)節(jié)畸形，活動不便，嚴重的將導致殘疾。類風濕性關(guān)節(jié)炎的病因多與基因、環(huán)境及性別有關(guān)[2]，但并未完全闡明。其病理主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)處滑膜增生、大量炎性細胞浸潤、炎性滑膜炎及骨與軟骨的破壞等[3]。治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物主要有非甾體抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、改善病情類藥物(如阿達木單抗、托珠單抗)等[4]。然而，這些藥物存在著不良反應(yīng)大、價格昂貴等缺陷[5-7]，限制了其使用。而一些中藥因其為多個天然活性成分間的組合，對一些較為活躍的靶標具有一定的協(xié)同作用，因此具有較高藥理活性。這些優(yōu)勢使得中藥一直是抗類風濕性關(guān)節(jié)炎藥物的研究熱點[8]。

苦木[Picrasmaquassioides(D.Don) Benn]是苦木科苦木屬植物苦木的干燥枝莖，主要分布在我國南方各省、朝鮮半島及日本等地?？嗄咀鳛橐环N中藥在我國具有悠久的用藥歷史，功能主治清熱解毒、濕熱瀉痢、毒蛇咬傷等[9-10]?？嗄咀⑸湟?海立新?)是一種以苦木為單味藥的中藥制劑，被廣泛應(yīng)用于臨床，功能主治感冒、上呼吸道感染、急性扁桃體炎、腸炎等[11]。研究表明，苦木的主要活性成分，β-咔巴啉和鐵屎米酮類生物堿，具有良好的抗炎[12]、抗腫瘤[13]及抗高血壓[14]等活性。機制研究表明,苦木生物堿具有良好的抗TNF-α和抗IL-6活性[15]，有望成為一種較好的抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的藥物。膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(CIA)是RA的動物實驗?zāi)Ｐ?。本文主要研究苦木總生物堿對大鼠CIA的作用。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

苦木藥材于2016年購于江西贛州，經(jīng)馮鋒教授鑒定為苦木Picrasmaquassioides(D.Don) Benn的干燥莖，憑證標本均存放于中國藥科大學天然藥物化學研究室；1-羥甲基-β-咔巴啉，3-甲基鐵屎米-5,6-二酮和5-羥基-4-甲氧基鐵屎米-6-酮標準品(本實驗室從苦木中分離得到，純度大于98%，通過MS2，1H NMR和13C NMR光譜數(shù)據(jù)鑒定)；注射用地塞米松磷酸鈉(Dex，安徽馬鞍山豐原制藥有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(不含雙抗)，胎牛血清(FBS)[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；脂多糖(LPS，碧云天生物技術(shù)有限公司)；水合氯醛(純度大于99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；牛Ⅱ型膠原及完全弗氏佐劑(美國Sigma公司)；TNF-α和IL-6 ELISA試劑盒(上海欣博盛生物科技有限公司)；其他化學試劑均為市售分析純。

1.2 儀 器

高效液相色譜(Aglient 1200分析型液相色譜)，G6538 Q-TOF高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(HPLC-ESI-Q-TOF-MS)(美國安捷倫公司)；BSA124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DM041型臺式低速離心機(美國Scilogex公司)；XD-202型光學顯微鏡(江南光電股份有限公司)；Multiskan FC型酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)；IX5型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.3 動 物

清潔級SD大鼠，雄性，(180±10) g，由南京青龍山動物繁殖場提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(蘇)2017-0001。動物喂養(yǎng)于中國藥科大學動物實驗中心，25 ℃分籠飼養(yǎng)，自由飲食飲水，實驗室采用12 h光照和12 h黑暗的光暗周期。動物在實驗室適應(yīng)環(huán)境1周后進行實驗，所有動物實驗符合動物倫理委員會標準。

2 方 法

2.1 苦木總生物堿的制備

取風干的苦木莖4.75 kg，粉碎，在回流條件下用80%乙醇水溶液20 L提取兩次，每次約2 h，合并兩次提取液，旋蒸濃縮得到浸膏119 g。3%～5%的HCl(pH為1～2)1.29 L溶解浸膏，等體積的二氯甲烷萃取3次除去酸不溶性成分，25%的氨水調(diào)節(jié)pH至9～10，等體積的二氯甲烷萃取生物堿，旋蒸合并二氯甲烷得苦木總生物堿6.55 g，干燥、備用。

2.2 苦木總生物堿的定性定量分析

液質(zhì)聯(lián)用色譜條件：Eclipse Plus C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)，流動相為乙腈-0.1%甲酸按表1梯度洗脫，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫40 ℃，波長254 nm。

Table1 HPLC elution time procedure of total alkaloids fromPicrasmaquassioides(TAPQ)

t/minAcetonitrile/%0.1%Formicacid/%018822021794534668040609052489410009810009918821101882

質(zhì)譜條件如下。離子源：ESI電噴霧離子源；正離子方式檢測，掃描方式：全掃描，質(zhì)量范圍m/z100～1 700 Hz，干燥氣溫度：325 ℃；霧化氣壓力：40 psi(1 psi=6.895 kPa)；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：10.0 L/min；毛細管電壓：3 500 V；碎裂器電壓：120 V；碰撞電壓：35 V。

定量色譜條件：SepaxGP-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相同表1梯度洗脫，流速1 mL/min，進樣量20 μL，柱溫40 ℃，波長254 nm。

2.3 體外活性研究

LPS誘導的RAW264.7細胞抗炎活性考察：RAW264.7小鼠巨噬細胞以每孔2.0×104～5.0×104個細胞的密度接種于96孔板中。37 ℃，5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育12～24 h，待細胞貼壁后，加入不同藥物濃度的DMEM溶液(含10 μg/mL的LPS及10%的FBS)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取上清液分別用小鼠ELISA試劑盒測量TNF-α及IL-6。抑制率(%)=(對照組吸收度-試驗組吸收度)/(對照組吸收度-空白組吸收度)×100。

2.4 模型制備及給藥方法

根據(jù)文獻的方法進行造模[16-17]。將牛Ⅱ型膠原溶解于0.1 mol/L乙酸中，在4 ℃下攪拌過夜，然后將上述乙酸溶液逐滴滴加到等體積的完全弗氏佐劑中，渦旋至均勻的乳化液，最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL。第1天，每只造模大鼠于尾巴基部多點皮內(nèi)注射牛Ⅱ型膠原100 μg，1周后注射同樣的劑量進行一次加強免疫，第11天造模成功開始給藥。給藥時通過尾靜脈注射0.6%吐溫-80助溶的苦木總生物堿，低劑量組為0.907 mg/kg，高劑量組為1.814 mg/kg，模型組注射等量的生理鹽水(CIA+saline)，陽性藥組按照每只50 μg的劑量注射地塞米松(CIA+Dex)，連續(xù)給藥18 d。每組動物的左足跖體積每2天測量1次，每組動物的關(guān)節(jié)炎級別分數(shù)根據(jù)一定的標準每兩天記錄1次，得出各治療組關(guān)節(jié)足跖體積和關(guān)節(jié)級別分數(shù)的折線圖。關(guān)節(jié)炎級別標準如下：“0”無腫脹，局灶性發(fā)紅；“1”指關(guān)節(jié)腫脹；“2”腳踝或手腕輕度腫脹；“3”涉及整個爪子的嚴重炎癥；“4”關(guān)節(jié)畸形或僵直。每次記錄兩只后腿的關(guān)節(jié)炎級別分數(shù)之和。計算各治療組的曲線下面積，綜合評估各治療組的治療效果。

生命是一個創(chuàng)造的過程，也是一個積淀的過程，每個人無時無刻不在為自己的人生埋下“伏筆”。在平凡的生活中，我們只有盡可能地積聚力量，不斷奠定堅實的人生基礎(chǔ)，才會散發(fā)出耀眼的光芒，實現(xiàn)自身的飛躍。毛竹的精神是令人欽佩的，我們要做一夜之間躥入云霄的毛竹，就要擁有毛竹的氣度：沉得住底氣、耐得住寂寞，俯下身子、站穩(wěn)腳步，積聚能量、蓄勢待發(fā)。一旦時機成熟，定會拔地而起。

2.5 血清樣本采集及細胞因子含量測定和組織樣本采集及組織學觀察

大鼠給藥18 d后，稱重，于股骨動脈取血處死，收集全血，靜置30 min后，離心取上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照TNF-α和IL-6的ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組血清中TNF-α和IL-6的含量。迅速剪去左腿踝關(guān)節(jié)，剝離肌肉和組織，生理鹽水洗滌后置于4%多聚甲醛中固定備用。將組織脫鈣、包埋、切片，并進行蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡觀察各組的關(guān)節(jié)處病理變化。

2.6 統(tǒng)計學分析

用Graphpad Prism 5.0軟件計算足跖腫脹程度的折線圖各治療組的曲線下面積。

3 結(jié) 果

3.1 苦木總生物堿的定性定量分析

通過對苦木總生物堿的HPLC-Q-TOF-MS/MS分析，得出苦木總生物堿的總離子流圖(TIC)如圖1，大部分的峰具有很好的分辨率和靈敏度。通過查閱文獻以及標準品對照分析，從中解析出14個生物堿化合物，為β-咔巴啉類和鐵屎米-6-酮類生物堿，其中包括9個生物堿單體及5個生物堿二聚體，其結(jié)果如下表2，其結(jié)構(gòu)如圖2所示。

苦木總生物堿的液相色譜圖及混合標準品的色譜圖見圖3、圖4。在混標譜圖中，保留時間在5.743，9.901和33.279 min處的峰依次為1-羥甲基-β-咔巴啉(化合物1)，3-甲基鐵屎米-5,6-二酮(化合物3)和5-羥基-4-甲氧基鐵屎米-6-酮(化合物9)。含量測定前按照相關(guān)文獻的要求進行方法學考察[26]。通過液相分析，化合物1，3和9的含量分別為(3.20±0.03)%、(1.32±0.01)%和(12.61±0.05)%。

3.2 苦木總生物堿對LPS誘導RAW264.7抗炎活性

各濃度下苦木總生物堿對LPS誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞中TNF-α和IL-6的抑制作用如圖5-A所示。經(jīng)Graphpad Prism 5.0計算，苦木總生物堿對TNF-α的IC50為(22.880±4.005)μg/mL，對IL-6的IC50為(8.672±0.330)μg/mL。結(jié)果表明，苦木總生物堿具有一定的抗TNF-α和IL-6活性。

綜上所述，苦木總生物堿顯然具有一定的抗炎活性，在較低的質(zhì)量濃度下(5 μg/mL)與陽性藥地塞米松在相同濃度下的抑制活性對比見圖5-B，苦木總生物堿與地塞米松都具有較強的抗炎活性，相同劑量下，苦木總生物堿對TNF-α的抑制活性要強于地塞米松。

Figure1 Total ion chromatogram (TIC) of total alkaloids in TAPQ

Table2 Identified information of the compounds in TAPQ

No.tR/min[M+H]+/[M-Cl]+Predictedformula AssignmentRemark11.398199.0862C12H10N2O1-Hydroxymethyl-β-carbolineStandard21.994213.0661C12H8N2O2β-Carboline-1-carboxylicacidStandard32.208251.0801C15H10N2O23-Methylcanthin-5,6-dioneStandard42.470453.3435C27H24N4O3PicrasidinesB[18]52.804241.0972C14H12N2O21-Methenyl--4-methoxyl-β-carboline[19]65.880227.1180C13H10N2O21-Methoxymethenyl-β-carboline[20]77.812255.1129C15H14N2O21-Ethenyl-4,8-dimethoxyl-β-carboline[21]88.742257.1284C15H16N2O21-Ethyl-4,8-dimethoxyl-β-carboline[22]99.910267.0761C15H12N2O35-Hydroxyl-4-methoxylcanthin-6-oneStandard1025.122281.0929C16H12N2O43-Methyl-4-methoxylcanthin-5,6-dioneStandard1137.280481.1864C28H24N4O4PicrasidinesH[23]1246.506449.1981C28H24N4O2ClPicrasidinesGoritsisomers[24]1349.605479.2076C29H26N4O3ClPicrasidinesForitsisomers[25]1453.110509.2188C30H28N4O4ClPicrasidinesSoritsisomers[24]

Figure2 Structures of confirmed compounds in TAPQ

Figure3 HPLC chromatogram of TAPQ (5 mg/mL)

Figure4Mixed HPLC spectra of three standards

3.3 苦木總生物堿對大鼠CIA的作用

如圖6所示，根據(jù)“2.4”項下給藥方法連續(xù)給藥18 d后，治療組特別是高劑量組的大鼠足跖腫脹程度明顯降低。高劑量治療組與生理鹽水組的治療效果在即將結(jié)束的第13～17天具有顯著性差異(圖6)。在足跖腫脹程度的折線圖中(圖6-A)，由Graphpad Prism 5.0計算的各治療組曲線下面積可知，5個治療組關(guān)節(jié)腫脹體積與x軸的曲線下面積(AUC)分別為空白組為23.02，生理鹽水組為50.89，高劑量組為38.15，低劑量組為47.08，陽性藥地塞米松組為34.45。由此可知，苦木總生物堿能夠顯著降低發(fā)炎關(guān)節(jié)的腫脹程度，特別是高劑量組擁有與陽性藥相媲美的治療效果，其對關(guān)節(jié)腫脹具有明顯的緩解作用。

#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001vscontrol group；*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001vsmodel group (CIA+saline)

如圖7所示，生理鹽水組與空白組相比，血清中的TNF-α和IL-6的含量較高，具有一定的顯著性差異，說明模型組動物處于很嚴重的炎癥狀態(tài)。由給藥組血清中的TNF-α和IL-6的含量可知，無論是低劑量還是高劑量組，血清中的炎癥因子含量顯著降低，與生理鹽水組相比都有顯著性差異，說明苦木總生物堿特別是高劑量組能夠顯著降低類風濕性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)的TNF-α和IL-6兩種炎癥因子含量。因此，苦木總生物堿具有很強的體內(nèi)抗炎活性，擁有抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎疾病進展的內(nèi)在潛力。

##P<0.01,###P<0.001vscontrol group；**P<0.01,***P<0.001vsmodel group (CIA+saline)

各治療組對關(guān)節(jié)炎的治療效果，還需對關(guān)節(jié)的病理特征做進一步研究，本實驗著重考察苦木總生物堿是否能夠抑制類風濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)侵蝕與破壞。各治療組的關(guān)節(jié)照片和切片的HE染色分析如圖8所示。直觀的關(guān)節(jié)照片如圖8-A所示，空白組、模型組和各給藥組的照片可以直觀地反映各組的關(guān)節(jié)狀態(tài)，模型組腫脹明顯，關(guān)節(jié)發(fā)生僵直，符合類風濕性關(guān)節(jié)炎的體外特征，其他各治療組腫脹程度明顯減弱。踝關(guān)節(jié)的HE染色切片結(jié)果如圖8-B所示，模型組大鼠的關(guān)節(jié)處有很嚴重的炎性細胞浸潤，滑膜及軟骨都有很大程度的破壞，而給藥組特別是高劑量組的滑膜破損的程度很小，僅有少量的炎性細胞浸潤，展現(xiàn)出幾乎完整的關(guān)節(jié)滑膜?？梢?，苦木總生物堿(尤其在1.814 mg/kg的劑量下)具有一定的抑制關(guān)節(jié)處炎性細胞侵蝕及破壞作用，其原理是通過降低炎性因子TNF-α和IL-6的含量來減輕關(guān)節(jié)處的炎癥繼而降低炎癥對關(guān)節(jié)的侵蝕和損壞。

Figure8 Photographs of representative left hind legs from different treatment groups (A) and histopathology in ankle joints identified using hematoxylin-eosin staining of arthritic joints in different treatment groups (B)

4 討 論

類風濕性關(guān)節(jié)炎是一種以慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，目前的抗類風濕的治療多以抗炎為主[27]，炎癥因子是導致類風濕性關(guān)節(jié)炎病理的主要病因，TNF-α和IL-6與類風濕性關(guān)節(jié)炎的諸多病理現(xiàn)象密切相關(guān)，因此TNF-α和IL-6是治療類風濕性關(guān)節(jié)炎的熱門靶點。

本研究通過酸提堿沉法制備出苦木總生物堿，并對提取的苦木總生物堿進行了定性研究，解析出其中的14個化合物，定量出其中3個代表成分的含量,為苦木總生物堿的質(zhì)量控制提供一定參考與借鑒。藥效實驗從細胞和動物兩個層面證明了苦木總生物堿具有很強的抗TNF-α和抗IL-6活性；動物藥效實驗也從關(guān)節(jié)腫脹程度分析，關(guān)節(jié)切片分析等多個層面證明了苦木總生物堿(尤其在1.814 mg/kg的劑量下)的確能夠抑制膠原誘導性關(guān)節(jié)炎的疾病進展。因此，苦木總生物堿有望成為一種治療抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的候選藥物。后期可通過，Western blot及PCR等技術(shù)進行更深層次的藥理活性研究。