轉(zhuǎn)化人參皂苷菌株的篩選及活性初步鑒定

賈桂燕　潘昉　劉玉鵬　李晶瑩　王維峰　孫工兵　葛文中　張?jiān)卢?/p>

摘 要：實(shí)驗(yàn)從吉林省長(zhǎng)白山、通化市榆林鎮(zhèn)、懷化白山市撫松縣3地的鮮參根際土壤中篩選具有轉(zhuǎn)化人參皂苷生物活性的微生物，平板劃線法篩選單菌落菌株，人參總皂苷為底物經(jīng)液體發(fā)酵，經(jīng)薄層色譜分析初步判斷具有轉(zhuǎn)化活性的菌株，采用紫外分光光度法測(cè)定活性菌株對(duì)人參皂苷的轉(zhuǎn)化率。最終篩選出8株真菌菌株，其中C4轉(zhuǎn)化活性最高，可使人參皂苷的轉(zhuǎn)化率提高28.92%。

關(guān)鍵詞：人參皂苷;微生物轉(zhuǎn)化;薄層層析法;紫外分光光度法

中圖分類號(hào) TQ929文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）15-0028-04

Screening of Transformed Ginsenosides Strains and Preliminary Identification of Their Activities

Jia Guiyan1 et al.

（1College of Life Science and Technology， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing 163319，China）

Abstract：In this experiment，there are eight fungi strains were selected from rhizosphere soil of fresh ginseng in Changbai Mountain of Jilin Province，Yulin Town of Tonghua City and Fusong County of Huaihua City，which had bioactivity of transforming ginsenoside.Through thin layer chromatography analysis，preliminary judgment has the activity of the strains，again by Ultraviolet spectrophotometric method determination of active strains of ginseng saponin conversion rate.Among them，C4 showed the highest conversion activity，which could increase the conversion rate of ginsenosides by 28.92%.

Key words：Ginsenoside;Microbial-Transformation;Thin-layer-Chromatography;UV spectrophotometry

人參（Panax ginseng C.A.Mey）是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴的藥用植物之一，作為幾千年來應(yīng)用最廣泛的中草藥之一，在東方醫(yī)學(xué)史上占有重要地位[1]。味甘，微苦，性質(zhì)溫和，具有調(diào)氣血、滋補(bǔ)身體的作用，被譽(yù)為“中草藥之王”[2，3]。人參皂苷是人參的主要藥理活性成分，具有抗炎、抗腫瘤、抗癌等作用[4-6]。由于天然人參皂苷含量較低，利用化學(xué)和生物方法對(duì)人參皂苷進(jìn)行定向轉(zhuǎn)化，對(duì)于制備人參皂苷有著重要意義。

目前，人參皂苷的轉(zhuǎn)化方法主要有微生物轉(zhuǎn)化和酶轉(zhuǎn)化2種[7，8]。酶轉(zhuǎn)化法有一定的特異性，β-葡萄糖苷酶是酶轉(zhuǎn)化法最常用的一種酶。微生物轉(zhuǎn)化不同于酶轉(zhuǎn)化，以簡(jiǎn)單的培養(yǎng)方式、多樣的種類和豐富的酶系統(tǒng)成為生物轉(zhuǎn)化中最常用的生物，其轉(zhuǎn)化過程一般為：細(xì)菌篩選—培養(yǎng)轉(zhuǎn)化底物—薄層色譜分析—紫外（高效液相）檢測(cè)。近年來，學(xué)者們對(duì)人參皂苷的微生物轉(zhuǎn)化途徑和產(chǎn)物進(jìn)行了研究，為轉(zhuǎn)化人參皂苷奠定了基礎(chǔ)[9，10]。微生物轉(zhuǎn)化不僅具有環(huán)境污染程度低、成本低的優(yōu)點(diǎn)，而且具有較高的特異性，是一種選擇性、環(huán)保性技術(shù)[11]。應(yīng)用微生物方法對(duì)天然人參皂苷糖基的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改變，大大提高了其生理活性和應(yīng)用價(jià)值，將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義[12-14]。

本實(shí)驗(yàn)通過平板劃線法從長(zhǎng)白山、榆林鎮(zhèn)、撫松縣3個(gè)產(chǎn)地的鮮參根際土壤稀釋液中篩選出22株真菌菌株，根據(jù)其形態(tài)、顏色，最終合并為8株菌株，采用液體發(fā)酵法以人參總皂苷為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，經(jīng)薄層色譜分析法初步確定具有轉(zhuǎn)化能力的活性菌株，利用紫外可見分光光度法測(cè)定發(fā)酵液吸光度值[16]，考察人參總皂苷的轉(zhuǎn)化情況，繼而得到轉(zhuǎn)化活性最佳的活性菌株。

1 儀器與材料

1.1 儀器 詳見表1。

1.2 試劑 瓊脂粉（北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）、葡萄糖（沈陽市華東試劑廠），硅膠板GF254（青島海洋化工廠分廠），pH試紙（天津市金達(dá)化學(xué)試劑有限公司），甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），三氯甲烷（北京化工廠），正丁醇（天津市百世化工有限公司），均為分析純。濃硫酸、香草醛、冰乙酸、高氯酸均為分析純，購(gòu)買于天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.3 材料 帶土鮮參分別購(gòu)買于吉林省長(zhǎng)白山，通化市榆林鎮(zhèn)，懷化白山市撫松縣3個(gè)地區(qū)（均為5年參）;人參總皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買于合肥博美生物科技有限公司;實(shí)驗(yàn)所用底物人參莖葉總皂苷購(gòu)買于遼寧省生物醫(yī)藥研發(fā)中心。

2 方法

2.1 培養(yǎng)基的制備 培養(yǎng)液pH控制在7左右，用1mol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)控制。制備的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)皿等均在121℃的高溫下滅菌25min。

2.1.1 馬鈴薯固體培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基） 將馬鈴薯去皮，洗凈并切成1cm3的小塊，用天平稱取200g，加入1000mL的蒸餾水和20 g瓊脂粉，一起煮沸約20min后土豆塊熟而不爛，停止加熱[16]。用紗布過濾，將濾液倒入1000mL的燒杯中，再向?yàn)V液中加入20g葡萄糖，用玻璃棒攪拌溶解，最后加蒸餾水定容到1000mL。

2.1.2 馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDB培養(yǎng)基） 配置方法同上述PDA培養(yǎng)基配置法相同，加入葡萄糖和人參總皂苷底物，再分裝置250mL錐形瓶中，包好，放置121℃高溫滅菌鍋中25min[16]。滅菌后取出放入4℃左右冰箱冷藏保存。

2.1.3 斜面培養(yǎng)基 將PDA培養(yǎng)基趁熱倒入試管中，使試管傾斜成斜面，使之凝固，4℃左右冰箱冷藏保存。

2.1.4 平面培養(yǎng)基 均勻?qū)DA培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，平鋪培養(yǎng)皿底部即可。

2.2 鮮參根際土壤真菌的分離 采用稀釋平板法進(jìn)行土壤分離。取長(zhǎng)白山、榆林鎮(zhèn)、撫松縣3個(gè)地方的土壤放置于40～ 50℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干2～3h。分別取1g烘干土壤，在超凈臺(tái)上各加入10mL無菌蒸餾水，將土樣從10-1稀釋至10-6倍[16，17]。充分震蕩搖勻。再將稀釋液逐級(jí)取0.1mL用無菌三角棒均勻涂布在含有PDA平板培養(yǎng)基上。在30℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d。每24h觀察并記錄。結(jié)果顯示，能培養(yǎng)出菌株的土壤稀釋液通常為10-4～10-6。

2.3 菌種的純化 利用單菌落劃線法，將培養(yǎng)獲得的菌種進(jìn)行純化。在超凈臺(tái)上用接種環(huán)挑取單菌落在含有卡那霉素（50μg/mL）PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線，30℃倒置培養(yǎng)48h后得到較純的菌落。再經(jīng)反復(fù)劃線培養(yǎng)，每隔24h取出觀察，直至得到單一的菌株，取出后，在無菌操作臺(tái)上用接種環(huán)傳至含有卡那霉素（50μg/mL）PDA斜面培養(yǎng)基上，置于30℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，4℃保藏，備用。

2.4 液體發(fā)酵培養(yǎng) 將純化后的平板培養(yǎng)基中的菌株用2mL無菌蒸餾水沖洗制成孢子懸液，分別加入含有人參總皂苷的PDB培養(yǎng)基中（人參總皂苷的含量為0.4mg/mL，以相同濃度及體積的人參總皂苷溶液的無菌株液體培養(yǎng)基作為空白對(duì)照），置于30℃，160r/min[18～20]條件下全溫振蕩器搖晃12d。培養(yǎng)48h后，每隔24h取發(fā)酵液，用水飽和正丁醇V∶V=1∶1萃取，6000r/min離心10min，取上清液，備用。

2.5 薄層色譜初步鑒定活性菌株 層析條件：硅膠板GF254，100×100mm;展開劑：三氯甲烷∶甲醇=3∶1，臨用前配制。取2.4項(xiàng)下制備的上清液，用微量點(diǎn)樣器分別定量吸取對(duì)照品及供試品溶液，在離層析板邊緣1.5cm處精確點(diǎn)樣，點(diǎn)于同一硅膠板，展開劑展開，吹干溶劑，噴10%硫酸乙醇溶液，110℃均勻加熱10min至斑點(diǎn)顯色清晰[21，22]。置于日光與紫外燈光365nm下分別驗(yàn)視，通過與空白對(duì)照人參皂苷所顯示的斑點(diǎn)對(duì)比判斷經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后樣品中所含皂苷成分的轉(zhuǎn)化情況。

2.6 紫外分光光度法檢測(cè)活性菌株轉(zhuǎn)化率 人參總皂苷含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密稱量人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.5mg/mL）0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35mL于試管中，60℃水浴鍋中蒸干，加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸、0.8mL高氯酸溶液，水浴鍋中加熱15min，冷卻，加入5mL冰醋酸溶液，搖勻[23]。以相應(yīng)的試劑作空白對(duì)照，540nm處測(cè)吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品人參皂苷Re樣品量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。紫外分光光度法測(cè)定2.4項(xiàng)下所制備上清液的吸光度值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算人參皂苷的含量及轉(zhuǎn)化率。計(jì)算公式為：轉(zhuǎn)化率（%）=（樣品量-空白樣品量）/空白樣品量×100。

3 結(jié)果與分析

3.1 菌種的純化 經(jīng)反復(fù)劃線培養(yǎng)從土壤稀釋液中篩選出22株菌種，通過觀察其形態(tài)、顏色，將其合并為8種菌株。其中，C1號(hào)菌株為淡黃色菌株，C2號(hào)菌株為白色菌株，C3號(hào)菌株為黃白色菌株，C4號(hào)菌株為青綠色菌株，Y5號(hào)菌株為青綠色菌株，Y6號(hào)菌株為白色菌株，H7號(hào)菌株為黃白色菌株，H8號(hào)菌株為青綠色菌株，如圖1所示。（以該地區(qū)的首字母進(jìn)行依次編號(hào)，C為吉林長(zhǎng)白山，Y為榆林鎮(zhèn)，H為懷化市，編號(hào)與圖一一對(duì)應(yīng)）。

3.2 薄層色譜分析活性菌株 發(fā)酵萃取液經(jīng)薄層層析（TLC），與空白對(duì)照比較，菌株C2、C3、C4、H8的部分斑點(diǎn)與空白對(duì)照對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)對(duì)比，明顯較其形狀大、顏色深，初步判斷該菌株具有轉(zhuǎn)化提高人參單體皂苷含量的活性。部分TLC結(jié)果如圖2所示?？瞻讓?duì)照、C1、C2、C3、C4、Y5、Y6、H7、H8編號(hào)與圖上編號(hào)一一對(duì)應(yīng)。

3.3 活性菌株的轉(zhuǎn)化率 人參總皂苷含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示，回歸方程為：Y=4.2624X+0.0269，R2=0.9996。結(jié)果顯示，人參皂苷Re在0.05～0.175mg范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。

采用紫外可見分光光度法，測(cè)定菌液上清液的吸光度值，計(jì)算各菌株對(duì)于人參總皂苷的轉(zhuǎn)化率，以培養(yǎng)天數(shù)為橫坐標(biāo)，以各菌株轉(zhuǎn)化率為縱坐標(biāo)，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，自吉林長(zhǎng)白山鮮參根際土壤中分離出的1株菌株C4對(duì)人參總皂苷的轉(zhuǎn)化率達(dá)28.92%。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株C1轉(zhuǎn)化率逐漸升高，第6天達(dá)到最高值為24.41%，之后轉(zhuǎn)化率逐漸下降;菌株C2第4天轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高值為21.53%，之后轉(zhuǎn)化率下降，人參皂苷被分解;菌株C3、Y5、Y6、H7轉(zhuǎn)化率不高，菌株H8前7d趨于平穩(wěn)轉(zhuǎn)化，而在第9天達(dá)到轉(zhuǎn)化最高值為25.89%，之后幾天轉(zhuǎn)化率卻急速下降，而菌株C4的轉(zhuǎn)化能力較為穩(wěn)定且第11天轉(zhuǎn)化率最高，為28.92%。

4 結(jié)論與展望

4.1 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)從鮮參根際土壤中最終篩選出8株真菌，TLC法初步判斷出，具有轉(zhuǎn)化人參皂苷能力的活性菌株有4株，其中菌株C4經(jīng)進(jìn)一步采用紫外分光光度法檢測(cè)其總皂苷轉(zhuǎn)化率最高為28.92%。

4.2 展望 本實(shí)驗(yàn)通過紫外分光光度法檢測(cè)菌株發(fā)酵液的吸光度，僅能判斷人參總皂苷的含量變化，而采用TLC法初步判斷人參皂苷的含量變化結(jié)果顯示，與空白對(duì)照比較，部分單體皂苷斑點(diǎn)顏色明顯加深，說明該菌株有定向轉(zhuǎn)化單體人參皂苷的活性，應(yīng)繼續(xù)采用高效液相色譜（HPLC）對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行分析，確定對(duì)何種單體皂苷定向轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化率。最后，應(yīng)進(jìn)一步對(duì)活性菌株的培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間等發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)化率。

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（責(zé)編：張宏民）