降膽固醇活性肽檢測方法的研究進(jìn)展

陳丹陽 韓濤

摘 要：綜述近年來國內(nèi)外膽固醇以及具有降膽固醇活性的小分子肽在體內(nèi)和體外的檢測方法，為研究膽固醇代謝和降膽固醇活性小分子肽的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：膽固醇;活性肽;作用機(jī)理;檢測方法;代謝

降膽固醇肽主要是通過抑制膽固醇的合成、吸收，使其成為不溶物排出體外，或者加快膽固醇分解代謝途徑來降低膽固醇在體內(nèi)的含量。目前，膽固醇的檢測方法很多，而研究膽固醇的檢測方法是尋找和利用降膽固醇物質(zhì)最基礎(chǔ)的工作，人們得到了體內(nèi)血清多項(xiàng)指標(biāo)的檢測，但體內(nèi)方法普遍操作繁瑣且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以對體外檢測也做了大量的相關(guān)研究，建立了相關(guān)模型檢測方法。但是降膽固醇肽的作用機(jī)理，人們?nèi)匀蝗狈ν耆恼J(rèn)識，資料顯示[1-10]，應(yīng)用不同的作用機(jī)理得到不同的模型，如膽酸鹽結(jié)合劑法、模擬膽汁膠束法、3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）抑制劑、?；o酶A-膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（Acyl-coenzyme A-cholesterol Acyltransferase，ACAT）抑制劑、低密度脂蛋白受體（Low-density Lipoprotein，LDLR）模型、Caco-2細(xì)胞（克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞）模型[11-12]等。

本文根據(jù)前人推測的降膽固醇活性物質(zhì)的作用機(jī)理，探討了近年來國內(nèi)外膽固醇和具有降膽固醇活性的小分子肽的檢測方法，為降膽固醇活性肽檢測方法的研究提供參考。

1 體內(nèi)降膽固醇肽的檢測方法

研究動物體內(nèi)檢測膽固醇的方法，可明確膽固醇的代謝途徑，便于探索降膽固醇活性物質(zhì)的作用機(jī)理，方便進(jìn)行安全和試驗(yàn)效果的評價(jià)。膽固醇在體內(nèi)不溶于水，需要通過主動運(yùn)輸與脂蛋白結(jié)合，才能進(jìn)入血液和體內(nèi)循環(huán)。脂蛋白常見的包括極低密度脂蛋白（VLDL）、低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）[13]。VLDL在肝臟內(nèi)合成，是機(jī)體轉(zhuǎn)運(yùn)內(nèi)源性甘油三酯的重要形式，當(dāng)VLDL明顯升高時(shí)，甘油三酯（TG）也相應(yīng)升高，膽固醇含量增加，但VLDL在體內(nèi)含量較少且主要是影響TG的轉(zhuǎn)運(yùn)，故對膽固醇的影響不大;LDL是將肝臟合成的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到全身組織的主要形式，膽固醇含量最高，故LDL增高時(shí)，血液中膽固醇總量必然增高;HDL顆粒較小，蛋白質(zhì)含量最高，能比較自由地出入動脈，可把動脈壁上的膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟中進(jìn)行代謝后排出體外，所以HDL的減少就意味著膽固醇總量的增高。

金宗鐮等[14]提出了在臨床上測量降脂/膽固醇試驗(yàn)的7個(gè)指標(biāo)，包括：（1）血清總膽固醇（TC）含量。（2）血清總TG含量，TG是人體內(nèi)含量最多的脂類，大多數(shù)組織器官通過其分解產(chǎn)物供給能量。（3）HMG-CoA還原酶活性，血清中膽固醇多來自肝臟合成，而HMG-CoA還原酶是肝細(xì)胞生物合成膽固醇過程中的主要限速酶，該步驟是膽固醇前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為膽固醇的限速點(diǎn)，催化生成甲羥戊酸對膽固醇的合成起調(diào)節(jié)控制作用。（4）卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）活性，由肝臟合成，在血液中與高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）發(fā)生催化反應(yīng)，形成膽固醇酯，使膽固醇排出體外或進(jìn)行體內(nèi)吸收轉(zhuǎn)化。（5）HDL-C含量，是進(jìn)行臨床檢查血清的檢測手段，包括磷鎢酸沉淀法（CPAT/MgCl2 ）、多聚陰離子（化學(xué)）遮蔽法（PPD）和膽固醇脂酶和膽固醇氧化酶等酶修飾法（PGME）[15]。（6）低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）含量，臨床常用方法有Friedewald公式（測定空腹樣本）、均相法（特定的生化檢測試劑）、超速離心法（通過利用鹽調(diào)整溶液密度分離LDL）、電泳法、沉淀法、免疫分離法（抗體特異性吸附除LCL外的微粒）[16]。（7）動脈粥樣硬化指數(shù)（AI），包括TC-HDL-C/HDL-C 或 LDL-C/HDL-C，其升高意味著血液內(nèi)LDL濃度增高，而HDL相對比例下降，患動脈粥樣硬化危險(xiǎn)增加。

據(jù)此推斷，一個(gè)降膽固醇作用的功能性肽，應(yīng)能降低血清中TC和TG含量，降低AI，提高LCAT活性，增加HDL含量，降低LDL含量，或是HMG-CoA還原酶抑制劑。

選擇體內(nèi)檢測方法，一般采用動物實(shí)驗(yàn)的方法，建造模擬高脂模型，而后連續(xù)灌喂試驗(yàn)品數(shù)周，觀察各項(xiàng)指標(biāo)的變化，在此基礎(chǔ)上再進(jìn)行人體試食實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行綜合評價(jià)。Hori 等[17]曾進(jìn)行過大豆水解物的人體試食實(shí)驗(yàn)，受試者試食大豆水解物或酪蛋白水解物（空白對照），研究包括為期2周的預(yù)喂養(yǎng)期和3個(gè)月的喂養(yǎng)期;3個(gè)月后，受試者血清TC明顯下降，LDL-C顯著降低，LDL-C/HDL-C（AI）也顯著降低;但試食實(shí)驗(yàn)方法需要較為復(fù)雜的前處理和長時(shí)間喂養(yǎng)。姚余祥等[18]對大鼠進(jìn)行試食實(shí)驗(yàn)，高脂大鼠一組喂食鷹嘴豆多肽，另一組喂食等量蒸餾水（空白對照），數(shù)周后，喂食鷹嘴豆多肽可降低高脂大鼠TC含量（22.39%），實(shí)驗(yàn)中沒有做LCAT活性、HDL-C含量、LDL-C含量、HMG-CoA還原酶活性等的測定。白利峰等[19]研究表明，扇貝邊多肽提取物具有降低TC、TG、LDL-C的作用，有助于加速膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)膽固醇的肝臟代謝，從而增加膽固醇的體外排出。歐成坤等[20]在小鼠實(shí)驗(yàn)中檢測血清中的TG、TC、HDL-C、LDL-C的含量，證明了牡蠣多肽降膽固醇的能力。在紫菜多肽、醋粉、益生乳酸菌、大豆多肽[21-26]研究中均采用動物實(shí)驗(yàn)，建立高膽固醇組模型檢測血清中7個(gè)指標(biāo)，結(jié)果均有降膽固醇功效。由于HMG-CoA還原酶是肝細(xì)胞生物合成膽固醇過程中的主要限速酶，其活性的體外檢測是評定降膽固醇活性肽的重要方法;方法中需要體外提取HMG-CoA還原酶測量活性和純度，此操作有一定難度且提純純度不高，目前還沒有找到方便快捷的解決辦法;測定HMG-CoA還原酶抑制活性有分光光度計(jì)法、碳元素標(biāo)記法、小鼠喂食法、HPLC法4種方法，其中HPLC原理與分光光度計(jì)法一樣，HMG-CoA還原酶與底物NADPH反應(yīng)，底物反應(yīng)量減少，計(jì)算HMG-CoA還原酶的抑制率，但反應(yīng)體系微小，容易產(chǎn)生誤差。于剛等[27]建立了HPLC測定HMG-CoA還原酶活性的方法，NADPH濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回收率高，靈敏度高，檢出限極低，方法準(zhǔn)確度高，但實(shí)用性較低，需要較為復(fù)雜的前處理。Pak 等[28]在胃蛋白酶水解的大豆球蛋白中發(fā)現(xiàn)具有 HMG-CoA 還原酶抑制活性的降膽固醇活性肽，測定其分子量為755.2 Da，氨基酸序列為Ile-Ala-Val-Pro-Gly-Glu-Val-Ala，重復(fù)性較高，特異性強(qiáng)。梁婧婧等[29-33]在甘薯糖蛋白降膽固醇研究中，以大鼠為材料，測定血清TC、血清總TG、HDL-C、LDL-C、載脂蛋白A、載脂蛋白B、LCAT活性，并測定肝臟勻漿液HMG-CoA還原酶的活性。高學(xué)飛等[34-35]采用大鼠喂食的動物模型實(shí)驗(yàn)研究乳清降膽固醇功效，測定了TG、TC、HDL等指標(biāo)，以及肝臟NADPH，得到了降低HMG-CoA還原酶活性17.25%的乳清肽。Lin等[36]采用噬菌體技術(shù)篩選并得到人HMG-CoA還原酶抑制劑來降低人體內(nèi)膽固醇，發(fā)現(xiàn)四肽Pro-Met-Ala-Ser有良好的HMG-CoA還原酶抑制劑效果，可能是一個(gè)先導(dǎo)化合物開發(fā)的降膽固醇藥物，具有良好的特異性和實(shí)效性。Marques等[37]在得到豇豆蛋白質(zhì)水解物之后，先通過模擬膽汁膠束溶液方法和體外模擬胃腸道消化環(huán)境，得到小于3 000Da的高降膽固醇肽，后經(jīng)羥甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMG-CoA還原酶）試驗(yàn)，得到高抑制劑活性的五肽Gly-Cys-Thr-Leu-Asn，該研究體外檢測和HMG-CoA還原酶方法并行，前期減少了篩選時(shí)間，實(shí)用性較高;后期方法增強(qiáng)了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密性，且驗(yàn)證了五肽的降膽固醇的原理。

膽固醇酯化是影響血液中膽固醇水平的又一重要因素，該途徑中起主要作用的有2種酶，即LCAT和ACAT。腸肝循環(huán)是機(jī)體對內(nèi)源性膽固醇重吸收的必經(jīng)過程，對血液膽固醇水平有重要影響。膽固醇經(jīng)7α-羥化酶（Cholesterol 7 α-hydroxylase，CYP7A1）經(jīng)多步反應(yīng)生成初級膽汁酸，CYP7A1在此反應(yīng)過程中是限速酶，故CYP7AI基因表達(dá)量的增加或酶活性增大都會促進(jìn)膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸而排出體外，從而減少體內(nèi)膽固醇的積累[38]。武金霞等[39]利用CYP7A1基因表達(dá)產(chǎn)物量的變化，驗(yàn)證蚯蚓凍干粉降膽固醇的機(jī)理。Caco-2細(xì)胞模型可模擬小腸細(xì)胞的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，可研究多肽的腸道代謝，具有良好的線性結(jié)果和準(zhǔn)確性。Nagaoka等[40]采用Caco-2細(xì)胞模型及高脂動物模型研究了乳源肽影響膽固醇吸收的機(jī)理。五肽Ile-Ile-Ala-Glu-Lys可降低體內(nèi)膽固醇含量。但動物模型用時(shí)較長。使用細(xì)胞模型的方法，擁有體內(nèi)方法易于研究降膽固醇肽的作用機(jī)理、代謝途徑，打破了體內(nèi)培養(yǎng)方法時(shí)間長，影響因素復(fù)雜的壁壘，但該方法復(fù)雜且穩(wěn)定性、重復(fù)性較差，價(jià)格相對昂貴，需要尋找相對便捷的方法。

體內(nèi)檢測方法可研究多肽降膽固醇作用，方法較為成熟，準(zhǔn)確度高，但耗時(shí)較長，且花費(fèi)較高，需要較為苛刻的檢測條件，費(fèi)人費(fèi)力且不夠便捷。在功能的體內(nèi)研究前，通常先采用體外方法進(jìn)行初步檢測篩選。

2 體外降膽固醇肽的檢測方法

根據(jù)推測的作用機(jī)理，確立了體外模型中檢測膽固醇和膽酸鹽含量的變化，可簡單直觀地顯示出降膽固醇能力，特點(diǎn)是快速、高效、成本低，適用于動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)之前。

2.1 體外膽酸鹽螯合的降膽固醇檢測方法

方法的原理是通過小肽結(jié)合膽酸鹽以降低腸道對膽固醇的吸收。人體中約1/2的膽固醇是通過合成膽汁酸而被代謝分解的[12]，如果小肽可在小腸內(nèi)與膽酸結(jié)合，形成不溶性化合物，就可阻止膽汁酸的重吸收;另外，由于膽汁酸的合成是以膽固醇為底物，若膽汁酸能被更多的排出體外，就能使血液中更多的膽固醇代謝為膽汁酸來維持正常的消化吸收，從而降低血液中膽固醇水平。膽汁酸分為兩類[12]：初級膽汁酸和次級膽汁酸。常見的有膽酸、鵝脫氧膽酸、?；悄懰帷⒏拾冰Z脫氧膽酸，后兩種是與鈉離子或鉀離子結(jié)合存在?？紒硐┌飞┦悄壳芭R床用來治療這類高膽固醇血癥的治療手段，主要成分考來烯胺是陰離子交換樹脂類膽汁酸鹽結(jié)合劑的一種[41]，在腸道中與膽汁酸結(jié)合成不溶物，使膽汁酸不可利用于重吸收，隨后被排除體外;但考來烯胺抑制了某些維生素在胃中的吸收，有時(shí)會出現(xiàn)惡心、嘔吐、便秘等癥狀。

膽酸鹽體外檢測方法一般分為紫外分光光度法和高效液相色譜法。紫外分光光度法分為比色硫酸法和糠醛比色法。比色硫酸法是膽酸鹽分子與硫酸反應(yīng)后形成酚類，經(jīng)過比色后在377～390nm會出現(xiàn)特征吸收峰，測得膽酸鹽含量。江錕等[42]通過胰蛋白酶酶解鱸魚蛋白制備高活性的降膽固醇肽，利用硫酸比色法測定其降膽固醇能力，分離純化后得到小于1 400 Da的小肽組分，方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度好和干擾較少，特異性較好，但檢出限較高，精密度較差?？啡┍壬ㄊ强啡┓肿拥聂然跐饬蛩岽呋屡c膽汁酸分子的羥基發(fā)生縮合反應(yīng)，對反應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行紫外掃描時(shí)，膽汁酸分子在550～620nm的范圍內(nèi)產(chǎn)生明顯的特征吸收峰，可進(jìn)行膽汁酸鹽含量測定。許多研究采用此方法進(jìn)行膽酸鹽含量檢測，操作簡單可行，不需要大型儀器，快捷高效，但穩(wěn)定性和重現(xiàn)性與比色硫酸法比稍差。周小理等[43]在苦蕎的體外膽酸鹽研究中利用糠醛比色法，建立了膽酸鹽的標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合度較高，在較寬的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，并以膽酸鈉、脫氧膽酸鈉和牛磺膽酸鈉為材料，證實(shí)了苦蕎有結(jié)合膽酸鹽能力，苦蕎的有效成分具有降膽固醇的作用。此方法后經(jīng)黃昆[44]在山杏仁制備降膽固醇肽中證實(shí)可行。宋玲鈺等[2]采用糠醛比色法制備花生降膽固醇肽，并將其應(yīng)用于飲料開發(fā)中。劉珊珊等[45]使用糠醛比色法測人工牛黃中的膽酸含量，發(fā)現(xiàn)測定的糠醛比色法結(jié)果偏高，在樣品比色過程中增設(shè)一個(gè)糠醛空白，可消除糠醛和硫酸反應(yīng)生成的干擾，抗干擾能力大大加強(qiáng)，改進(jìn)后結(jié)果更加直觀準(zhǔn)確且可靠，方法簡便，可定性測量，回收率高，但不能進(jìn)行定量測量，故現(xiàn)在的方法均加有糠醛空白對照。

高效液相色譜法被廣泛應(yīng)用于膽固醇含量的測定，靈敏度高、準(zhǔn)確度高、檢出限低、具有較高的穩(wěn)定性，不僅可進(jìn)行定性測定，還可做含量較低的定量檢測;HPLC法重現(xiàn)性好但試驗(yàn)材料前處理復(fù)雜，時(shí)間稍長，方法在2016年納入國標(biāo)中[46]（GB 5009.128—2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膽固醇的測定）。李貴興等[47]利用RP-HPLC 測定血清中膽汁酸含量，結(jié)果表明，該方法在膽汁酸濃度100μmol/L內(nèi)時(shí)具有良好的線性范圍，準(zhǔn)確度高，精密性良好，最低檢出限約為3μmol/L。Lee等[48]釆用RP-HPLC和毛細(xì)管電泳的方法測量血清樣品中的膽汁酸濃度，比較了兩種方法測定膽汁酸含量差異，發(fā)現(xiàn)兩種方法均可靠可行，RP-HPLC方法檢出限更低，靈敏度更高，但普通定量檢測毛細(xì)管電泳方法時(shí)間短，價(jià)格低，故兩種方法結(jié)合使用，都可用來研究血清中膽固醇的變化。

2.2 體外模擬膽汁膠束溶液的降膽固醇檢測方法

方法的原理是膽固醇進(jìn)入人體胃腸道后，在膽鹽的乳化作用下與其他脂類混合形成膠束溶液，而膽固醇只有溶于混合膠束，才會被運(yùn)至小腸絨毛進(jìn)行吸收，因此，使膽固醇溶于膠束溶液是膽固醇吸收的關(guān)鍵。體外模擬的人體腸道，用高速或者超聲波乳化的方法制備出一種人造的膽汁膠束溶液。多肽能降低膽固醇在油相和膠束相中的溶解度，與膽固醇競爭進(jìn)入膠束溶液，競爭混合膠束的空間并取代膽固醇，使膽固醇不能溶于膠束溶液，干擾其吸收，可初步測定其降膽固醇的能力[49-50]。

體外模擬膽汁膠束溶液檢測方法已沿用40年，由Nagaoka第一次報(bào)道，該方法關(guān)鍵在于膠束溶液的制備以及通過超高速離心破壞膠束溶液得到未被乳化的膽固醇，測定抑制率。根據(jù)Nagaoka[40，51]方法，膠束溶液體系中含有10 mmol/L?；悄懰徕c溶液、2 mmol/L膽固醇、5 mmol/L油酸、pH為7.4的15mmol/L的磷酸緩沖液、132 mmol/L NaCl溶液、5g/L的蛋白水解物，混勻后將混合物高速或者超聲乳化;將混合物在37℃下培養(yǎng)24 h后超速離心16 000r/min 60min，取上清測定膽固醇含量。他們將乳球蛋白通過胰蛋白酶水解，利用膽汁膠束溶液方法測定其降膽固醇能力，最后從中分離純化得到了降血脂多肽段Ile-Ile-Ala-Glu-Lys[52]，為后人檢測降膽固醇肽提供方法。

王才立等[53]運(yùn)用鄰苯二甲醛比色法對制備的小麥胚芽肽進(jìn)行了降膽固醇活性的測定，結(jié)果表明，分子量越低，對膽固醇抑制作用越明顯，方法簡單易行，重現(xiàn)性好，但模擬膠束溶液時(shí)間較長，需要恒溫恒濕振蕩過夜。劉恩岐等[54-55]利用大孔吸附樹脂乙醇分級洗脫的方法分離純化黑豆肽，利用膽汁膠束溶液-硫酸鐵比色方法測定降膽固醇活性，得到降膽固醇肽中都含有Pro且位于N端之外的位點(diǎn)上的結(jié)論，方法操作較為簡單，且準(zhǔn)確度較高，但不能進(jìn)行微量檢測，檢測成本低。莊建鵬等[56]利用大孔吸附樹脂乙醇分級洗脫的方法分離純化乳清蛋白肽，利用膽汁膠束溶液方法測定降膽固醇活性，優(yōu)化了膠束溶液的配制方法，相對靈敏度較高，線性良好。蔣琛等[57]、姚余祥等[58]分別以乳清和鷹嘴豆為原料，酶解制備降膽固醇肽，利用膽汁膠束溶液方法測定降膽固醇活性，得到膽固醇抑制率18.21%的乳清蛋白肽和71.55%的鷹嘴豆肽，驗(yàn)證了膽汁膠束溶液方法具有較高的準(zhǔn)確度、靈敏度和回收率，檢測限與膽酸鹽螯合方法相比較低。鄭睿等[59]在制備亞麻籽降膽固醇肽時(shí)采用膽汁膠束溶液方法，通過比色方法驗(yàn)證其降膽固醇的能力以及通過GC-MS得到降膽固醇肽鏈結(jié)構(gòu)一般為Pro含量高、疏水氨基酸比例含量高、N末端為Arg等結(jié)論。Zhong等[60]采用體外模擬膽汁膠束方法進(jìn)行了大豆降膽固醇活性肽的分離純化，得到了具有顯著降低膽固醇活性肽組分 Try-Gly-Ala-Pro- Ser-Leu。Pedroche等[61]通過體外模擬膽汁膠束方法，從埃塞俄比亞芥菜中也得到了分子量在1 400～1 800 Da之間的具有顯著降低膽固醇活性小肽。Lin 等[62]在文蛤的內(nèi)臟肌肉部分（包括內(nèi)臟）得到具有較高的膽汁酸結(jié)合能力和較大的體外膽固醇膠束溶解度的降膽固醇小肽（Val- Lys-Pro和Val-Lys-Lys）。Francisco等[63]在油麻藤肽對膽固醇膠束溶解度的抑制率時(shí)發(fā)現(xiàn)，油麻藤肽的抑制率在0.24%～0.47%之間，表明肽的生物活性的因素由其疏水性、大小和氨基酸序列決定。

3 展望

對天然蛋白源的降膽固醇活性肽的研究在逐步開展，檢測限速酶活性或者檢測基因表達(dá)量是今后研究的方向。試驗(yàn)技術(shù)的不斷發(fā)展，將會進(jìn)一步提高方法的可靠性、準(zhǔn)確性、精密性，縮短時(shí)間，減少費(fèi)用。

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Abstract：Research progress in the detection methods of cholesterol metabolism and hypocholesterolemic peptides，in vivo or in vitro，was reviewed to provide scientific reference for research on cholesterol metabolism and hypocholesterolemic peptides.

Keywords：cholesterol;peptide;mechanism of action;detection method;metabolism

（責(zé)任編輯 唐建敏）