速生白榆的組織培養(yǎng)與快速繁殖

孫紅英　辛全偉　羅海凌　馬志慧　嚴(yán)少娟

摘要：? 該文以速生白榆半木質(zhì)化枝條為外植體，使用75%的酒精和0.1%HgCl2消毒處理，外植體經(jīng)過啟動培養(yǎng)后，在增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，將叢生芽切成單株進(jìn)行生根誘導(dǎo)，最終建立起成熟的速生白榆組培快繁體系。結(jié)果表明：外植體最佳消毒處理組合為75%的酒精處理50 s+0.1% HgCl2處理8 min，外植體污染率為17.3%，成活率為78%;將消毒處理過的外植體接種到啟動培養(yǎng)基中，培養(yǎng)25 d，最終篩選出最適白榆外植體啟動的培養(yǎng)基為MS + 1.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 IBA + 30 g·L-1蔗糖 + 6.5 g·L-1瓊脂，啟動率高達(dá)87.5%;將經(jīng)過啟動培養(yǎng)后的外植體腋芽切下，接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，最終篩選出最佳增殖培養(yǎng)基為MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 KT + 0.1 mg·L-1 IBA + 30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂，繼代周期25 d，增殖系數(shù)達(dá)6.2;將叢生芽切成單株，接種到生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，篩選出最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS + 0.1 mg·L-1 IBA + 0.1 mg·L-1 IAA+30 g·L-1蔗糖+6.5 g·L-1瓊脂，生根誘導(dǎo)30 d，生根率達(dá)97%。將生根苗在室外煉苗后，移栽到珍珠巖∶蛭石∶泥炭土體積比為1∶1∶1的混合基質(zhì)中，成活率在90%以上。較高的增殖系數(shù)、生根率和移栽成活率可以降低生產(chǎn)成本，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)工廠化育苗。

關(guān)鍵詞： 速生白榆， 組織培養(yǎng)， 最佳培養(yǎng)基， 快速繁殖

中圖分類號：? Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2019）12-1593-06

作者簡介： 孫紅英（1983-），女，山東濰坊人，博士，助理研究員，主要從事生物多樣性與生態(tài)系統(tǒng)功能、植物生理生態(tài)、植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究、推廣與教學(xué)，（E-mail） shy198319@126.com。

Abstract：? The semi-lignified branches of fast-growing Ulmus pumila were used as explants， 75% alcohol and 0.1% HgCl2 were used for disinfection. After initiation culture， the multiple shoots were first induced in the enrichment medium， and then cut into individual plants for rooting induction， and finally? a tissue culture and rapid propagation system was established. The results showed that the optimal disinfection treatment combination of explants was 75% alcohol treatment for 50 s + 0.1% HgCl2 treatment for 8 min， the contamination rate of explants was 17.3% and the survival rate was 78%. The sterilized explants were inoculated into the initiation medium and cultured for 25 d， and the most suitable medium for start-up of the explants was found to be MS + 1.0 mg L-1 6-BA + 0.1 mg L-1 IBA + 30 g L-1 sucrose + 6.5 g L-1 AGAR， with initiation rate up to 87.5%. After the initial culture， axillary buds of the explants were cut off and inoculated into the enrichment medium for multiple shoots induction. Finally， the optimal enrichment medium was selected as MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 KT + 0.1 mg·L-1 IBA + 30 g·L-1 sucrose + 6.5 g·L-1 AGAR， and the subculture cycle was 25 d with the increment coefficient as high as 6.2. The best rooting medium was 1/2 MS + 0.1 mg·L-1? IBA + 0.1 mg·L-1 IAA+ 30 g·L-1 sucrose + 6.5 g·L-1 AGAR， and rooting was induced for 30 d with a rooting rate of 97%. After seedling adaptation， the tissue culture seedlings of U. pumila were transplanted to mixed matrix with perlite∶vermiculite∶peat （volume ratio 1∶1∶1）， and the survival rate reached above 90%. Higher increment coefficient， rooting rate and transplant survival rate can reduce production cost and realize factory seedling breeding.

Key words： fast-growing Ulmus pumila， tissue culture， optimal medium， rapid propagation

白榆（Ulmus pumila）是榆科榆屬落葉喬木，也是我國分布最廣的榆屬樹種，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值（王靜華等，2009a，b）。白榆具有樹干通直、樹形高大、綠蔭較濃、適應(yīng)性強(qiáng)、生長快等特點(diǎn)， 在林業(yè)上是用于城市綠化、營造防風(fēng)林、水土保持林和鹽堿地造林的主要樹種之一（傅立國，1980;蘇丹等，2017）。普通白榆一年生實(shí)生苗生長高度約1.5 m，而速生白榆一年生長高度可達(dá)3 m（朱建峰等，2016）。種植速生白榆豐產(chǎn)林，年胸徑生長量在3.5 cm以上，6年生胸徑平均為22 cm，最大胸徑可達(dá)28 cm（朱建峰等，2016）。

近年來，對白榆的研究注重種質(zhì)資源保存、雜交育種及實(shí)生苗選育、種源變異、分子遺傳和非常規(guī)育種等方面。針對白榆繁殖方面，嫁接技術(shù)較為成熟，將白榆接穗嫁接到圓冠榆、實(shí)生白榆苗和榆樹上，獲得完整的植株（蔣生平和高延林，2018）;白榆的扦插繁殖，使用不同生根劑處理當(dāng)年生嫩枝條，促進(jìn)白榆生根（劉啟虎等，2016），但僅在試驗(yàn)中成功，并未生產(chǎn)應(yīng)用。在白榆的組織培養(yǎng)研究方面有較少的報(bào)道，王靜華等（2009b）以白榆葉片誘導(dǎo)再生植株，但還存在再生芽誘導(dǎo)率低、玻璃化、組培苗生根困難等一系列問題尚未解決。針對上述問題，本研究以提高誘導(dǎo)率和生根率為目標(biāo)，建立較為成熟的速生白榆組培快繁體系，為白榆工廠化育苗提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

白榆（Ulmus pumila）采自山東東營苗圃基地。優(yōu)選無病蟲害、健壯的植株作為采穗母株，選取芽點(diǎn)飽滿、均勻、細(xì)長、半木質(zhì)化的枝條作為外植體材料，帶回組培室。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒將帶有腋芽的枝條切成0.5～1.5 cm，去掉葉片和葉柄，在流水中沖洗30 min，用柔軟毛刷清洗外植體表面后，拿到超凈工作臺上，先用2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min，再用75%的酒精處理30 s和50 s兩個梯度，最后用0.1%的HgCl2消毒4、8、12 min ，無菌水沖洗4～5遍后用無菌濾紙吸去外植體表面的水分，裝入無菌瓶中備用。每個處理105個莖段，重復(fù)3次。比較不同消毒時(shí)間的滅菌效果，統(tǒng)計(jì)污染率和成活率。

1.2.2 啟動培養(yǎng)采用以下6種培養(yǎng)基進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)：（1） MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 IBA;（2） MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 0.2 mg·L-1 IBA;（3） MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 0.3 mg·L-1 IBA;（4） MS + 1.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 IBA;（5） MS + 1.5 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 IBA;（6） MS + 2.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 IBA;以上各培養(yǎng)基均添加30 g·L-1蔗糖和6 g·L-1瓊脂，pH 5.8。每瓶接種1個外植體，每個處理75瓶，重復(fù)3次。培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度 （25 ± 3） ℃，光照時(shí)間12 h·d-1，光照強(qiáng)度3 500 lx，25 d后，觀察腋芽的生長情況，統(tǒng)計(jì)腋芽啟動率。

1.2.3 增殖培養(yǎng)以MS為基本培養(yǎng)基，采用L9 （34） 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，添加6-BA（0.1、0.5、1.0 mg·L-1）、IBA （0.1、0.2、0.3 mg·L-1）和IAA（0、0.1、0.2 mg·L-1）（表1）。接種25 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng)用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)生根培養(yǎng)基（表2），所用基本培養(yǎng)基為1/2 MS、3/4 MS、MS，所用促生根激素為IBA（0.1、0.2、0.3 mg·L-1）和IAA（0、0.1、0.2 mg·L-1）。選取經(jīng)過繼代培養(yǎng)后生長健壯、株高2 cm以上的無根苗，將其接種到上述培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況，計(jì)算生根率。

1.2.5 煉苗移栽首先，將生根培養(yǎng)30 d后的生根苗放到自然環(huán)境條件下，放置3～5 d，擰開組培瓶瓶蓋，放置2 d，定時(shí)進(jìn)行葉片噴水保濕，保證葉片伸展無卷葉焦葉，促使組培苗適應(yīng)自然環(huán)境條件。然后，將組培苗從瓶中取出，在清水中洗掉培養(yǎng)基，置于5‰ 的高錳酸鉀溶液中消毒3 min。最后，用自來水清洗干凈，移栽到珍珠巖∶蛭石∶泥炭土體積比為1∶1∶1的基質(zhì)中，定時(shí)淋水，30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率，移栽成活率=存活苗數(shù)/移栽苗數(shù)×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理分析

外植體污染率=污染個數(shù)/接種個數(shù)×100%;成活率=成活個數(shù)/接種個數(shù)×100%;啟動率=莖段萌芽數(shù)/接種后無菌莖段總數(shù)×100%;增殖系數(shù)=誘導(dǎo)后不定芽總數(shù)/原接種莖段總數(shù);生根率=生根個數(shù)/接種個數(shù)×100%。采用SPASS16.0和Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒

從表3可以看出，使用75%的酒精和0.1% HgCl2組合對白榆外植體進(jìn)行消毒處理，隨著消毒時(shí)間的延長，污染率逐漸降低（P<0.05）。其中，處理1消毒時(shí)間最短，處理6消毒時(shí)間最長，兩組消毒處理間的外植體污染率達(dá)到顯著差異（P<0.05）。處理6污染率最低，但消毒時(shí)間長對外植體的傷害較大，外植體的成活率僅有65.7%。因此，綜合白榆外植體的污染率和成活率，處理5（75%的酒精50 s + 0.1% HgCl2 8 min）具有較低的外植體污染率，較高的外植體成活率，為白榆外植體最佳消毒處理組合。

2.2 啟動培養(yǎng)

從表4可以看出，培養(yǎng)基（1）、（2）和（3）誘導(dǎo)的白榆外植體腋芽細(xì)弱且生長緩慢，這三種培養(yǎng)基不適合白榆外植體的啟動培養(yǎng)。培養(yǎng)基（5）和（6）誘導(dǎo)的腋芽雖然生長快，但玻璃化嚴(yán)重，葉片卷曲，并且外植體基部愈傷組織較大，因此，這兩種培養(yǎng)基不適合白榆外植體的腋芽誘導(dǎo)。培養(yǎng)基（4）對外植體的啟動率較高，且腋芽粗壯，生長較快。可見，最適合白榆外植體啟動為（4）號培養(yǎng)基，其外植體啟動率為87.5%，最終篩選出適合白榆外植體啟動的培養(yǎng)基為（4） MS + 1.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 IBA。

2.3 增殖培養(yǎng)

將啟動培養(yǎng)所獲得的腋芽切下，接種到增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行叢生芽的誘導(dǎo)。表5結(jié)果顯示，9個處理對白榆增殖有不同程度的影響，增殖系數(shù)在1.5～6.5之間。根據(jù)表5中的R值分析結(jié)果，6-BA在白榆增殖過程中作用最大，R值為3.5;之后依次是KT和IBA。從表6方差分析可以看出，在白榆繼代過程中，細(xì)胞分裂素6-BA對增殖系數(shù)影響最大，其F值171.438，在0.01水平達(dá)到顯著;其次為激動素KT，其F值為24.813，在0.05水平達(dá)到顯著;生長素IBA對白榆增殖系數(shù)無顯著影響。在所有不同的處理組合中， 4號培養(yǎng)基增殖系數(shù)最大，增殖系數(shù)6.2。因此，篩選出白榆苗繼代培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為MS + 0.5 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 + 0.1 mg·L-1 IBA。

2.4 生根培養(yǎng)

由表7極差分析可以得出，影響白榆組培苗生根的三個因素中，培養(yǎng)基類型最為重要，生長素IBA對白榆組培苗生根的作用次之，IAA的作用較小;由表8方差分析可知，培養(yǎng)基類型對白榆組培苗生根在0.01水平顯著，其F值847.459，在三因素中，對白榆組培苗生根起到重要作用;生長素IBA對白榆組培苗生根在0.05水平顯著，其F值為41.703;生長素IAA對白榆組培苗生根無顯著影響。綜合表7和表8的結(jié)果，最終篩選出白榆組培苗生根的最佳培養(yǎng)基為 （7） 1/2 MS + 0.1 mg·L-1?IBA + 0.1 mg·L-1 IAA，生根率達(dá)到97%。

2.5 煉苗移栽

移栽30 d后統(tǒng)計(jì)，白榆組培苗的移栽成活率在90%以上。移栽50 d左右，白榆組培苗葉片舒展變大，葉片深綠色，頂芽有新葉長出。

3討論

污染是組織培養(yǎng)過程中最先遇到的問題，能否成功獲得一定數(shù)量的無菌材料是植物組織培養(yǎng)成敗的第一步（李健等，2010）。消毒過程中使用單一的消毒劑雖然對外植體傷害較小，但消毒效果較差，通常多個消毒劑組合使用，會明顯降低外植體的污染率（謝羽等，2017）。本研究使用75%的酒精50 s + 0.1% HgCl2 8 min的組合，達(dá)到較好的消毒效果。下一步，可以針對白榆外植體消毒，使用2種及以上的消毒劑進(jìn)行正交組合，篩選更優(yōu)的消毒劑組合。

在植物離體快繁中，植物生長調(diào)節(jié)劑是培養(yǎng)基中的外源添加物（椰汁、香蕉、馬鈴薯等），細(xì)胞分裂素、生長素及組合對培養(yǎng)物的誘導(dǎo)分化起重要作用（吳秀燕和張鴿香，2017）。本研究通過研究不同濃度和激素組合（6-BA、KT和IBA）對白榆組培快繁的影響，其中 6-BA對白榆叢生芽誘導(dǎo)影響最大，低濃度雖然能誘導(dǎo)出叢生芽，但植株生長緩慢，增殖系數(shù)低;較高濃度6-BA誘導(dǎo)的叢生芽數(shù)量較多，但玻璃化較為嚴(yán)重，最終優(yōu)選6-BA使用濃度為0.5 mg·L-1。本研究在白榆增殖過程中，所使用6-BA出現(xiàn)的上述結(jié)果與王靜華等（2009b）結(jié)果一致。本研究進(jìn)一步印證了植物激素的兩重性，低濃度促進(jìn)生長，高濃度抑制生長。

在植物快速繁殖中， 培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的生長素有利于誘導(dǎo)生根 （Huang & Murashige， 1983）。生長素IBA對白榆組培苗生根誘導(dǎo)影響較大，最佳生根組合為1/2 MS + 0.1 mg·L-1 IBA + 0.1 mg·L-1 IAA，生根率達(dá)97%。在白榆生根過程中，本實(shí)驗(yàn)以MS為基本培養(yǎng)基，優(yōu)選出最佳生根配方。下一步研究，可以對比不同培養(yǎng)基類型，對白榆組培苗生根誘導(dǎo)，達(dá)到更高的生根率，優(yōu)化目前的生根配方。

綜上所述，本研究建立了成熟的速生白榆離體快繁體系，為白榆產(chǎn)業(yè)化快速育苗提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐，對速生白榆造林育苗提供一條高效的育苗手段，為苗木市場提供優(yōu)質(zhì)的白榆種苗。

參考文獻(xiàn)：

FU GL， 1980. Study of Chinese Elms? [J]. J NE For Inst， 3： 1-40.? [傅立國， 1980. 中國榆屬的研究 [J]. 東北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 3： 1-40.

HUANG LC， MURASHIGE T， 1983. Tissue culture investigations of bamboo. I. Callus cultures of Bambusa， Phyllostachys and Sasa [J]. Bot Bull Acad Sin， （24）： 31-52.

JIANG SP， GAO YL， 2018. Technique of grafting crown for white elm? [J]. For Sci Technol， 3： 84-85.? [蔣生平， 高延林， 2018. 白榆嫁接圓冠榆技術(shù) [J]. 林業(yè)科技， 3： 84-85. ]

LIU QH， BAO ZG， TAN HG， et al.， 2016. Study on cutting cutting propagation of five species of Ulmus pumila? [J]. Shandong For Sci Technol， 3： 46-47.? [劉啟虎， 包志剛， 譚好國， 等， 2016. 5份白榆種質(zhì)資源嫩枝扦插繁殖技術(shù)研究簡報(bào) [J]. 山東林業(yè)科技， 3： 46-47.]

LI J， LI JJ， WU CZ， et al.， 2010. Selection and sterilization of explant of Tripterygium wilfordii in tissue culture? [J]. J Centr S Univ For Technol， 30 （8）： 18-21.? [李健， 李建娟， 吳承幀， 等， 2010. 雷公藤組織培養(yǎng)外植體消毒和選擇 [J]. 中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)， 30 （8）： 18-21.]

WANG JH， HOU JS， LIU GL， 2009a. Study on tissue culture and leaf regeneration of two kinds of different provenances Siberian elm? [J]. Chin Agric Sci Bull， 25（5）： 110-115.? [王靜華， 侯建生， 劉桂林， 等， 2009a. 兩種不同種源地白榆的組織培養(yǎng)與葉片再生研究 [J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 25（5）： 110-115.]

WANG JH， HOU JS， LIU GL， et al.， 2009b. Tissue culture and plant regeneration from leaf of Siberian elm? [J]. J NW For Univ， 24 （5）： 74-77.? [王靜華， 侯建生， 劉桂林， 等， 2009b. 白榆的組織培養(yǎng)與葉片再生研究 [J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)， 24 （5）： 74-77.]

SU D， YIN XL， DONG Z， et al.， 2017. Response in growth and ionic distribution of elm clones under NaCl stress? [J]. J Beijing For Univ， 39 （5）： 48-57.? [蘇 丹， 殷小琳， 董智， 等， 2017. 白榆無性系生長特性及離子分布對NaCl脅迫的響應(yīng) [J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 39 （5）： 48-57.]

WU XY， ZHANG GX， 2017. Study on embryo culture and rapid propagation in vitro of Chionanthus virginicus? [J]. Plant Physiol J， 53 （2）： 227-233.? [吳秀燕，張鴿香， 2017. 美國流蘇離體胚的組織培養(yǎng)與快速繁殖 [J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 53 （2）： 227-233.]

XIE Y， XIA K， LI M， et al.， 2017. Effects of different angiosperms on callus induction and sterilization methods research? [J]. Mol Plant Breed， 15 （3） ： 1029-1034.? [謝羽， 夏凱， 黎敏， 等， 2017. 不同類被子植物組培快繁及其消毒方式的影響 [J]. 分子植物育種， 15（3） ： 1029-1034.]

ZHANG JF， LONG ZR， LIANG YT， 1991. Study on regenerated plants of new Ulmus pumila variety 74009 in vitro? [J]. Shandong For Sci Technol， 4： 18-21.? [張建鋒， 龍莊如， 梁玉堂， 1991. 白榆新品種74009離體培養(yǎng)再生植株的研究 [J]. 山東林業(yè)科技， 4： 18-21.]

ZHU JF， QIAO LQ， ZHANG HX， 2016. Research and utilization of Ulmus pumila and discussion and prospect on its variety improvement in China? [J]. World For Res， 29 （3）： 46-51.? [朱建峰， 喬來秋， 張華新， 2016. 白榆研究利用現(xiàn)狀及我國白榆良種化探討與展望 [J]. 世界林業(yè)研究， 29 （3）： 46-51.]