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    互葉白千層的快繁技術(shù)

    2015-07-31 21:02:13殷勤杜尚廣張青等
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年3期
    關(guān)鍵詞:快速繁殖正交試驗(yàn)生根

    殷勤 杜尚廣 張青等

    摘要:為研究出一套完整的互葉白千層快繁技術(shù)體系,以互葉白千層幼苗莖段為外植體,分別以誘導(dǎo)率、增殖倍數(shù)、生根率為指標(biāo),采用正交試驗(yàn)對(duì)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、叢生芽增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明,最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ 0.01%活性炭+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,誘導(dǎo)率為82.8%;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+0.25 mg/L 6-BA,增殖倍數(shù)為31倍;最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+30 g/L蔗糖+0.1 mg/L NAA,生根率達(dá)100%,移栽30 d后成活率達(dá)80%以上。研究結(jié)果為互葉白千層的工廠化育苗提供了技術(shù)參考。

    關(guān)鍵詞:互葉白千層;快速繁殖;正交試驗(yàn);芽誘導(dǎo);叢生芽增殖;生根

    中圖分類號(hào): Q945.51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2015)03-0020-04

    互葉白千層(Melaleuca alternifolia)為桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬 (Melateuca)常綠小喬木,原產(chǎn)于澳大利亞的新南威爾士州和新西蘭的部分地區(qū)[1],是近年我國(guó)成功引進(jìn)的高價(jià)值經(jīng)濟(jì)植物及綠化樹(shù)種。互葉白千層對(duì)污染物有很強(qiáng)的凈化能力[2-4],可用于構(gòu)建植物浮床[5]?;ト~白千層的新鮮枝葉和樹(shù)干提取的精油俗稱茶樹(shù)油,可以高效、無(wú)毒、無(wú)刺激地殺死人體皮膚表面的真菌和細(xì)菌[6-9],并對(duì)某些病毒也有抑制作用[10-11],是一種強(qiáng)效的抗菌劑[12-17]、殺蟲(chóng)劑[18-20]、芳香劑[21]、防腐劑[22],是不可多得的天然保健醫(yī)藥材料,廣泛應(yīng)用于制藥、日化、食品、香料等行業(yè)。因此,種植互葉白千層具有巨大的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益。

    目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)互葉白千層的研究主要集中在其精油的提取、成分分析及作用等方面[23-24],而對(duì)利用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行再生植株的研究較少,目前尚沒(méi)有完整的快繁技術(shù)體系。依據(jù)精油化學(xué)成分含量的不同,互葉白千層分為6種[25],其中僅松油醇-4型優(yōu)良品種提取的精油成分滿足國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)[26]。為獲得品種優(yōu)良的互葉白千層,使用種子繁殖多敗育,發(fā)芽率很低[27],且后代易產(chǎn)生變異,難以保持親本優(yōu)良性狀;扦插繁殖生根率雖高[28],但成活率較低[29]。組織培養(yǎng)既可以保持親本的優(yōu)良性狀,又可以將獲得的優(yōu)良株系快速推廣應(yīng)用于生產(chǎn),有望成為互葉白千層產(chǎn)業(yè)化育苗的主要繁殖手段。

    本試驗(yàn)以互葉白千層莖段為材料,進(jìn)行表面滅菌處理,對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基、生根培養(yǎng)基進(jìn)行篩選,并對(duì)試管苗馴化移栽,擬建立一套完整的互葉白千層快繁技術(shù)體系,為互葉白千層的優(yōu)株選育提供理論依據(jù),為其工廠化育苗提供技術(shù)參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    互葉白千層為溫室栽培植株,株高20 cm,由江西撫州市森源生物科技有限公司提供。

    1.2 儀器

    W-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司生產(chǎn)),LMQJ型立式滅菌鍋(山東新華醫(yī)療器械股份有限公司生產(chǎn)),JY2002電子分析天平(精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)),JA1003N電子天平(精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))。

    1.3 方法

    1.3.1 外植體的表面滅菌及預(yù)處理 培養(yǎng)60 d的溫室種植的互葉白千層幼苗,株高30 cm,在20 cm處去頂。30 d后,隨機(jī)剪取5 cm的幼苗莖段,剪去部分葉片,用洗衣粉液浸泡30 min,流水沖洗2 h;70%乙醇處理30 s,無(wú)菌水洗3次,然后用 0.1% HgCl2處理3 min,無(wú)菌水洗4次,待用;去掉莖段頂部,剪取約1 cm、含4~5個(gè)節(jié)點(diǎn)的莖段,接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。為了降低酚類物質(zhì)氧化褐變引起的生長(zhǎng)抑制,在第3 天將莖段轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中。

    1.3.2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用3因素4水平L16(43)正交試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表1。共16組固體培養(yǎng)基,每組8瓶,每瓶5個(gè)莖段;30 d后統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)芽的外植體數(shù)、芽數(shù),并計(jì)算誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率的計(jì)算公式如下:

    誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)×100%。

    1.3.3 增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用3因素4水平L16(43)正交試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表2。共16組液體培養(yǎng)基,每組16瓶,每瓶5個(gè)誘導(dǎo)出單芽的莖段;60 d后統(tǒng)計(jì)叢生芽數(shù),并計(jì)算增殖倍數(shù)。增殖倍數(shù)的計(jì)算公式如下:

    增殖倍數(shù)=叢生芽數(shù)÷接種的外植體數(shù)×100%。

    1.3.4 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化 采用4因素3水平L9(34)正交試驗(yàn)。各因素水平見(jiàn)表3。共9組固體培養(yǎng)基,每組10瓶,每瓶5個(gè)幼枝莖段;30 d后統(tǒng)計(jì)生根的外植體數(shù),并計(jì)算生根率。生根率的計(jì)算公式如下:

    生根率=生根的外植體數(shù)÷接種的外植體數(shù)×100%。

    1.3.5 移栽 生根培養(yǎng)30 d后,將試管苗轉(zhuǎn)移到室外煉苗,散射光光照培養(yǎng)10~20 d,當(dāng)組培苗抽高生長(zhǎng),木質(zhì)化程度加強(qiáng)時(shí),即可移栽。取出試管苗,清洗根部,再用0.1%高錳酸鉀溶液消毒30 s,自來(lái)水清洗除去殘留的高錳酸鉀,然后把試管苗移栽至含基質(zhì)(泥炭 ∶[KG-*3]珍珠巖=1 ∶[KG-*3]1)的花盆里,遮陽(yáng)網(wǎng)遮陽(yáng),將1 L的塑料飲料容器底部剪掉,罩在試管苗上,保持幼苗周?chē)鷿駶?rùn)。14 d后,遮陽(yáng)網(wǎng)部分移除,容器一側(cè)抬起以露出植物。再過(guò)7 d后,遮陽(yáng)網(wǎng)移除,移走容器。移栽30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

    1.4 培養(yǎng)條件

    溫度(25±2) ℃,光照12 h/d,光照強(qiáng)度2 500~3 000 lx。誘導(dǎo)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基,通過(guò)添加各種不同濃度的激素或蔗糖、MS成分減半進(jìn)行優(yōu)化;固體培養(yǎng)基中加7.0 g/L瓊脂,調(diào)pH值為5.8;液體培養(yǎng)基不加瓊脂,不調(diào)節(jié)pH值,實(shí)際測(cè)得pH值為5.2。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基的優(yōu)化

    互葉白千層莖段在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d,統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表4。極差分析表明,3個(gè)因素對(duì)互葉白千層芽誘導(dǎo)的影響大小依次為:NAA>活性炭6-BA。隨著NAA濃度的增加,誘導(dǎo)率呈下降趨勢(shì);當(dāng)活性炭濃度為0.01%、6-BA濃度為 0.1 mg/L、NAA 濃度為0.05 mg/L時(shí),誘導(dǎo)出芽數(shù)是2.46個(gè),誘導(dǎo)率是82.8%。方差分析表明,3個(gè)因素對(duì)誘導(dǎo)率及芽數(shù)無(wú)顯著影響(表5、表6)。

    芽誘導(dǎo)主要是已有芽原基在解除頂端優(yōu)勢(shì)之后的萌發(fā)。本試驗(yàn)結(jié)果表明,不同培養(yǎng)基對(duì)外植體的誘導(dǎo)率及芽數(shù)無(wú)顯著影響,最佳誘導(dǎo)效果的培養(yǎng)基為:MS+0.01%活性炭+0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA。

    2.2 增殖培養(yǎng)基的優(yōu)化

    互葉白千層芽誘導(dǎo)后在液體培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)60 d,增殖倍數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表7。極差分析表明,3個(gè)因素對(duì)互葉白千層芽增殖的影響大小依次為:NAA>6-BA>蔗糖。隨著NAA濃度的增加,增殖倍數(shù)呈下降趨勢(shì),當(dāng)NAA濃度為0時(shí)增殖倍數(shù)最高。隨著6-BA濃度的增加,增殖倍數(shù)先增大后減小,當(dāng)6-BA濃度達(dá)0.250 mg/L時(shí)增殖倍數(shù)最高,這可能是由于低濃度的6-BA促進(jìn)細(xì)胞分裂,而高濃度的6-BA則抑制細(xì)胞分裂。隨著蔗糖濃度的增加,增殖倍數(shù)先增大后減小,當(dāng)蔗糖濃度達(dá)30 g/L時(shí),增殖倍數(shù)最高。方差分析表明(表8),NAA對(duì)增殖倍數(shù)影響達(dá)顯著水平(P<0.05)?;ト~白千層芽增殖的最佳培養(yǎng)基組合為:MS+30 g/L蔗糖+ 025 mg/L 6-BA,增殖倍數(shù)達(dá)31倍。

    List等采用單因素試驗(yàn)獲得的增殖培養(yǎng)基為MS固體培養(yǎng)基+1.0 mg/L BA,培養(yǎng)時(shí)間為63 d,增殖倍數(shù)為5.5倍[30]。De Oliveira等同樣用單因素試驗(yàn)獲得的增殖培養(yǎng)基為MS液體培養(yǎng)基+0.25 mg/L BA,培養(yǎng)時(shí)間為56 d,增殖倍數(shù)為118倍[31]。樊吉尤等用不同激素組合進(jìn)行試驗(yàn),結(jié)果表明較好的激素組合是0.8 mg/L 6-BA+0.01 mg/L 2,4-D,增殖倍數(shù)為14.88倍[32]。本研究通過(guò)正交試驗(yàn),獲得了最佳的增殖培養(yǎng)基,增殖倍數(shù)達(dá)31倍,而且叢生芽較粗壯,呈深綠色(圖1-C),結(jié)果顯著好于已往報(bào)道。主要原因有:(1)互葉白千層通常生長(zhǎng)在沼澤中[33],喜酸性或微酸性土壤[34-35],本試驗(yàn)使用的液體培養(yǎng)基,pH值為5.2,適合其生長(zhǎng);(2)以往研究一般在培養(yǎng)基中僅添加NAA,本試驗(yàn)將其設(shè)定為因素之一,結(jié)果表明,NAA與增殖倍數(shù)呈負(fù)相關(guān),不加NAA的第6處理的培養(yǎng)基效果最佳;(3)本試驗(yàn)使用的是液體培養(yǎng)基,養(yǎng)分交換非常充分,營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可以更好地被吸收[31]。

    由表7可知,第8處理的培養(yǎng)基中外植體的增殖倍數(shù)為0,觀察發(fā)現(xiàn)該組培養(yǎng)基中的外植體無(wú)明顯生長(zhǎng),逐漸變成褐色,可能原因是激素配比不利于芽的生長(zhǎng),同時(shí)液體培養(yǎng)基中氧氣含量比較低,外植體易發(fā)生缺氧壞死。

    2.3 生根培養(yǎng)基的優(yōu)化

    生根培養(yǎng)30 d后,生根率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表9。極差分析表明,對(duì)互葉白千層生根率的影響大小依次是:NAA>基本培養(yǎng)基=IAA>蔗糖。由表9可知,所有培養(yǎng)基的生根率都在80%以上,第6處理的生根率和根系發(fā)達(dá)程度最高。觀察可知,該處理試管苗根系發(fā)達(dá),有3級(jí)根,一級(jí)根上生成粗細(xì)不同的二級(jí)根,并且在粗二級(jí)根上形成三級(jí)根,各級(jí)根上均有少量根毛;在以后煉苗時(shí)發(fā)現(xiàn),這樣的根系更加有利于移栽成活。因此,最佳生根培養(yǎng)基是含30 g/L蔗糖、0.1 mg/L NAA和 0 mg/L IAA的1/2MS培養(yǎng)基。

    2.4 移栽

    幼苗移栽是試管苗從實(shí)驗(yàn)室適宜生長(zhǎng)環(huán)境到復(fù)雜外界環(huán)境,并發(fā)生從異養(yǎng)到自養(yǎng)的轉(zhuǎn)變過(guò)程。因此,移栽前要進(jìn)行煉苗,讓試管苗更好地適應(yīng)自然環(huán)境。在本試驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)煉苗,幼苗的地上、地下部分均具有較強(qiáng)木質(zhì)化,移栽成活率達(dá)80%以上;其中,莖部粗壯、葉片濃綠、根系發(fā)達(dá)的幼苗,移栽時(shí)更易成活。

    3 結(jié)論

    通過(guò)正交試驗(yàn)得出互葉白千層外植體的最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.01%AC +0.1 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA,誘導(dǎo)率達(dá)82.8%;最佳增殖培養(yǎng)基為MS+30 g/L蔗糖+0.25 mg/L 6-BA,增殖倍數(shù)達(dá)31倍;最佳生根培養(yǎng)基為 1/2 MS+30 g/L 蔗糖+ 0.1 mg/L NAA,生根率達(dá)100%;移栽 30 d 后,成活率達(dá)80%以上。研究結(jié)果為互葉白千層的工廠化育苗提供了科學(xué)依據(jù)。

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