植物組織培養(yǎng)生理機(jī)制的研究進(jìn)展

張慧君　陳勁楓

摘要：植物形態(tài)發(fā)生變化時(shí)，生理生化特性研究是揭開這一現(xiàn)象的一個(gè)重要方面，很多研究已經(jīng)證實(shí)，形態(tài)建成的前提是植物生理生化的改變，其生理生化差異導(dǎo)致了不同的形態(tài)發(fā)生，植物不定芽形成是一個(gè)很復(fù)雜的現(xiàn)象。本研究就植物組織培養(yǎng)過程中生理生化變化的幾個(gè)方面加以討論。

關(guān)鍵詞：植物組織培養(yǎng)；生理生化；生理機(jī)制；形態(tài)；不定芽；內(nèi)源激素

中圖分類號(hào)：Q943.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2015）03-0033-03

作為植物細(xì)胞全能性的一種表達(dá)方式，體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點(diǎn)，并在很多領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。人們對(duì)植物不定芽再生的機(jī)理及其應(yīng)用方面做了大量的研究，在不同離體組織培養(yǎng)的養(yǎng)分需求，不同植物對(duì)環(huán)境因素、培養(yǎng)基成分、添加物質(zhì)、植物激素的種類和濃度等各因素的需求，不同材料的不定芽增生和生長及不定芽發(fā)育機(jī)理等方面都得到了很大發(fā)展。本研究從植物再生過程中的生理生化角度進(jìn)行綜述，幫助大家了解有關(guān)進(jìn)展。

1 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的細(xì)胞生物學(xué)研究

細(xì)胞生物學(xué)研究體細(xì)胞胚發(fā)生過程是了解體胚發(fā)生過程的重要研究方法，主要通過石蠟切片技術(shù)、超微切片技術(shù)和組織化學(xué)染色研究方法探討體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中的形態(tài)學(xué)建成，觀察體細(xì)胞胚的發(fā)育過程，其中石蠟切片法最常見。目前關(guān)于植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程的報(bào)道越來越多，普遍認(rèn)為體細(xì)胞胚胎發(fā)生經(jīng)歷球形胚或原胚、心形胚、魚雷形胚和子葉胚4個(gè)階段，但對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的起源研究結(jié)果不盡一致，既有關(guān)于單細(xì)胞的報(bào)道，也有關(guān)于多細(xì)胞起源的報(bào)道。對(duì)植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的超微結(jié)構(gòu)研究結(jié)果普遍顯示，在非胚性向胚性細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程中，胚性細(xì)胞形成厚壁，具有胞質(zhì)濃、核大、液泡小、核仁大、細(xì)胞器豐富、線粒體數(shù)量增多、胞間連絲廣泛存在等特點(diǎn)。孫麗芳對(duì)玉米愈傷組織用石蠟切片組織觀察及電鏡掃描，結(jié)果顯示，胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織在細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)、愈傷組織外部形態(tài)和分化能力方面具有明顯差異，為以后研究奠定理論依據(jù)[1]。江榮翠對(duì)滇秋木體細(xì)胞采用掃描電鏡進(jìn)行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織和非胚性愈傷組織具有明顯的形態(tài)特征[2]；張濤對(duì)蕓芥研究表明，能產(chǎn)生體細(xì)胞胚的胚性細(xì)胞具有核大、質(zhì)濃、染色深、細(xì)胞排列緊密等特點(diǎn)，跟周圍的細(xì)胞有明顯的界限[3]。

2 抗氧化酶類

酶是植物生化反應(yīng)的催化劑，在胚狀體發(fā)生過程中起非常關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，所有需氧生物都必須依賴氧才能獲得能量和維持生命，然而當(dāng)活性氧濃度超過正常水平時(shí)，對(duì)生物細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒害作用[4-8]。有研究報(bào)道，生物體為了減輕和防止活性氧損傷，已形成了復(fù)雜的氧化反應(yīng)機(jī)制，在植物組織培養(yǎng)的不同階段，這種抗氧化反應(yīng)也是不斷變化的[9-14]。近年來，已有很多關(guān)于植物離體培養(yǎng)的研究，結(jié)果表明不定根、愈傷組織、不定芽等的形態(tài)發(fā)生都與過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性有關(guān)[15]。王亞馥等指出，在枸杞離體培養(yǎng)過程中，POD活性逐漸增強(qiáng)，整個(gè)變化過程中出現(xiàn)2個(gè)峰值，分別在分生細(xì)胞團(tuán)芽的形成階段[16]。莊東紅等的研究結(jié)果表明，在組織培養(yǎng)過程中，大白菜子葉POD活性變化隨著外植體的分化、不定芽的產(chǎn)生呈增強(qiáng)趨勢(shì)[17]。崔凱榮等在研究枸杞體細(xì)胞胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，隨著體細(xì)胞的發(fā)育，SOD、POD、CAT相互配合來調(diào)節(jié)胚性細(xì)胞的生長分化，這3種酶在枸杞胚胎發(fā)生與發(fā)育過程中都有不同的變化，變化情況與體細(xì)胞的伸長密切相關(guān)[18]。還有研究認(rèn)為，體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育是大量酶特異性合成及參與代謝的結(jié)果，在細(xì)胞發(fā)育中可以穿透細(xì)胞膜，可以減少對(duì)細(xì)胞的損害，體細(xì)胞胚胎的發(fā)育與超氧化物自由基的清除密切相關(guān)[19-21]。許多植物的過氧化物酶活性在體胚發(fā)生過程中較強(qiáng)，詹園鳳等在大蒜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)，SOD、POD、CAT活性變化與胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及體胚的發(fā)育密切相關(guān)，POD對(duì)體胚的誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，而SOD和CAT在體胚的發(fā)育和成熟中起主導(dǎo)作用[22]。

3 生化物質(zhì)的變化

在體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，可溶性糖含量的變化可能為細(xì)胞分裂和發(fā)育提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，并可能預(yù)示著新的發(fā)育狀態(tài)即將開始。陳陸琴等將金蓮花、合歡莖尖接入分化培養(yǎng)基上后發(fā)現(xiàn)，莖尖基部形成愈傷組織，而后愈傷組織分化出不定芽，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的前12 d，可溶性糖含量迅速增加，伴隨著不定芽的生長，可溶性糖含量開始緩慢減少[23]。從啟動(dòng)愈傷組織開始到形成愈傷組織過程中，可溶性糖含量較低；而從愈傷組織形成開始階段到愈傷組織分化形成不定芽的階段，可溶性糖含量較高，這可能是由于可溶性糖為形成不定芽的碳骨架原料，其含量提高可以保證愈傷組織的原料供應(yīng)。當(dāng)愈傷組織進(jìn)行不定芽分化時(shí)，由于不定芽原基形成、生長，可溶性糖含量增多，直到器官分化完成后才開始逐漸減少，這也說明可溶性糖在不定芽發(fā)生過程中起的主要作用之一是提供碳源[24]。詹園鳳等在對(duì)大蒜體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，可溶性糖含量在其細(xì)胞脫分化早期出現(xiàn)1次高峰，隨后迅速下降，在成熟期略有回升，由此得出可溶性糖在細(xì)胞脫分化早期出現(xiàn)累積高峰，細(xì)胞進(jìn)入迅速分裂階段，此時(shí)可能為細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育提供物質(zhì)和能量基礎(chǔ)；可溶性糖含量在胚成熟期升高，這可能為新的發(fā)育階段提供物質(zhì)和能量[22]。

辛偉杰發(fā)現(xiàn)，花燭體胚發(fā)生過程中可溶性蛋白質(zhì)含量在球形胚和成熟胚2個(gè)時(shí)期出現(xiàn)峰值，而從誘導(dǎo)外植體形成胚性愈傷組織時(shí)，蛋白質(zhì)含量降低；脫分化時(shí)，外植體細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解轉(zhuǎn)化成糖類及其他物質(zhì)，為胚性細(xì)胞的形成提供能量，隨著胚性細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育，細(xì)胞內(nèi)積累了大量的蛋白質(zhì)；成熟胚時(shí)期，可溶性蛋白質(zhì)又大量積累，為后期的體胚萌發(fā)提供了物質(zhì)保證[25]。齊力旺等發(fā)現(xiàn)，落葉松胚性愈傷組織中的游離氨基酸含量明顯低于非胚性愈傷組織，特別是游離基酸中的精氨酸含量，非胚性愈傷組織中精氨酸為胚性愈傷組織的 4 倍[26]。有報(bào)道指出，多胺能促進(jìn)體細(xì)胞胚發(fā)生，而精氨酸為多胺合成的前體，其含量變化可能與多胺的合成及體細(xì)胞胚發(fā)生關(guān)系密切。

植物形態(tài)發(fā)生實(shí)質(zhì)上受基因相互調(diào)控，是基因之間按時(shí)空順序表達(dá)的結(jié)果[27]。王亞馥等研究發(fā)現(xiàn)，在枸杞愈傷組織再分化形成不定芽時(shí)，上升的可溶性蛋白質(zhì)含量為枸杞形態(tài)發(fā)生提供了必需的物質(zhì)基礎(chǔ)[16]。已有大量研究結(jié)果表明，在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中，可溶性蛋白質(zhì)組分和含量發(fā)生改變，盡管有些結(jié)果不是很一致，但總的變化趨勢(shì)是相同的。不同物種中胚性愈傷組織的可溶性蛋白質(zhì)合成速率和含量遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織，可見前者代謝活性高于后者。

4 體胚發(fā)生中的特異蛋白

蛋白質(zhì)是基因調(diào)控和表達(dá)的產(chǎn)物，植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物相關(guān)基因按一定時(shí)空表達(dá)順序而產(chǎn)生的結(jié)果。在體細(xì)胞胚胎發(fā)育的過程中，從外形、生理上可以分為幾個(gè)階段，即原胚、球形胚、心形胚、魚雷形胚、子葉胚、成熟胚以及再生成苗階段，植物離體再生中各個(gè)時(shí)期都必然會(huì)存在特異蛋白的表達(dá)。Marsoni 等成功地比較了葡萄胚性發(fā)生過程中形成的非胚性愈傷組織和胚性愈傷組織蛋白表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)共有35 個(gè)蛋白點(diǎn)差異表達(dá)，且這些蛋白點(diǎn)可能與胚性發(fā)生有關(guān)[28]。這些蛋白既可作為調(diào)控因子，又可作為結(jié)構(gòu)蛋白、酶蛋白和貯藏蛋白。孫麗芳利用蛋白質(zhì)組技術(shù)檢測(cè)了玉米胚性發(fā)生相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，共有 42 個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生顯著變化，質(zhì)譜成功鑒定 29 個(gè)蛋白點(diǎn)，根據(jù)蛋白功能將其分為細(xì)胞繁殖、翻譯與蛋白合成、脅迫響應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，因此對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中特異蛋白的分析，對(duì)優(yōu)化體胚發(fā)生機(jī)制、調(diào)控體細(xì)胞胚胎發(fā)生和體胚發(fā)生、發(fā)育的相關(guān)基因克隆與研究、遺傳轉(zhuǎn)化等工作具有重大意義[1]。

5 內(nèi)源激素水平的變化

植物激素是植物體內(nèi)天然存在的一系列有機(jī)化合物，作為執(zhí)行細(xì)胞通信功能的化學(xué)信息，在代謝、生長、形態(tài)建成等植物生理活動(dòng)的各個(gè)方面均起十分重要的體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)作用；植物體胚發(fā)生過程中的生理效應(yīng)往往是多種激素間相互作用的結(jié)果，體胚發(fā)育時(shí)期不同，內(nèi)源激素發(fā)生的變化不同。植物內(nèi)源激素含量調(diào)控細(xì)胞分化和生長的方向與進(jìn)程，以致于植物生命活動(dòng)的整個(gè)過程，不同的植物種類和外植體都影響著內(nèi)源因素的變化[29-30]。一些研究結(jié)果表明，植物愈傷組織的分化是內(nèi)源生長素含量逐步降低的結(jié)果，也是細(xì)胞分裂素含量逐步升高的過程。劉滌等在研究煙草離體培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與未分化出芽的愈傷組織相比，已分化出芽的愈傷組織內(nèi)源生長素含量明顯升高[31]；王秀紅等研究發(fā)現(xiàn)，在NAA和 6-BA 等2種激素作用下，水稻花藥、幼胚和花穗都可以誘導(dǎo)愈傷組織完成芽的形態(tài)分化，在內(nèi)源NAA含量增高時(shí)，其愈傷出苗率逐漸下降，降低時(shí)愈傷出苗率逐漸增高，與內(nèi)源細(xì)胞分裂素剛好相反，然而外源植物激素必須通過對(duì)內(nèi)源激素平衡的調(diào)節(jié)才發(fā)生作用[32-33]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，在NAA和6-BA作用下可以誘導(dǎo)水稻花藥、幼胚和花穗來源的愈傷組織完成芽的形態(tài)分化，其愈傷出苗率與內(nèi)源生長素存在負(fù)效應(yīng)，而與內(nèi)源細(xì)胞分裂素存在正效應(yīng)[34-35]。植株生長發(fā)育過程與植株內(nèi)源和外源激素的種類、含量及配比等有密切的關(guān)系[36-38]；裴東等的研究結(jié)果表明，內(nèi)源激素對(duì)菊花、水稻愈傷、紅富士蘋果、南瓜不定芽形成和分化起重要作用[39-41]；林士杰等在研究整個(gè)不定芽形成的過程中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源激素ABA對(duì)不定芽的形成有利[42]；芽原基的啟動(dòng)分化階段與較高濃度的ABA相伴隨，芽原基生長發(fā)育階段與高濃度的ABA相關(guān)，各種內(nèi)源激素的代謝和動(dòng)態(tài)平衡在細(xì)胞分化中起重要且關(guān)鍵的作用。

在植物體內(nèi)，內(nèi)部條件和外部培養(yǎng)條件相互作用，結(jié)果導(dǎo)致植物體內(nèi)器官發(fā)生形態(tài)變化，內(nèi)源激素的調(diào)控是重要因素之一，植物的外源激素須通過對(duì)內(nèi)源激素的調(diào)節(jié)來控制器官的生長發(fā)育，各種植物生長物質(zhì)的水平都通過影響植物外植體的基因表達(dá)而引起器官分化的。內(nèi)源激素與受體或載體結(jié)合通過不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞方式來控制不同的生理功能，但其激素在分子水平上通過何種途徑來調(diào)控植物再生的作用機(jī)制仍有待深入研究。

6 問題與展望

總之，在植物組織培養(yǎng)過程中，植株再生途徑包括胚狀體發(fā)生，器官發(fā)生和體細(xì)胞發(fā)生，不同植物和同一植物不同組織或器官的再生途徑也不同，且植株再生受外植體生理狀態(tài)至關(guān)重要的影響，這些生理機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。這些變化是多方面的，由生理變化到內(nèi)部基因的改變，都是相互作用的結(jié)果，這些隨著研究的不斷深入，分子生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，這一科學(xué)問題必將會(huì)解決，植物再生的生理機(jī)制將在植物工廠化、 規(guī)?；a(chǎn)中發(fā)揮重要的作用。

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