重金屬鎳脅迫對向日葵幼苗生理生化特性的影響

曾小飚　唐健民　朱成豪　鄒蓉, 史艷財　韋霄　蔡麗華

摘要：? 為揭示向日葵對鎳脅迫的響應(yīng)機(jī)制，該文以向日葵幼苗為材料，采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法探索了重金屬鎳脅迫對其生理生化指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：低濃度的鎳脅迫（≤10 mg·L-1）有利于幼苗的生長，高濃度的鎳脅迫（≥50 mg·L-1）對幼苗具有明顯的抑制作用。隨著鎳脅迫濃度的逐漸增加，向日葵幼苗各項生理生化指標(biāo)的變化較大，其中葉綠素、可溶性糖（SS）、可溶性蛋白（SP）、過氧化物酶（POD）活性、游離脯氨酸（Pro）的含量均在1～10 mg·L-1時呈現(xiàn)上升趨勢，在50～100 mg·L-1時呈下降的趨勢，丙二醛（MDA）含量則呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢。這表明向日葵幼苗對低濃度（1～10 mg·L-1）鎳脅迫能夠通過自身調(diào)節(jié)，增加POD、Pro和MDA等物質(zhì)的含量來提高對生態(tài)環(huán)境的抗逆能力，說明向日葵幼苗對重金屬鎳具有一定抗性;而高濃度（50～100 mg·L-1）鎳脅迫會破壞其自身防御系統(tǒng)，從而影響幼苗的生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞： 向日葵幼苗， 鎳脅迫， 生長， 生理生化特性， 響應(yīng)機(jī)制

中圖分類號：? Q945.78文獻(xiàn)標(biāo)識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2019）12-1702-08

Abstract：? ?In order to reveal the response mechanism of Helianthus annuus nickel stress， nutrient solution culture experiments were carried out to probe the affection of heavy metal nickel on physiological and biochemical characteristics by using Helianthus annuus seedlings as materials. The results showed that low nickel concentration （≤10 mg·L-1） was beneficial to the seedlings growth， and high nickel concentration （≥50 mg·L-1） had obvious inhibitory effects on seedlings. With the increasing of nickel concentration， the physiological and biochemical indexes changed greatly， in which chlorophyll， soluble sugar （SS）， soluble protein （SP）， peroxidase （POD） activity， free proline （Pro）， all their contents increased when the nickel concentration was 1-10 mg·L-1， and decreased when the nickel concentration was 50-100 mg·L-1; but the content of malondialdehyde （MDA） continued to rise. This indicates that the seedlings can used autoregulation to improve resistibility by increasing POD， Pro and MDA in low nickel concentration （1-10 mg·L-1）， and that? seedlings have certain resistance to heavy metal nickel， while high concentration （50-100 mg·L-1） nickel stress will destroy its own defense system so as to affect the growth and development of seedlings.

Key words： Helianthus annuus seedlings， nickel stress， growth， physiological and biochemical characteristics， response mechanism

土壤是人類生存的基礎(chǔ)，隨著我國社會的進(jìn)步和工業(yè)的不斷發(fā)展，土壤生態(tài)環(huán)境狀況十分嚴(yán)峻，土壤重金屬污染問題日趨嚴(yán)重。重金屬借助風(fēng)力、水力以及化學(xué)遷移等方式進(jìn)入到土壤中（白玉杰等，2018），在土壤中富集無法被微生物降解，造成植物吸附后導(dǎo)致生理功能紊亂，影響植物生長發(fā)育和生存環(huán)境的變化。由于重金屬污染的長期性和不可逆性（呂學(xué)研等，2014），研究重金屬污染的防治和修復(fù)顯得十分迫切;鎳是土壤中廣泛分布的金屬污染物之一，根據(jù)《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國 Ni 污染超標(biāo)率為 4.8%，鎳的污染研究已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。隨著對重金屬鎳的研究不斷開展，有大量的文獻(xiàn)報道，主要研究集中在對玉米（王麗娜，2014）和板藍(lán)根（王兵和馬芳，2014）等作物的生理生化影響，但關(guān)于觀賞性的重金屬鎳富集植物的研究報道較少，研究觀賞性植物對重金屬鎳的富集性種植和土壤修復(fù)具有重要意義。

向日葵（Helianthus annuus）別名朝陽花、望日蓮、太陽花，一年生草本，是菊科向日葵屬的植物。高1～3.5 m，花期7—9月，花色有金黃色、紅色及復(fù)色等，具有非常高的觀賞價值，廣泛用于公園花境營造、盆花、染色花及庭院美化等領(lǐng)域（徐惠風(fēng)等，2003）。向日葵莖干直、根系較發(fā)達(dá)、喜光照、生長周期短、生物量大、對重金屬有較強(qiáng)的富集性（郭平等，2007）。

該研究利用鎳元素在不同濃度下所配成的混合營養(yǎng)液對向日葵進(jìn)行培養(yǎng)，研究不同濃度鎳脅迫對向日葵生長發(fā)育和生理生化指標(biāo)的影響;從形態(tài)指標(biāo)和生理生化指標(biāo)兩個方面分析鎳脅迫對其的影響，旨在探索鎳脅迫對幼苗生長的影響程度和向日葵幼苗對鎳脅迫的響應(yīng)機(jī)制;為確定鎳元素對觀賞向日葵生長發(fā)育的影響和鎳污染環(huán)境修復(fù)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

向日葵種子為金星1號，購于百色城西蔬菜種子店。Hoagland營養(yǎng)液的配方：硝酸鈣945 mg·L-1;硝酸鉀607 mg·L-1;磷酸銨115 mg·L-1;硫酸鎂493 mg·L-1;鐵鹽溶液2.5 mL·L-1;微量元素5 mL·L-1;pH=6.0。

1.2 方法

1.2.1 種子萌發(fā)及幼苗培育精選飽滿的向日葵種子，用1/1 000的高錳酸鉀溶液進(jìn)行表面消毒30 min，蒸餾水清洗3次，置于墊有紗布的平底托盤中，在（25±1）℃下萌發(fā)。待四分之三的種子萌芽后，將其植入裝有潔凈細(xì)砂的塑料杯中，用新配置的Hoagland培養(yǎng)液澆灌，自然條件下培養(yǎng)一段時間后，挑選長勢一致（高15 cm）的幼苗分為6組，每組30棵，供鎳脅迫實(shí)驗用。

1.2.2 重金屬鎳脅迫分別用濃度為0、1、5、10、50、100 mg·L-1的鎳脅迫溶液（分別取一定質(zhì)量的NiSO4· 6H2O溶于1/2Hoagland培養(yǎng)液中）澆灌向日葵幼苗，于陽光充足的條件下培養(yǎng)，并統(tǒng)一在植株高于土壤表面約2 cm處用記號筆做好標(biāo)記，便于以后從此標(biāo)記處測量株高，脅迫12 d后對向日葵幼苗做各項生理生化指標(biāo)測定。

1.3 向日葵幼苗葉片生理生化指標(biāo)的測定

分別對每個脅迫濃度的向日葵幼苗葉片進(jìn)行采集、提取測定;相同指標(biāo)所取葉片的形態(tài)學(xué)位置相同。葉綠素含量測定采用80%丙酮萃取法（趙世杰等，1998）;丙二醛（MDA）與可溶性糖（soluble sugar， SS）含量測定分別采用硫代巴吡妥酸（TBA）法和蒽酮法（李合生，2000）;過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法（張治安等，2004）;可溶性蛋白（soluble protein， SP）含量測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法;游離脯氨酸（Pro）含量測定采用酸性茚三酮法等（鄒琦等，2000）。以上實(shí)驗做3次重復(fù)，株高用游標(biāo)卡尺測量。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

利用 Excel 和 Origin 2015 軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及制圖。

2結(jié)果與分析

2.1 鎳脅迫對向日葵幼苗株高及形態(tài)的影響

株高作為衡量植物生長特征的重要指標(biāo)之一，株高的變化反應(yīng)植物的生長狀態(tài)。由圖1可知，在低濃度區(qū)間，1～10 mg·L-1向日葵幼苗株高逐漸增高，葉片直立綠色，說明低濃度的鎳脅迫有利于植株的生長;隨著濃度升高，50 mg·L-1株高的增幅顯著低于對照組，葉片逐漸出現(xiàn)彎曲、萎蔫的現(xiàn)象;在100 mg·L-1鎳脅迫下，向日葵幼苗葉片已發(fā)黃、出現(xiàn)斑點(diǎn)，并伴隨著萎蔫現(xiàn)象，說明此階段向日葵幼苗葉片的生長受到了嚴(yán)重抑制。

2.2 鎳脅迫對向日葵幼苗葉綠素含量的影響

植物葉綠素主要包括葉綠素a與葉綠素b，植物光合作用離不開葉綠素，光合作用的強(qiáng)弱直接影響植物體內(nèi)有機(jī)物的合成。葉綠素含量減少，葉片失綠，重者導(dǎo)致死亡。從圖2可以看出，在1～5 mg·L-1濃度脅迫下，鎳濃度升高，葉綠素a含量隨之增加，但上升幅度不大，分別增加了2.4%、8.1%;但濃度10 mg·L-1脅迫下，增加了17.8%，上升顯著;當(dāng)鎳脅迫濃度在50～100 mg·L-1時，葉綠素a含量則下降明顯，分別降低了5.9%、19.9%。最高脅迫濃度導(dǎo)致葉綠素a減少的量遠(yuǎn)高于最低脅迫濃度促進(jìn)增長的量?？梢姡?～10 mg·L-1鎳濃度促進(jìn)葉綠素a的合成，增強(qiáng)光合作用效率，50～100 mg·L-1鎳濃度對向日葵幼苗毒害較深。而葉綠素b含量分別比對照組增加了10.4%、11.6%、15.9%，呈持續(xù)上升趨勢。葉綠素b含量達(dá)到峰值之后，開始大幅度下降，受鎳脅迫濃度影響較大，相對于只用營養(yǎng)液培養(yǎng)組（比對照）降低了19.2%、42.3%。葉綠素b在重金屬鎳的影響下，其含量下降幅度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上升幅度。由此可見，在向日葵幼苗生長發(fā)育過程中，低濃度鎳對葉綠素b的合成有促進(jìn)作用，高濃度下光合作用效率降低。綜合來看，葉綠素a與葉綠素b對鎳毒害的敏感程度有很大差別，鎳對葉綠素b的作用力更大，毒害更深。

2.3 鎳脅迫對向日葵可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物體光合作用的產(chǎn)物，以單糖為主，為生命活動提供能量，逆環(huán)境下，這類小分子化合物可以作為滲透調(diào)節(jié)劑維持滲透平衡。其含量增加可以降低重金屬毒害機(jī)體，提高植物體的抗逆能力。

由圖3可知，當(dāng)鎳脅迫濃度≤10 mg·L-1時，可溶性糖在向日葵葉片中的含量明顯增加。隨著不同濃度脅迫溶液加入12 d后，可溶性糖迅速增加14.2%，之后逐漸增加了18.2%、29.3%，可溶性糖最大增加量是10 mg·L-1時的2.07倍;當(dāng)脅迫濃度增加到50 mg·L-1時，可溶性糖含量銳減，增加量達(dá)到最低。1～10 mg·L-1鎳處理后，可溶性糖含量持續(xù)增加;50 ～100 mg·L-1鎳處理后，含量明顯下降，經(jīng)100 mg·L-1鎳處理后與對照組相比，可溶性糖含量減少了16.1%。可以看出向日葵葉片中可溶性糖含量的變化趨勢呈先上升后下降。1～10 mg·L-1濃度的鎳脅迫對向日葵影響不大，可溶性糖的增加可以起到滲透調(diào)節(jié)的作用，減輕重金屬帶來的傷害;高濃度時，植株已經(jīng)受到較深的毒害，可溶性糖的含量明顯降低。

2.4 鎳脅迫對向日葵丙二醛含量的影響

植物在逆環(huán)境下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛（MDA），使質(zhì)膜平衡體系受損。因此MDA含量的多少可以反映出植物體受傷程度。

從圖4可以看出，MDA的含量隨著鎳脅迫濃度的增加小幅度上升且都高于對照組。在濃度為1、5、10、50、100 mg·L-1的鎳脅迫下，MDA含量一直處于上升趨勢，增加率為0.4%、11.8%、44.8%、62.3%、71.4%。在低濃度鎳脅迫下，向日葵幼苗MDA含量變化較小，當(dāng)濃度超出5 mg·L-1時，含量顯著地增加;到10 mg·L-1時，丙二醛含量相對5 mg·L-1時高出33%，增加非常顯著。說明在低濃度（≤5 mg·L-1）鎳脅迫的逆環(huán)境下，鎳脅迫對細(xì)胞膜的傷害不大，而隨著鎳濃度的逐漸增大，促使丙二醛含量增多，反映向日葵幼苗膜質(zhì)損傷的程度逐漸加深。

2.5 鎳脅迫對向日葵可溶性蛋白含量的影響

生物體生命活動離不開蛋白質(zhì)，植物體內(nèi)的可溶性蛋白幾乎都是參與各種代謝的酶類，催化各種化學(xué)反應(yīng)。在重金屬脅迫下，其含量變化是反應(yīng)植物抗逆性的重要指標(biāo)。

在重金屬鎳1～100 mg·L-1的脅迫下，向日葵葉片中的可溶性蛋白含量變化（圖5），經(jīng)1～50 mg·L-1的鎳處理，向日葵葉片中可溶性蛋白含量均高于對照組，分別高出12.0%、15.9%、20.7%、7.6%，100 mg·L-1的鎳處理后，比對照組低了3.8%。這說明低濃度的鎳處理刺激可溶性蛋白的合成，以減少鎳脅迫帶來的毒害;經(jīng)高濃度的鎳處理后細(xì)胞代謝活動減慢，可溶性蛋白的合成受到抑制，植物的生長發(fā)育受到嚴(yán)重影響。從整體看來，鎳脅迫明顯抑制可溶性蛋白的合成。

2.6 鎳脅迫對向日葵過氧化物酶活性的影響

過氧化物酶（POD）廣泛存在于植物體內(nèi)，能有效清除過量的活性氧，提高植株的抗逆性，是植物重要的保護(hù)酶之一。過氧化物酶活性在植物生長發(fā)育過程中隨脅迫濃度的增加不斷發(fā)生變化，在抵制外界逆境毒害過程中扮演著重要的角色。

結(jié)果圖6顯示，鎳脅迫12 d后，向日葵葉片的POD活性先上升，至最高點(diǎn)后持續(xù)下降。經(jīng)1 ～10 mg·L-1 鎳處理，過氧化物酶活性持續(xù)上升，實(shí)驗組超過對照組2.1%、10.6%、16.1%，活性最大出現(xiàn)在鎳脅迫濃度為10 mg·L-1。這說明低濃度鎳有增強(qiáng)植物葉片中POD活性的作用。50 mg·L-1的鎳處理，會導(dǎo)致過氧化物酶活性顯著下降，相對10 mg·L-1而言，降低了14.2%。雖然活性明顯降低，但仍超出對照組1.8%。在100 mg·L-1的脅迫下，過氧化物酶活性低于對照組，說明鎳脅迫濃度過高，會導(dǎo)致向日葵葉片中的過氧化物酶活性明顯降低。

2.7 鎳脅迫對向日葵游離脯氨酸含量的影響

游離脯氨酸（Pro）具有較強(qiáng)的溶解性，可以起到防止植物組織脫水與減小滲透壓的作用。游離脯氨酸在細(xì)胞中大量的積累，作為自身的防脫水劑和滲透壓劑，對于保證組織的持水力與降低細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)的滲透勢有重大意義。

由圖7可知，向日葵在鎳脅迫下，向日葵葉片中的游離脯氨酸含量隨著鎳脅迫濃度的增加呈先上升后降低的趨勢。當(dāng)脅迫濃度為1、5 mg·L-1時，游離脯氨酸含量的增加值比較接近，分別增加了19.6%、22.1%。當(dāng)脅迫濃度為10、50 mg·L-1時，比對照高出了38.0%、41.7%，兩組增加量明顯比前面的大，游離脯氨酸含量最高是在鎳脅迫濃度為50 mg·L-1時。經(jīng)100 mg·L-1的鎳脅迫，游離脯氨酸含量驟降，比對照組降低了5.9%。由此可說明，低濃度的鎳處理，向日葵葉片中脯氨酸仍不斷增加，起到保持細(xì)胞滲透勢的作用，是適應(yīng)逆環(huán)境的一種表現(xiàn);100 mg·L-1時向日葵受鎳毒害嚴(yán)重，游離脯氨酸的積累減少，導(dǎo)致向日葵的滲透平衡破壞。

3討論

植物在多種因素的共同作用下表現(xiàn)出抗逆性，其生理生化指標(biāo)是研究植物抗逆能力的基礎(chǔ)。鎳具有潛在性，無論是低濃度還是高濃度都會對植物的外觀形狀、生物量和生理生化過程具有一定的影響（劉金華等，2012;趙娜和周米平，2011;魯艷等，2012）。

在逆境中，植物的POD、MDA會發(fā)生協(xié)調(diào)性變化。過氧化物酶在逆境中被激活，有研究表明，過氧化物酶活性隨鎳脅迫濃度的增加先升后降（趙娜，2011）。本研究結(jié)果表明，有鎳溶液加入時，POD活性幾乎無變化，5 mg·L-1時活性明顯上升。當(dāng)POD活性到達(dá)一定程度后就開始下降，且下降幅度大，直到低于對照組。這表明向日葵幼苗在一定鎳脅迫條件下，加強(qiáng)了POD活性并激發(fā)植株自身防御機(jī)制，以清除鎳脅迫帶來的膜脂過氧化傷害。脅迫濃度過高，過氧化物酶則受到破壞，活性降低?；钚越档涂赡苁怯捎诿{迫致使向日葵幼苗細(xì)胞膜系統(tǒng)受損，破壞POD分子結(jié)構(gòu)，使植物不能耐受高濃度脅迫。研究結(jié)果表明MDA含量隨鎳濃度的增加而增加。在高濃度的鎳脅迫下，活性自由基大量生成，機(jī)體的清除能力有限，MDA含量逐漸增加，導(dǎo)致向日葵幼苗膜脂過氧化作用增強(qiáng)，質(zhì)膜透過性增加（鄭愛珍，2005），影響細(xì)胞正常代謝，POD活性降低，說明POD這類保護(hù)酶對植物膜系統(tǒng)的保護(hù)具有限制性。

本研究結(jié)果表明，鎳在低濃度時，可以促進(jìn)向日葵葉綠素合成。高濃度脅迫嚴(yán)重破壞葉綠素合成機(jī)制，使機(jī)體無法抵制鎳毒害。這說明向日葵對低濃度鎳脅迫有較強(qiáng)的抗性，能正常進(jìn)行光合作用，葉綠體是較敏感的細(xì)胞器之一，在高濃度脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)遭到破壞，使葉綠素含量下降，光合作用減弱，影響植物體的生長發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，鎳對葉綠素b的毒害作用比葉綠素a強(qiáng)，50 mg·L-1的脅迫下，葉綠素b含量下降幅度更大，大概是兩者結(jié)構(gòu)存在差異的原因。在100 ml·L-1的鎳脅迫下，向日葵葉片失綠，出現(xiàn)斑點(diǎn)并伴有灼燒現(xiàn)象，表明此時向日葵幼苗耐受鎳毒害達(dá)到最大限度，自身防御系統(tǒng)嚴(yán)重破壞。

可溶性糖是光合作用的產(chǎn)物，既是植物體的能量來源，也是滲透調(diào)節(jié)不可或缺的部分。在黃櫨和紫荊的研究中，隨脅迫濃度增加，可溶性糖含量呈上升趨勢（李國雷等，2004）。有研究表明低濃度脅迫下，可溶性糖含量隨鎳脅迫濃度增加逐漸上升，可溶性糖的積累可能是機(jī)體在逆環(huán)境下的一種應(yīng)急機(jī)制，隨著脅迫濃度的持續(xù)增加，可溶性糖含量開始降低（常云霞等，2018）。這說明向日葵幼苗在高濃度金屬脅迫下，葉綠素合成途徑受阻，光合作用效率下降，呼吸作用加強(qiáng)，有機(jī)物合成減少，運(yùn)輸途徑受到阻礙，可溶性糖含量逐漸減少，在植物體內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)能力受到限制，影響植株的生長發(fā)育。有研究表明向日葵幼苗在鎳脅迫下，可溶性蛋白的含量先是逐漸上升，隨后緩慢下降（張牡丹等，2018）?？扇苄缘鞍缀铣稍鰪?qiáng)并參與滲透調(diào)節(jié)，提高其抗逆性，保護(hù)自身機(jī)制免受傷害;當(dāng)脅迫濃度超出一定范圍，蛋白質(zhì)合成受阻，植物的這種自我調(diào)節(jié)機(jī)制受到破壞，導(dǎo)致向日葵幼苗生命活動受到影響。

游離脯氨酸是植物在逆環(huán)境中重要滲透調(diào)節(jié)劑之一，可以起到保持機(jī)體滲透平衡的作用。研究表明隨著外界脅迫濃度的增加，植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量升高（張云起等，2003;楊樹軍等，2008;武春霞等，2008）。本研究結(jié)果表明，在鎳濃度≤50 mg·L-1時，游離脯氨酸在向日葵葉片中含量與鎳濃度呈正相關(guān);當(dāng)鎳濃度達(dá)到100 mg·L-1時，游離脯氨酸含量急劇下降，低于對照組。這說明一定濃度的鎳脅迫溶液會使植物體內(nèi)游離脯氨酸含量不斷增加，維持體內(nèi)滲透勢平衡，是植物自身采取的一種保護(hù)措施;當(dāng)鎳濃度超過一定范圍時則會導(dǎo)致脯氨酸含量下降，破壞了植物的自我保護(hù)?？梢?，游離脯氨酸在機(jī)體內(nèi)的調(diào)節(jié)作用受鎳脅迫濃度影響較大。

4結(jié)論

通過營養(yǎng)液培養(yǎng)法研究不同濃度的鎳脅迫向日葵幼苗后葉片各項生理生化指標(biāo)變化規(guī)律，得出以下結(jié)論：低濃度的鎳脅迫對向日葵幼苗葉綠素、可溶性糖、可溶性蛋白、過氧化物酶、游離脯氨酸的合成影響不大，植株可以通過自身調(diào)節(jié)，抵制鎳毒害，提高抗逆能力，各生理生化指標(biāo)不僅表明向日葵幼苗對重金屬鎳有一定的抗性;也側(cè)面反應(yīng)鎳和向日葵的生長發(fā)育狀態(tài)有一定的相關(guān)性，表明向日葵作為觀賞性植物可在輕度鎳污染的土壤中進(jìn)行生態(tài)修復(fù)栽培。

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