基于網(wǎng)絡藥理學的葶藶子潛在作用機制研究

史佩玉 林樫 陳國銘 方彩珊 綦向軍 侯穎躍 羅冬強 邢萬里 黃睿瀾 羅文婷

中圖分類號 R285 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2823-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.17

摘 要 目的：探討葶藶子潛在的藥理作用機制，為其進一步開發(fā)利用和臨床應用提供參考。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺數(shù)據(jù)庫和STRING數(shù)據(jù)庫篩選并確認葶藶子的有效成分和相關靶標蛋白;運用Cytoscape 3.7.0軟件構建葶藶子有效化合物-靶標蛋白可視化網(wǎng)絡，并進行網(wǎng)絡拓撲學分析;借助STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.7.0軟件構建并分析葶藶子靶標蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡;通過DAVID生物信息學資源數(shù)據(jù)庫對靶標蛋白進行KEGG通路富集分析。結果：共篩選獲得葶藶子有效化合物9個，包括槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等;獲得靶標蛋白174個，主要包括人前列腺素內(nèi)源性過氧化物合酶2（PTGS2）、核受體共激活因子2、孕酮受體等，其中轉錄因子AP-1（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）是PPI網(wǎng)絡中的核心蛋白。KEGG富集通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、腫瘤壞死因子α（TNF-α）信號通路、缺氧誘導因子1信號通路、Toll樣受體信號通路、甲狀腺激素信號通路等。結論：葶藶子中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效化合物可能通過PI3K/Akt信號通路、TNF-α信號通路等作用于PTGS2、JUN、MAPK1等靶標蛋白，進而發(fā)揮瀉肺平喘、利水消腫的功效。

關鍵詞 葶藶子;網(wǎng)絡藥理學;藥理作用;機制;有效化合物;靶標蛋白;信號通路

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the potential pharmacological mechanism of the seed of Draba nemorosa， and to provide reference for further development， utilization and clinical application. METHODS： Effective components and related target proteins of D. nemorosa were screened and identified by using TCMSP and STRING database. Cytoscape 3.7.0 software was used to construct a visual network of effective components and target proteins for the seed of D. nemorosa， and the network topology analysis was performed. The targeting protein-protein interaction （PPI） network was constructed and analyzed by STRING database and Cytoscape 3.7.0 software. KEGG pathway enrichment of target proteins was analyzed by DAVID bioinformatics resource database. RESULTS： A total of 9 effective components were screened from the seed of D. nemorosa， including quercetin， kaempferol， β-sitosterol， etc. Totally 174 target proteins were obtained， mainly including PTGS2， NCOA2， PGR， etc. Among them， JUN and MAPK1 were core proteins in PPI network. KEGG enrichment pathway included PI3K/Akt signaling pathway， TNF-α signaling pathway， HIF-1 signaling pathway， Toll-like receptor signaling pathway and thyroid hormone signal pathway， etc. CONCLUSIONS： Effective components from the seed of D. nemorosa such as quercetin， kaempferol and β-sitosterol may act on PTGS2， JUN and MAPK1 target proteins through PI3K-Akt signaling pathway and TNF-α signaling pathway， thus exert the effects of purging lung， relieving asthma， promoting edema and reducing edema.

KEYWORDS? ?Seed of Draba nemorosa; Network pharmacology; Pharmacological effect; Mechanism; Effective components; Target protein; Signaling pathway

葶藶子為十字花科植物播娘蒿[Descurainia sophia（L.）Webb ex Prantl]或獨行菜（Lepidium apetalum Willd.）的干燥成熟種子，其味辛、苦，性大寒，歸肺、膀胱經(jīng)，具有瀉肺平喘、行水消腫之功效，可用于痰涎壅肺、喘咳痰多、胸脅脹滿、胸腹水腫、小便不利等癥的治療[1]?，F(xiàn)代藥理研究證實，葶藶子具有止咳平喘、強心利尿、抗腫瘤等作用，具有一定的開發(fā)價值[2]。

中藥藥效的物質基礎由多種結構和功能各異的化合物組成，其藥效的發(fā)揮也并非集中于某一特定靶標，而是涉及多個靶標[3]。作為新興學科，網(wǎng)絡藥理學打破了原有單一的研究框架，構建了“藥物-成分-靶點-疾病”的多層次網(wǎng)絡，與中醫(yī)藥整體觀理論相契合[4]。該學科可為從分子生物學水平闡明中藥“多成分、多靶點、多通路”作用機制提供科學依據(jù)，且具有整體性和系統(tǒng)性的特點[5]。筆者通過查閱文獻發(fā)現(xiàn)，目前關于葶藶子的現(xiàn)代藥理研究多集中于其有效化學成分、藥理作用、生物活性、質量控制等領域，而有關其多成分、多靶標、多途徑、多效應藥效作用機制的系統(tǒng)性研究則相對較少。為此，本研究擬采用網(wǎng)絡藥理學方法分析并預測葶藶子的潛在作用機制，以期為該藥材的進一步開發(fā)利用及臨床應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 獲取葶藶子有效化合物和靶標蛋白

本研究依托中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），以“葶藶子”作為“Herb name”進行檢索，并通過口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）來篩選葶藶子中活性較高的化合物。其中，OB是指口服藥物被吸收后進入循環(huán)系統(tǒng)，并保持藥理活性的比例，是評價活性成分藥動學行為的關鍵指標;DL則體現(xiàn)了化合物與已知藥物的相似性，是評價成藥性高低的重要指標[3]。本研究以OB≥30%、DL≥0.18為篩選標準，對葶藶子的有效化合物及其靶標信息進行篩選，以提高數(shù)據(jù)的真實性與可靠性[6]。將葶藶子有效化合物靶標信息輸入蛋白質相互作用平臺STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），以獲取其有效化合物靶標蛋白的標準名稱。

1.2 構建有效化合物-靶標蛋白網(wǎng)絡

將上述篩選所得的葶藶子有效化合物和靶標蛋白相關信息輸入Cytoscape 3.7.0軟件（http：/cytoscape.org/）進行可視化處理，并構建葶藶子有效化合物-靶標蛋白網(wǎng)絡。其中，葶藶子有效化合物及靶標蛋白用節(jié)點表示，兩節(jié)點間的相互作用關系用邊表示。使用軟件中的“Network analyzer”工具進行網(wǎng)絡拓撲學分析，以節(jié)點度值（Degree）和中介中心度（Betweenness centrality）來評估節(jié)點的重要程度，上述參數(shù)值的大小均與對應節(jié)點在該網(wǎng)絡中的重要程度成正比[7]。

1.3 構建蛋白-蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡

PPI是生物分子網(wǎng)絡中的基本組成元件，是疾病發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)[8]，故本研究使用STRING數(shù)據(jù)庫獲取靶標蛋白相互作用關系，從PPI層次探討葶藶子的潛在作用機制。將葶藶子靶標蛋白信息輸入STRING數(shù)據(jù)庫，物種設為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值設為最高置信度“Highest confidence（0.900）”，同時設置“Hide disconnected nodes in the network”以隱藏網(wǎng)絡中無關聯(lián)的節(jié)點，其余參數(shù)均為“默認”，構建PPI關系。將上述PPI關系導入Cytoscape 3.7.0軟件進行可視化處理，以獲取PPI網(wǎng)絡;以度值大于2倍平均度值為標準篩選核心靶標蛋白，并采用Excel 2010軟件繪制相應蛋白的信息條形圖。

1.4 KEGG通路富集分析

將葶藶子相關作用靶標蛋白的編碼基因導入DAVID生物信息學資源數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）中進行KEGG通路富集分析。物種設為“Homo sapiens”，計算所有富集通路的P值，并采用Bonferroni法進行校正，P<0.01的結果被認為是“顯著富集”[6]，挖掘葶藶子靶標蛋白編碼基因參與的KEGG通路信息。

2 結果

2.1 葶藶子有效化合物和靶標蛋白篩選結果

從TCMSP數(shù)據(jù)庫中共獲得葶藶子的相關化合物68個，參照OB≥30%、DL≥0.18的標準共篩選出化合物12個;排除無對應靶標或靶標蛋白無標準名稱的化合物，共篩選得葶藶子中的有效化合物9個、靶標蛋白174個，詳見表1、表2。

2.2 葶藶子有效化合物-靶標蛋白網(wǎng)絡分析結果

通過Cytoscape 3.7.0軟件獲得葶藶子有效化合物-靶標蛋白網(wǎng)絡，見圖1。由圖1可見，該網(wǎng)絡共有183個節(jié)點、275條邊。其中，最外兩圈表示度值為1的靶標蛋白，再往里兩圈表示度值>1的靶標蛋白，最內(nèi)圈表示葶藶子的有效化合物（其形狀大小與度值成正比）。網(wǎng)絡拓撲學分析結果顯示，該網(wǎng)絡節(jié)點的平均度值為3.005，大于該平均值的節(jié)點有10個;平均中介中心度為0.014，大于該平均值的節(jié)點有10個。根據(jù)節(jié)點度值、中介中心度等網(wǎng)絡拓撲學特征進行核心節(jié)點的篩選，結果顯示，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、常春藤皂苷元等有效化合物以及PTGS2、NCOA2、PTGS1、GABRA1、PPARG等靶標蛋白在葶藶子有效化合物-靶標蛋白網(wǎng)絡中具有重要作用，可能是葶藶子發(fā)揮藥效的核心化合物及靶標蛋白。

2.3 葶藶子靶標蛋白PPI網(wǎng)絡分析結果

共得到靶標蛋白152個，其PPI網(wǎng)絡見圖2。由圖2可見，該網(wǎng)絡共有152個節(jié)點、629條邊，平均度值為8.276。其中，96個圓形節(jié)點表示度值小于平均度值的靶標蛋白，38個三角形節(jié)點表示度值大于平均度值但小于2倍平均度值的靶標蛋白，18個正六邊形節(jié)點表示度值大于2倍平均度值的靶標蛋白。

參考各節(jié)點的度值繪制核心靶標蛋白（即度值大于2倍平均度值的靶標蛋白）信息條形圖，結果見圖3。由圖3可見，JUN、MAPK1的度值分別為36、34，大于其余靶標蛋白，在PPI網(wǎng)絡中起樞紐作用，可能是葶藶子發(fā)揮瀉肺平喘、利水消腫功效的關鍵靶標蛋白。

2.4 KEGG通路富集結果

共得到KEGG富集通路35條（P值均小于0.01）。采用P值和基因富集數(shù)量交叉篩選的方法，篩選出P值與基因富集數(shù)均排名前10位的信號通路，結果見表3。由表3可見，葶藶子靶標蛋白的編碼基因主要富集于TNF-α信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、甲狀腺激素信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路、MAPK信號通路等。

3 討論

葶藶子首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，可“破堅逐邪，通利水道，凡積聚寒熱從水氣來者，此藥主之”，臨床上常用以治療痰涎壅肺、胸脅脹滿、喘咳哮鳴、小便不利等癥，具有很好的療效[9-10]。中藥具有多成分、多靶點、多通路的作用特點，本研究運用網(wǎng)絡藥理學從“成分-靶點-通路”水平初步探討了葶藶子的潛在作用機制。

3.1 有效化合物和靶標蛋白

葶藶子有效化合物-靶標蛋白網(wǎng)絡分析結果表明，槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效化合物和PTGS2等靶標蛋白是葶藶子關鍵化合物與靶標蛋白。PPI網(wǎng)絡分析結果表明，JUN和MAPK1的度值大于其余靶標蛋白。

槲皮素為天然的多羥基黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗過敏、抗風濕、調(diào)節(jié)免疫等作用[11-12]。相關文獻報道，該化合物可緩解肺部相關疾病，并可有效減輕肺組織的損傷[13-14]。此外，在發(fā)生慢性支氣管炎或肺氣腫時，輔助性T淋巴細胞2（Th2）細胞和嗜酸性粒細胞含量增多，氣道呈高反應性，黏液產(chǎn)生增多，從而導致患者氣道阻塞、呼吸不暢并與黏液相搏，臨床上常表現(xiàn)為喘咳哮鳴、胸脅脹滿、痰涎壅肺，而槲皮素可通過抑制促炎介質的過度釋放來發(fā)揮宣肺平喘的功效[15]。山柰酚具有抗炎、抗氧化等作用，可下調(diào)核因子κB（NF-κB）信號通路，抑制IL-6、TNF-α等炎癥因子分泌，在急性肺損傷中發(fā)揮著重要的作用[16]。β-谷甾醇對脂多糖致急性肺損傷模型小鼠具有一定的保護作用，可通過阻止炎癥因子的釋放、抑制NF-κB信號通路的活化等途徑來發(fā)揮平喘的作用[17]。

PTGS2又稱環(huán)氧合酶2（COX-2），其高水平表達與機體免疫活性密切相關[18]。COX-2抑制劑可增加肺癌對放療的敏感性，提高治療效果，且對肺癌所致喘咳、咳痰具有一定的抑制作用[18-19]。c-jun是早期原癌基因，哮喘形成過程中產(chǎn)生的各種細胞因子、炎癥介質等均可促進其編碼產(chǎn)物JUN蛋白的表達[20]，是葶藶子發(fā)揮瀉肺平喘功效的關鍵蛋白，這與筆者預測的JUN靶標蛋白在葶藶子PPI網(wǎng)絡中具核心作用基本相符。MAPK1靶標蛋白主要存在于支氣管平滑肌細胞胞漿中，能緩解氣道重塑、減少炎癥因子表達、調(diào)節(jié)氣道炎癥反應、減輕咳喘癥狀[21]。MAPK通路與肺癌細胞增殖、凋亡密切相關，抑制該通路的活性，可促進肺癌細胞的凋亡、抑制其增殖[22]。

據(jù)此，筆者認為葶藶子發(fā)揮瀉肺平喘功效與其所含槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效化合物和PTGS2、JUN、MAPK等靶標蛋白有關，這些活性化合物可借助上述靶標蛋白而抑制肺和支氣管炎癥的發(fā)生、調(diào)節(jié)機體免疫活性、降低促炎介質的釋放、減少肺與支氣管黏液的生成、緩解氣道阻塞。中醫(yī)認為，支氣管隸屬肺系，為氣道的分支，故抑制肺和支氣管炎癥的產(chǎn)生即抑制肺系炎癥的產(chǎn)生，宣肺即“護肺”[23]。本研究結果與上述理論基本一致。

3.2 信號通路

KEGG通路富集分析結果顯示，TNF-α信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路、甲狀腺激素信號通路、PI3K/Akt信號通路、MAPK信號通路等是葶藶子發(fā)揮藥效的重要信號通路，其中大多數(shù)靶標蛋白的編碼基因主要富集于PI3K/Akt信號通路和TNF-α信號通路。其中，PI3K/Akt信號通路可通過抑制或調(diào)節(jié)心室重構、內(nèi)皮細胞遷移、能量代謝等機制改善心肌功能，起到強心作用[24]，這與葶藶子能夠通過加強心肌收縮力、改善心臟泵血功能而起到利尿作用[25]相一致。因此，筆者預測葶藶子可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路來發(fā)揮利水消腫的功效，故而可用于治療小便不利、胸腹水腫等癥。TNF-α信號通路可促進趨化因子、促炎因子的表達，在氣道黏液高分泌過程中具有重要作用[26-27]。氣道黏液高分泌會導致痰液增多，而葶藶子可通過調(diào)控TNF-α信號通路來減少炎癥因子和氣道黏液的產(chǎn)生，從而達到治療痰涎壅盛等癥的目的。

4 結語

本研究基于網(wǎng)絡藥理學的方法，對葶藶子的潛在作用機制進行了分析，結果發(fā)現(xiàn)，葶藶子中的槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等有效化合物可能通過PI3K/Akt信號通路、TNF-α信號通路等信號通路作用于PTGS2、JUN、MAPK1等靶標蛋白而發(fā)揮宣肺平喘、利水消腫的功效，且上述作用具有多成分、多靶點、多通路的特點，與祖國醫(yī)學的整體觀不謀而合。但本研究在篩選核心化合物與靶標蛋白時存在一定的主觀性，可能導致結果具有一定的局限性與片面性，故本文結論有待基礎和臨床研究的進一步驗證。

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（收稿日期：2019-02-18 修回日期：2019-07-29）

（編輯：張元媛）