串聯(lián)質(zhì)譜法在合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證中的應(yīng)用進展

溫學美 李悅 陸靜

中圖分類號 R943;R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2876-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.27

摘 要 目的：綜述串聯(lián)質(zhì)譜法在合成多肽藥物結(jié)構(gòu)表征方面的應(yīng)用進展，為該類藥物的結(jié)構(gòu)表征提供方法參考。方法：以“合成多肽藥物”“多肽測序”“串聯(lián)質(zhì)譜”“質(zhì)譜法”“結(jié)構(gòu)確證”“Synthetic polypeptide drugs”“Peptide sequencing”“Tandem mass spectrometry”“Mass spectrometry”“Structure interpretation study”等為關(guān)鍵詞，組合查詢了2000年1月-2019年1月中國知網(wǎng)、萬方、維普、Springer Link、Web of Science、PubMed等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻，對串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于確證合成多肽類藥物結(jié)構(gòu)的研究進展進行歸納與總結(jié)。結(jié)果與結(jié)論：共檢索到相關(guān)文獻192篇，其中有效文獻52篇。合成多肽藥物主要由氨基酸構(gòu)成，這類藥物在結(jié)構(gòu)確證研究方面與一般藥物有所不同。根據(jù)目前相關(guān)技術(shù)指導原則以及有關(guān)文獻研究，合成多肽藥物結(jié)構(gòu)表征的主要內(nèi)容包括分子量測定、氨基酸組成和序列分析、二硫鍵分析以及二級結(jié)構(gòu)分析等。近年來，串聯(lián)質(zhì)譜法及其與其他方法的結(jié)合在合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證中應(yīng)用廣泛，成為Edman降解多肽測序法的有效補充，且其因靈敏度高、分析速度快、所需樣品量少等優(yōu)點，已成為確證多肽藥物結(jié)構(gòu)的有力工具。

關(guān)鍵詞 合成多肽藥物;串聯(lián)質(zhì)譜法;Edman降解;結(jié)構(gòu)確證

多肽藥物是介于大分子蛋白/抗體類藥物和小分子藥物之間的一類重要的藥物分子，因其生物活性高、靶向?qū)Ｒ恍愿?、選擇性高、毒副作用低等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于疾病治療領(lǐng)域[1]。近年來，微球、脂質(zhì)體、聚乙二醇（PEG）修飾等方法的深入應(yīng)用解決了多肽藥物穩(wěn)定性差、體內(nèi)易降解、半衰期短等成藥性差的問題，促進了多肽藥物的開發(fā)利用[2-4]。多項臨床前實驗和臨床研究表明，多肽藥物藥效廣泛，可用于治療骨質(zhì)疏松癥、糖尿病、前列腺疾病、子宮內(nèi)膜異位癥、肢端肥大、潰瘍和甲狀腺功能減退等多種疾病[5-7]，未來的商業(yè)價值和發(fā)展前景巨大[8-9]。到目前為止，美國FDA已批準了90多種活性多肽藥物進入市場[6，10-11]，其中許多獲批的多肽是通過化學方法合成的，包括液相合成或固相合成的方法，還有更多的合成多肽藥物正處在上市前的研究中[12]。隨著合成多肽藥物研發(fā)數(shù)量的不斷增長，對這類藥物結(jié)構(gòu)確證方面的研究也在不斷開展。目前常用的肽和蛋白質(zhì)N端測序方法為Edman降解法，但其存在結(jié)果不明確、靈敏度低等缺點。例如，色氨酸和半胱氨酸等氨基酸殘基因受到背景干擾可能無法檢測到，因此Edman降解法難以對微量肽、N-端封閉肽或多肽混合物進行表征。隨著測序技術(shù)和儀器的發(fā)展，串聯(lián)質(zhì)譜法已成為一種高效、高靈敏和高通量的肽類測序工具，在合成多肽藥物分子結(jié)構(gòu)確證方面發(fā)揮了重要作用。筆者以“合成多肽藥物”“多肽測序”“串聯(lián)質(zhì)譜”“質(zhì)譜法”“結(jié)構(gòu)確證”“Synthetic polypeptide drugs”“Peptide sequencing”“Tandem mass spectrometry”“Mass spectrometry”“Structure interpretation study”等為關(guān)鍵詞，組合查詢了2000年1月-2019年1月中國知網(wǎng)、萬方、維普、Springer Link、Web of Science、PubMed等數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)文獻。結(jié)果，共檢索到相關(guān)文獻192篇，其中有效文獻52篇?，F(xiàn)對串聯(lián)質(zhì)譜法在確證合成多肽藥物結(jié)構(gòu)中的相關(guān)應(yīng)用研究進行綜述，以期為該類藥物的研發(fā)提供參考。

1 合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證相關(guān)技術(shù)指導原則及研究內(nèi)容

1.1 相關(guān)技術(shù)指導原則

合成多肽藥物本質(zhì)上屬于化學藥物的范疇，國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）于2004年發(fā)布的《化學藥物原料藥制備和結(jié)構(gòu)確證研究技術(shù)指導原則》[13]將多肽藥物歸于化學藥物之中，并對其結(jié)構(gòu)確證的測試方案進行了簡要說明。但是合成多肽藥物因其結(jié)構(gòu)的特殊性，在制備方法、結(jié)構(gòu)確證、質(zhì)量研究等方面有其特殊要求，對此美國FDA早在1994年就發(fā)布了有關(guān)多肽藥物的指導原則“Guidance for Industry for the Submission of Chemistry，Manufacturing，and Controls Information for Synthetic Peptide Substances”[14]，但該指導原則于2006年被美國FDA官方撤回。我國SFDA在2007年發(fā)布了《合成多肽藥物藥學研究技術(shù)指導原則》[15]，該項指導原則的提出對合成多肽藥物結(jié)構(gòu)表征、質(zhì)量控制等方面的相關(guān)研究起到了規(guī)范作用。但到目前為止，國內(nèi)的相關(guān)指導原則也未進行相應(yīng)更新，所以仍缺乏有關(guān)合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證的官方指南。在國內(nèi)外現(xiàn)有的相關(guān)指導原則以及有關(guān)文獻研究的基礎(chǔ)之上，科學合理地對合成多肽藥物結(jié)構(gòu)進行準確表征，對這類藥物的研發(fā)有著重要意義。

1.2 合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證研究內(nèi)容

一般化學原料藥結(jié)構(gòu)確證研究的主要內(nèi)容包括平面結(jié)構(gòu)、立體結(jié)構(gòu)、晶型及結(jié)晶水/結(jié)晶溶劑等方面[13]，而合成多肽藥物分子則更需要在氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、二硫鍵分析等方面進行結(jié)構(gòu)確證研究。

1.2.1 分子量測定 同化學原料藥一樣，合成多肽藥物的結(jié)構(gòu)確證中也包括分子量的測定，一般采用質(zhì)譜法進行單同位素質(zhì)量的測定，其質(zhì)量偏差應(yīng)在理論值的±1.0 個質(zhì)量單位內(nèi);對于分子量在2 kDa以上的多肽，使用高分辨質(zhì)譜儀更為合適[16]。

1.2.2 氨基酸組成分析 氨基酸組成分析可說明多肽的組成是否正確，不僅能證明多肽的結(jié)構(gòu)，還能在一定程度上反映樣品的純度（是否含有合成雜質(zhì)）。在進行氨基酸組成分析時，要注意考察所涉及的各類氨基酸，尤其是非天然氨基酸和氨基酸衍生物的色譜行為，以準確進行定性、定量分析。此外，在該項分析當中應(yīng)建立合適的水解方法，因為不同的水解條件可能會對某些氨基酸的回收產(chǎn)生較大影響[17]，如pH<3時，谷氨酰胺（Gln）會經(jīng)酸催化脫氨而發(fā)生水解;而在pH>7時，Gln不易形成六元環(huán)，更加穩(wěn)定。

1.2.3 氨基酸序列分析 與其他分子一樣，化學成分的闡明是確定肽同一性的基礎(chǔ)，包括闡明氨基酸及其在肽鏈中的排列順序，即一級結(jié)構(gòu)/序列。傳統(tǒng)氨基酸測序方法為Edman降解法，但該方法一般用來測定N端氨基酸;此外，Edman測序和串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合也是目前常用的一種方法，可用于闡明含有二硫鍵的復(fù)雜肽，例如降鈣素鮭魚的一級結(jié)構(gòu)[17]。采用串聯(lián)質(zhì)譜法測定肽序列時通常使用碰撞誘導解離（CID）碎裂技術(shù)，但如果序列覆蓋度差，應(yīng)考慮采用其他的質(zhì)譜碎裂技術(shù)[18-23]（見表1）。對于含有20個以上氨基酸殘基的長肽，如不能直接確定其序列，可進行多肽肽圖的分析，分析過程一般是用專一性較強的蛋白水解酶（一般為肽鏈內(nèi)切酶）對多肽進行水解，再用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）確定各肽段。

1.2.4 二硫鍵分析 正確的二硫鍵數(shù)目和位置是多肽和蛋白質(zhì)產(chǎn)生生物活性的結(jié)構(gòu)保證，在對合成或天然多肽產(chǎn)品研究的過程中，二硫鍵的分析是需要考察的重要內(nèi)容之一。合成多肽藥物分子中如含有二硫鍵，一般先采用還原試劑如二硫代硫醇（DTE）、二硫蘇糖醇（DTT）或三（2-羧乙基）膦（TCEP）對這類藥物進行還原，然后進行質(zhì)譜分析，通過比較還原前后的質(zhì)量差可確定其含有的二硫鍵數(shù)目。其中，對含有多對二硫鍵的多肽還應(yīng)該對其二硫鍵進行定位分析。部分還原是一種被廣泛接受的定位二硫鍵的方法，在這種方法中，多肽在可控的條件下被消解，從而使不同還原動力學的二硫鍵被還原，再經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分離和分析，即可完成二硫鍵的定位。

1.2.5 二級結(jié)構(gòu)分析 含有40個氨基酸以上的肽通常表現(xiàn)出高度的構(gòu)象靈活性，其特征主要是隨機螺旋和一定程度的二級結(jié)構(gòu)（如α螺旋和/或β折疊）。結(jié)構(gòu)的有序性可能對某些肽的生物活性有重要影響[24]，因此二級結(jié)構(gòu)的闡明也是多肽結(jié)構(gòu)表征的一部分。一般常用圓二色譜（CD）、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、核磁共振（NMR）、X射線晶體學、拉曼光譜和熒光光譜等方法對多肽藥物的二級結(jié)構(gòu)進行分析。例如，阮進成等[25]通過體外折疊體系折疊化學合成抗菌肽Plectasin，經(jīng)過高效液相色譜（HPLC）分離純化之后采用CD 進行二級結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)未折疊分子只具有α螺旋結(jié)構(gòu)，外折疊的Plectasin 具有α螺旋及反平行β折疊結(jié)構(gòu)。高錚亞[26]采用FTIR法研究了可溶性鳥苷酸環(huán)化酸血紅素結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在亞基單獨的血紅素結(jié)構(gòu)域蛋白（hsGC α2H）及通過link連接的異源二聚血紅素結(jié)構(gòu)域蛋白（hsGC β1H-2H）中α螺旋結(jié)構(gòu)的含量相對較高，但其重組后α螺旋結(jié)構(gòu)含量有所降低，β折疊結(jié)構(gòu)相對升高，這一發(fā)現(xiàn)與CD法測得的結(jié)果相近。

結(jié)合目前已有合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證的相關(guān)技術(shù)指導原則以及有關(guān)研究文獻，合成多肽藥物結(jié)構(gòu)表征的主要內(nèi)容有分子量測定、氨基酸組成和序列分析、二硫鍵分析以及二級結(jié)構(gòu)分析等，具體的研究內(nèi)容可結(jié)合研究對象的具體結(jié)構(gòu)而有所側(cè)重。

2 串聯(lián)質(zhì)譜法在合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證中的應(yīng)用

串聯(lián)質(zhì)譜是時間上或空間上兩級以上質(zhì)量分析的結(jié)合，用以測定第一級質(zhì)量分析器中的前體離子（Precursorion）與第二級質(zhì)量分析器中的產(chǎn)物離子（Producticm）之間的質(zhì)量關(guān)系[27]。軟電離技術(shù)的發(fā)展和采用新技術(shù)的質(zhì)量分析器的研發(fā)，進一步推動了串聯(lián)質(zhì)譜在多肽藥物結(jié)構(gòu)確證方面的研究應(yīng)用。

2.1 串聯(lián)質(zhì)譜法在合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證方面的應(yīng)用

2.1.1 常規(guī)電噴霧離子源串聯(lián)質(zhì)譜法（ESI-MS/MS） 在電噴霧質(zhì)譜中，肽段經(jīng)惰性氣體碰撞而誘導裂解可產(chǎn)生穩(wěn)定的N端系列a、b、c型離子和/或C 端系列x、y、z型離子（主要是b、y型離子），根據(jù)碎片離子間的質(zhì)量差可以推斷出多肽的氨基酸序列[28]。相比于Edman降解測序法，ESI-MS/MS可用于分析N端封閉和經(jīng)修飾的多肽[29]。周紅華等[30]應(yīng)用電噴霧質(zhì)譜法（ESI-MS）及源內(nèi)CID對胸腺五肽（TP5，人工合成五肽）進行測定，得到質(zhì)荷比（m/z）680.3的[M+H]+峰，m/z 702.2的[M+Na]+峰等相關(guān)加和峰，這些數(shù)據(jù)與TP5的理論相對分子質(zhì)量679.4 相符;并得到了TP5的系列碎片離子（主要是b型離子），通過解析碎片離子，最終確定了其氨基酸序列（從N端到C端）為：精氨酸-賴氨酸-天冬氨酸-纈氨酸-酪氨酸（RKDVY）。周紅華等[31]的另一項研究應(yīng)用ESI-MS及源內(nèi)CID技術(shù)對多肽類藥物醋酸亮丙瑞林（人工合成九肽）進行了測定，結(jié)果測得其分子量與理論值一致;并通過分析得到的b、y型碎片離子，證實了亮丙瑞林的氨基酸序列。周紅華等[32]又應(yīng)用ESI-MS及源內(nèi)CID技術(shù)分析了曲普瑞林（人工合成十肽）和促黃體素釋放激素類似物（人工合成九肽）的氨基酸序列，結(jié)果，這兩種寡肽在正離子模式下均可得到較好的質(zhì)譜信息，且均得到了其準分子離子峰[M+H]+及[M+Na]+信號峰，分子量分別與各自理論值一致;又通過分析得到的一系列典型的b、y型碎片離子，從而確證了這兩種寡肽的一級結(jié)構(gòu)。張冬梅等[33]采用電噴霧-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（ESI-Q-TOF-MS/MS）測定了磷?；揎椇蟮?種模型肽的氨基酸序列，該方法很好地區(qū)分了m/z相近的賴氨酸和谷氨酰胺氨基酸殘基，提高了質(zhì)譜測序的準確度。

既往研究顯示，環(huán)孢菌素類化合物（環(huán)狀十一肽）的氨基酸序列信息豐富、差異性大，可利用ESI-MS/MS對該類化合物進行快速的初步鑒定。例如，陳振偉等[34]應(yīng)用電噴霧離子化多級質(zhì)譜法分析了CsA、CsB、CsC、CsD 4種環(huán)孢菌素同系物，在m/z 50～1 400范圍內(nèi)進行多級掃描，分別得到了這4個樣品的三級質(zhì)譜圖。其中，一級質(zhì)譜圖中主要是這4種同系物的[M+H]+分子離子，二級和三級質(zhì)譜圖中主要是[M+H]+經(jīng)CID得到的一系列碎片離子（以b型離子為主）。對比分析所得質(zhì)譜圖發(fā)現(xiàn)，這4種環(huán)孢菌素同系物主要裂解位點在 2-3位間、1-11位間、5-6位間;而分析[M+H-H2O]+峰可以進一步確定環(huán)孢菌素中的氨基酸序列。該研究表明，該方法簡便、準確，可用于這類化合物的快速鑒別。方劍英等[35]應(yīng)用ESI-MS/MS分析了9個環(huán)孢菌素類化合物經(jīng)強酸水解后的產(chǎn)物，獲得了這9個化合物一些組成氨基酸的特征分子離子峰，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1位上特殊的氨基酸的分子離子峰特征明顯。該研究表明，與已知的方法相比，該方法可在無對照品的情況下，快速準確地鑒別環(huán)孢菌素類化合物。

2.1.2 納升電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（Nano-ESI-MS/MS） 常規(guī)電噴霧技術(shù)的耗樣量大，而納升電噴霧技術(shù)因其噴霧頭口徑小，使得樣品分子的去溶劑化和離子化效率大大提高，故其已經(jīng)越來越廣泛地運用于生物大分子的分析鑒定中[36]。李萍等[37]加入還原劑DTT將奧曲肽（人工合成八肽）中的二硫鍵打開，采用Nano-ESI-MS/MS測得還原前奧曲肽相對分子量為1 019.450 2，與理論分子量的相對誤差為1.9 ppm;測得還原后奧曲肽相對分子量為1 021.456 7，還原前后的相對質(zhì)量差為2 Da，由此確定奧曲肽中存在一對二硫鍵。在一級質(zhì)譜圖中確定完全打開二硫鍵之后，選定了m/z 511.21的雙電荷峰進行二級質(zhì)譜分析，通過調(diào)節(jié)合適的碰撞能量得到了系列碎片離子峰，借助相關(guān)軟件標識出y型離子，解析后最終確定了奧曲肽一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。梁艷等[38]利用Nano-ESI-MS/MS通過全掃描模式測得阿托西班還原前樣品[M+H]+離子峰的m/z為994.448 7，與理論值994.449 0的相對偏差為0.4×10-6，從而確認阿托西班樣品的分子量是正確的;使用DDT還原后測得樣品[M+H]+m/z為996.4，還原前后的質(zhì)量差為2 Da，確定該樣品中存在1對二硫鍵;在確定阿托西班的二硫鍵完全打開后，選擇了m/z 498.73的雙電荷峰為母離子進一步進行ESI- MS/MS分析，通過y型離子解析二級質(zhì)譜圖后確定了阿托西班一級結(jié)構(gòu)的全序列并對其4個修飾位點（分別位于N端、C端和側(cè)鏈上）進行了確證。結(jié)果表明，該方法靈敏度高、速度快，在多肽類藥物一級結(jié)構(gòu)分析方面具有獨特的優(yōu)勢。

2.1.3 基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（MALDI-TOF/TOF-MS） MALDI-TOF/TOF-MS具有樣品不易碎裂、分子離子峰強等明顯優(yōu)點，可快速測定生物大分子和高分子的分子量，在生物學等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[39]。例如，桑志紅等[40]應(yīng)用MALDI-TOF-MS測得使用DDT還原后的重組蛋白紐蘭格林（rhNRGL）準分子離子峰[M+H]+m/z為7 051.185 5，與其理論值的偏差為5.57×10-6;分別選擇m/z為880.538、1 043.617、1 277.732 的碎片離子作為母離子，設(shè)定離子門窗口為6 Da，調(diào)節(jié)合適的質(zhì)譜參數(shù)，使用BioTools軟件分析二級質(zhì)譜圖，并手動及自動標注氨基酸序列，確證了重組蛋白紐蘭格林C 端序列的10個氨基酸序列。

2.1.4 多種方法結(jié)合 肽類藥物一般要經(jīng)過合理的化學修飾，以最大限度地提高其穩(wěn)定性和生物利用度，同時保持甚至提高生物活性肽的作用和選擇性，這也給串聯(lián)質(zhì)譜法的測序帶來了一定的困難，所以有時需要綜合使用多種技術(shù)進行結(jié)構(gòu)確證。例如，薛燕等[41]使用DTT還原重組人紐蘭格林（rhtNRGL）中的二硫鍵，采用四極桿-傅里葉變換離子回旋共振串聯(lián)質(zhì)譜法（Q-FT-MS/MS）測定rhtNRGL還原前后的精確相對分子量，計算質(zhì)量差，從而確定了分子中的二硫鍵數(shù)目;采用MALDI-TOF/TOF-MS測定rhtNRGL的N端的5個氨基酸序列;采用ESI-MS/MS測定rhtNRGL的C 端的11個氨基酸序列;采用Tyrsin和Glun-C兩種蛋白酶對樣品進行酶解后，經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測獲得該樣品的肽質(zhì)量指紋圖譜，計算得到兩種酶切肽譜的序列覆蓋率分別為82%和64%，經(jīng)過分析確證主成分二硫鍵配對正確，同時發(fā)現(xiàn)少量錯配二硫鍵異構(gòu)體。依替巴肽N端是脫氨基半胱氨酸，用串聯(lián)質(zhì)譜法測定其氨基酸序列時存在一定的困難，為此厲保秋等[42]采用ESI-MS/MS證實了依替巴肽的相對分子量及肽鏈環(huán)化結(jié)構(gòu)，結(jié)合核磁共振氫譜（1H-NMR）分析，發(fā)現(xiàn)測得的化學位移可以與其已知結(jié)構(gòu)較好地對應(yīng)，從而進一步對依替巴肽的一級結(jié)構(gòu)進行了確證。可見，多種分析技術(shù)相結(jié)合已成為復(fù)雜肽或長肽結(jié)構(gòu)確證較常采用的分析手段。

2.2 圖譜處理及分析

串聯(lián)質(zhì)譜法測定多肽序列時，所得到的質(zhì)譜圖既可以手動進行分析，也可以通過儀器提供的相關(guān)軟件進行分析。具體的譜圖處理及分析方式要結(jié)合所分析樣品的結(jié)構(gòu)、所采用的分析儀器以及具體的實驗情況決定。

2.2.1 手動分析 經(jīng)典的氨基酸質(zhì)譜測序方法是在碎裂譜圖中觀察這些離子，通過計算質(zhì)量差來反推多肽序列[43-45]。例如，盛龍生等[46]應(yīng)用基質(zhì)輔助紅外激光解吸質(zhì)譜法（IR-MALDI/FTMS）分析九肽藥物促黃體素釋放激素類似物（LRH-A），獲得了樣品的相關(guān)碎片離子信息，并手動分析了所得到的系列碎片離子，根據(jù)相關(guān)碎片離子之間的質(zhì)量差確定了氨基酸殘基的連接方式。

2.2.2 借助相關(guān)軟件分析 隨著串聯(lián)質(zhì)譜從頭測序軟件（如PEAK、SMSNovo、RAID、UniNovo、Novor等）的開發(fā)[47]，研究人員在進行結(jié)構(gòu)確證時可不依賴于已知數(shù)據(jù)庫，在快速鑒定多肽序列同時還可以指定翻譯后修飾位點[48-49]，這也使得串聯(lián)質(zhì)譜法成為多肽藥物結(jié)構(gòu)確證研究的首選方法之一。一些公司也推出了匹配串聯(lián)質(zhì)譜儀器的商業(yè)軟件，例如梁艷等[38]對還原后的阿托西班樣品進行ESI-MS/MS分析，用儀器上匹配的MaxEnt 3軟件對獲得的二級質(zhì)譜圖進行處理，借助于MasSeq軟件標識出y型離子，從而可以解析m/z為98.73的肽段所對應(yīng)的氨基酸序列，并利用MasSeq軟件中的編輯功能最終確證了阿托西班的一級結(jié)構(gòu)。王紅霞等[50]用納升電噴霧四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析了亮丙瑞林及EPD 等樣品，分別獲得其二級質(zhì)譜圖，經(jīng)儀器上匹配的MaxEnt軟件轉(zhuǎn)化、結(jié)合MasSeq軟件及其中的編輯功能推導出了樣品的多肽序列。

由此可見，串聯(lián)質(zhì)譜法在合成多肽藥物結(jié)構(gòu)確證中的應(yīng)用廣泛，不同的串聯(lián)質(zhì)譜有其不同優(yōu)點，可結(jié)合分析對象的結(jié)構(gòu)靈活選擇合適的方法;對獲得的有關(guān)質(zhì)譜圖進行解析也隨著相關(guān)軟件的開發(fā)及多種數(shù)據(jù)庫的建立而越來越簡便。

3 結(jié)語

為了提高藥效、延緩半衰期、降低副反應(yīng)或改善其穩(wěn)定性，很多新的多肽藥物往往都要進行相關(guān)的化學修飾[51-52]。目前常用的Edman降解法主要是用于測定N端不含有封閉及修飾氨基酸的多肽分子，而質(zhì)譜法則適用于對Edman降解法無法分析的多肽藥物，是一種強大的肽測序工具。雖然串聯(lián)質(zhì)譜測序存在有時難以區(qū)分m/z相近的氨基酸殘基、部分離子缺失、內(nèi)部或側(cè)鏈斷裂產(chǎn)生復(fù)雜的碎片離子，給圖譜解析帶來困難等缺點，但隨著相關(guān)分析軟件的不斷完善及衍生化質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，質(zhì)譜法在分析復(fù)雜的多肽藥物分子及混合肽的結(jié)構(gòu)中顯示出了明顯優(yōu)勢。質(zhì)譜法或質(zhì)譜法與其他分析方法的結(jié)合將越來越多地運用在合成多肽藥物結(jié)構(gòu)表征的研究方面。

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（收稿日期：2019-06-20 修回日期：2019-09-11）

（編輯：孫 冰）