表面活性劑與葉酸的相互作用及其對光氧化降解的影響

羅思琪，王美娜，趙微微，王毅琳,＊

1中國科學(xué)院化學(xué)研究所，膠體界面與化學(xué)熱力學(xué)實驗室，北京 1001902中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

1 引言

葉酸是一種由喋呤啶、對氨基苯甲酸和谷氨酸組成的水溶性B族維生素，具有許多獨特的性質(zhì)與功能。葉酸參與人體的多項生理活動，包括嘌呤和胸腺嘧啶的合成，DNA和RNA的進一步合成及氨基酸的代謝等。葉酸是一種人體的重要營養(yǎng)物質(zhì)，孕婦缺乏葉酸會導(dǎo)致胎兒神經(jīng)管發(fā)育不良等多種缺陷1,2。其次，葉酸也可用作抗腫瘤藥物靶向釋放的受體3-6。此外，葉酸特殊的分子結(jié)構(gòu)使其具有很強的分子間氫鍵作用、π-π相互作用，并且可以提供靜電相互作用的位點，因而其在一定條件下可以自組裝形成液晶、凝膠等有序結(jié)構(gòu)，可用于構(gòu)筑功能材料7-10。

然而，葉酸對光的不穩(wěn)定性限制了其實際應(yīng)用。很多文獻報道了葉酸的降解條件及其機理11-13，研究表明，葉酸發(fā)生的光氧化降解過程分為兩個階段，其中喋呤啶6位的甲酰基氧化成羧酸基團是降解過程的決速步驟。與此同時，人們也通過各種手段來提高葉酸的穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)是一種能夠有效提高葉酸穩(wěn)定性的物質(zhì)。Vorobey等14發(fā)現(xiàn)人血清蛋白可以代替葉酸被氧化降解，從而降低葉酸的降解速率。Liang和Subirade15證明b-LG復(fù)合物也可以作為載體來保護葉酸。許多研究也證實很多蛋白質(zhì)都能夠提高葉酸的穩(wěn)定性16,17。此外，聚合物膠囊也可以用來提高葉酸的穩(wěn)定性18。這些物質(zhì)的共同特點是都能為葉酸提供疏水空間而將葉酸包裹在其中，使葉酸免于暴露在空氣中，從而提高葉酸的光穩(wěn)定性。

表面活性劑膠束已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥制劑中，用以提高有機小分子藥物的溶解度、穩(wěn)定性和生物相容性以及控制藥物釋放等19-22。被普遍接受的認識是表面活性劑的疏水微區(qū)能將不穩(wěn)定小分子包裹，使其與外界環(huán)境隔絕從而提高其穩(wěn)定性。Treger等23發(fā)現(xiàn)陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)能高效抑制聚對苯乙烯撐膜(PPV)的光氧化降解，其主要原因是疏水性的提高能夠抑制氧氣及其他氣體的滲入。同樣，Carlotti等24發(fā)現(xiàn)當淬滅劑Trolox被包裹在膠束的疏水微區(qū)時，其光穩(wěn)定性得以明顯提高。我們課題組以及其他一些課題組的工作表明，表面活性劑膠束的疏水微區(qū)能讓姜黃素與外界堿性環(huán)境隔離，從而抑制姜黃素的降解25-27。

表面活性劑與有機小分子的相互作用已經(jīng)被廣泛地研究，有機小分子的加入不僅能夠屏蔽表面活性劑極性頭基之間的靜電排斥，還可以與表面活性劑的烷基鏈發(fā)生疏水相互作用，使得表面活性劑具有更低的臨界膠束濃度(CMC)和更高的表面活性，同時可以有效地誘導(dǎo)表面活性劑聚集體的形成和轉(zhuǎn)變28-34。表面活性劑與有機小分子的相互作用與表面活性劑的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)，表面活性劑極性頭基的數(shù)目和帶電情況以及疏水鏈的數(shù)目都會影響它們之間的相互作用強度。Gemini和寡聚表面活性劑比單鏈表面活性劑具有更多的靜電結(jié)合位點和疏水鏈，通常具有更低的CMC和形成大聚集體的能力，因此在一定條件下能夠更好地增溶與包裹有機小分子35-38。由此推測，葉酸與不同電性和寡聚度的表面活性劑的相互作用可能存在較大的差異。

基于上述原因，在本工作中，我們利用表面張力、紫外可見吸收光譜、熒光光譜、等溫滴定量熱、動態(tài)光散射以及核磁共振技術(shù)對比研究了四種不同的表面活性劑與葉酸的相互作用，這四種表面活性劑包括十二烷基硫酸鈉(SDS)，十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，連接基團為6個亞甲基的季銨鹽型Gemini表面活性劑(12-6-12)以及線性季銨鹽三聚表面活性劑(12-3-12-3-12)。葉酸與四種表面活性劑的結(jié)構(gòu)式如圖1所示。本文旨在揭示葉酸對表面活性劑的表面活性和聚集行為的影響以及表面活性劑對葉酸光穩(wěn)定性的影響，以期尋找到能夠更加高效增溶和穩(wěn)定葉酸的表面活性劑體系。

2 實驗部分

2.1 試劑與樣品制備

十二烷基硫酸鈉(SDS)，純度為99.9%，十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)，純度為99.9%，和葉酸，純度為99%，購自Sigma公司。Gemini表面活性劑12-6-12和線性三聚表面活性劑12-3-12-3-12的合成和純化方法見參考文獻35,37。最終產(chǎn)物通過質(zhì)譜，核磁和元素分析檢測。實驗用水均為去離子水。所有實驗均在pH = 7.0 時進行。所有實驗溶液均是由包裹著錫紙的棕色瓶新鮮配置。所有的實驗均在暗光條件下進行。

2.2 測試與表征

表面張力實驗：本實驗采用德國Dataphysics Instruments GmbH公司的DCAT11表面張力儀完成，使用19.90 mm × 0.20 mm的鉑銥合金吊片測定單一表面活性劑以及表面活性劑/葉酸混合體系的表面張力。溫度控制在(25.00 ± 0.05) °C。每條表面張力曲線至少重復(fù)兩遍。測量誤差為0.2 mN·m-1。

圖1 葉酸與4種表面活性劑(SDS、DTAB、12-6-12和12-3-12-3-12)的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Chemical structures of folic acid and four surfactants (SDS, DTAB, 12-6-12 and 12-3-12-3-12).

紫外-可見光吸收實驗：紫外-可見光吸收光譜使用日本島津型號為SHIMADZU UV1601PC分光光度計測定。光譜實驗均在(25 ± 2) °C，光程為1 mm的石英池中完成。以280 nm處的吸光度作為特征吸收值。

熒光光譜實驗：熒光光譜使用日本日立型號為Hitachi F-4500的熒光光譜儀測定。激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長測量范圍為390到600 nm。激發(fā)與發(fā)射波長的狹縫寬均為10 nm。熒光光譜實驗均在(25 ± 2) °C下進行。

輻射降解實驗：樣品用10 mm的石英池裝著放在輻射光源為波長為365 nm的紫外燈下照射，每20 min用熒光光譜實驗來確定降解的濃度，直到熒光強度不再變化，即達到飽和照射時間。輻射降解實驗在(25.0 ± 0.1) °C的恒溫箱里進行。

動態(tài)光散射實驗(DLS)：動態(tài)光散射所用儀器為配備有ALV-5000數(shù)字式時間相關(guān)器的ALV/SP-125激光光散射儀，采用的入射光源為氦氖激光，功率為22 mW，波長為632.8 nm，散射角為90°，所有樣品均經(jīng)過孔徑為0.45 μm的濾膜過濾。光散射數(shù)據(jù)的相關(guān)函數(shù)通過Contin法分析處理后得到粒子擴散系數(shù)(D)的分布。對于球形粒子，其表觀水合半徑(Rh)通過Stokes-Einstein方程，Rh= kBT/(6πηD)換算得到，其中kB為玻爾茲曼常數(shù)，T為絕對溫度，η為溶劑的粘度。實驗溫度為(25.0 ±0.1) °C。

等溫滴定量熱實驗(ITC)：采用了等溫滴定微量量熱計TAM (2277-201Thermometric AB，J?rf?lla，Sweden)來研究葉酸與四種表面活性劑的相互作用過程。樣品池中初始放置600 μL的表面活性劑溶液，通過Thermometric 612 Lund泵控制的500 μL Hamilton注射器將0.5 mmol·L-1的葉酸溶液或去離子水加到樣品池中。相互作用過程中保持90 r·min-1的攪拌速率。滴定的最終結(jié)果中扣除了水滴定到相同濃度的表面活性劑溶液中的觀察焓變。因此得到的焓變曲線反應(yīng)了葉酸與表面活性劑的相互作用。所有實驗至少重復(fù)兩次，其誤差低于±4%。實驗溫度為(25.00 ± 0.01) °C。

核磁共振實驗：NOESY采用Bruker AV400FTNMR譜儀在600 MHz完成，實驗操作及數(shù)據(jù)處理利用TOPSPIN(Bruker，version 2.1)工作站完成，所有NMR實驗都在(25 ± 2) °C下進行(利用Bruker，BVT 3200溫控單元控制)。配制葉酸/表面活性劑混合溶液所用的氘代水(D2O)的純度為99.9%。將待測溶液0.6 mL置于5 mm核磁管中進行實驗，以HDO質(zhì)子的化學(xué)位移為內(nèi)標(4.790)得到相應(yīng)的化學(xué)位移。核磁譜數(shù)據(jù)中每個數(shù)據(jù)點的數(shù)字精度為0.04 Hz。

3 結(jié)果與討論

3.1 SDS、DTAB、12-6-12和12-3-12-3-12與葉酸混合體系的表面張力與紫外光譜

圖2 (a) pH 7.0時SDS和DTAB單一組分及與100 μmol·L-1葉酸的混合體系的表面張力隨表面活性劑濃度(CS)的變化曲線；(b)葉酸的最大吸收波長(λmax)隨表面活性劑濃度的變化曲線Fig.2 (a) Surface tension variations of SDS and DTAB vs the surfactant concentration at pH 7.0 in the presence and absence of 100 μmol·L-1 folic acid. (b) Plots of λmax of folic acid vs the surfactant concentration in the surfactant-folic acid mixture.The dash part of line 12-6-12 in (b) is a region of precipitation, UV absorption spectrum experiments cannot be carried out.

在25.00 °C、pH為7時，表面活性劑本身和在100 μmol·L-1葉酸存在時的表面張力曲線如圖2a所示。由于Gemini表面活性劑12-6-12和寡聚表面活性劑12-3-12-3-12靜電結(jié)合位點多，與葉酸的靜電相互作用很強，在低濃度時，表面活性劑的聚集能力不夠，葉酸與表面活性劑分子緊密結(jié)合形成沉淀，表面張力實驗無法進行，只有當它們的濃度高于其CMC時，12-6-12和12-3-12-3-12才能與葉酸形成穩(wěn)定的溶液，因此，我們無法獲得葉酸存在時12-6-12和12-3-12-3-12兩個表面活性劑的表面張力曲線。從圖2a可以看出，葉酸對SDS和DTAB的CMC和表面張力的影響差異很大。當加入葉酸時，SDS的CMC和CMC時的表面張力(γCMC)幾乎保持不變，而DTAB的CMC從15.0 mmol·L-1下降到1.25 mmol·L-1時 ， γCMC從 39.5 mN·m-1下 降 到 28.6 mN·m-1，這表明葉酸能夠顯著提高陽離子表面活性劑DTAB的聚集能力，而對陰離子表面活性劑SDS的聚集能力幾乎沒有影響。這主要是由表面活性劑的電荷差異造成的，pH為7.0時，葉酸的兩個羧酸基團完全去質(zhì)子化，帶負電，因此與DTAB的季銨鹽頭基之間存在強烈的靜電吸引作用，從而可以屏蔽季銨鹽頭基之間的靜電排斥作用，同時，葉酸的喋呤啶部分還與DTAB的疏水鏈具有較強的疏水相互作用，進一步促進了DTAB的聚集；而SDS和葉酸帶有同種電荷，靜電相互作用很弱，因而葉酸促進SDS聚集的效果不明顯。

圖2b表示的是葉酸的最大吸收波長λmax隨表面活性劑濃度的變化曲線。葉酸具有兩個特征吸收波長，280和350 nm，我們選擇280 nm處的吸收波長來研究其隨表面活性劑濃度的變化規(guī)律。280 nm是喋呤啶和對氨基苯甲酸的特征吸收波長。如圖所示，葉酸在SDS存在時，其特征吸收波長不發(fā)生變化，這表明葉酸的喋呤啶和對氨基苯甲酸片段所處的微環(huán)境沒有發(fā)生明顯變化或葉酸的共軛結(jié)構(gòu)沒有變化，而當DTAB、12-6-12和12-3-12-3-12存在時，葉酸的紫外特征吸收波長表現(xiàn)出強烈的對表面活性劑濃度的依賴性。

對于DTAB而言，當其與葉酸作用時，在表面活性劑濃度低于CMC時，葉酸的λmax沒有明顯變化，表明極少量DTAB的加入對葉酸的分子結(jié)構(gòu)或所處的微觀環(huán)境沒有明顯影響；當DTAB濃度大于2.0 mmol·L-1時，葉酸的最大吸收波長λmax開始紅移，此濃度大于DTAB與葉酸混合體系的臨界聚集濃度，表明只有當表面活性劑分子能夠形成聚集體時才會改變?nèi)~酸所處的微觀環(huán)境，此時表面活性劑開始包裹葉酸，該濃度即為表面活性劑開始增溶葉酸的濃度；當濃度大于15.0 mmol·L-1時，λmax紅移至285.5 nm，然后λmax不再隨表面活性劑濃度的增加發(fā)生變化，這意味著二者的相互作用已經(jīng)達到飽和，葉酸已經(jīng)被完全包裹在DTAB形成的聚集體中。

對于12-6-12和12-3-12-3-12，在低濃度的某些濃度區(qū)間有相分離的產(chǎn)生，因此紫外可見光譜的測量避開了這些發(fā)生相分離的濃度區(qū)間。當12-6-12濃度低于0.050 mmol·L-1時，葉酸的λmax幾乎沒有發(fā)生變化；當12-6-12的濃度處于0.050和2.0 mmol·L-1之間時，因為沉淀發(fā)生，無法測量；當12-6-12的濃度大于2.0 mmol·L-1(此值大于12-6-12自身的CMC)時，葉酸的λmax紅移至286 nm，此后一直保持在此值。這個變化規(guī)律表明，12-6-12與葉酸的作用與DTAB基本相同，在大于CMC時，12-6-12將葉酸包覆在其聚集體中。對于12-3-12-3-12，葉酸的λmax隨表面活性劑濃度的變化規(guī)律發(fā)生了很大變化：當12-3-12-3-12的濃度低于0.20 mmol·L-1時，由于沉淀發(fā)生，無法測量；當12-3-12-3-12的濃度為0.20 mmol·L-1時，葉酸的λmax為287 nm，然后隨著12-3-12-3-12濃度的增加，λmax略微藍移，濃度高于0.75 mmol·L-1時，λmax保持在285 nm。雖然λmax隨12-3-12-3-12濃度的增加發(fā)生了藍移，但都大于葉酸自身在水溶液中的λmax值，由于0.20 mmol·L-1大于12-3-12-3-12的CMC39，這表明葉酸包覆于12-3-12-3-12的聚集體中。對于葉酸的最大吸收波長λmax在12-3-12-3-12存在時的特殊變化規(guī)律，我們做如下推測：葉酸的最大吸收波長受兩個因素影響，一是葉酸所處的微觀環(huán)境，環(huán)境極性的降低有利于λmax紅移；二是葉酸分子產(chǎn)生紫外可見吸收的共軛結(jié)構(gòu)，共軛程度降低，會促使λmax藍移。從分子結(jié)構(gòu)來看，葉酸帶2個負電荷，12-3-12-3-12帶3個正電荷。葉酸濃度為0.10 mmol·L-1，當12-3-12-3-12濃度為0.20 mmol·L-1、即略高于自身的臨界聚集濃度(0.16 mmol·L-1)時，帶相反電荷的葉酸與12-3-12-3-12的靜電吸引作用很強，同時葉酸的喋嘧啶片段與12-3-12-3-12三條疏水鏈之間強烈的疏水相互作用會促進烷基鏈聚集，釋放水合水，這一去水合作用又進一步使得帶相反電荷的12-3-12-3-12和葉酸混合體系的靜電吸引作用加強，這種強烈的靜電吸引作用會降低葉酸分子的共軛程度，此時分子結(jié)構(gòu)的改變比微觀環(huán)境的改變對葉酸最大吸收波長的影響大，因此λmax藍移。當12-3-12-3-12濃度大于0.75 mmol·L-1時，葉酸與12-3-12-3-12通過靜電相互作用的結(jié)合已達到飽和，因此λmax隨濃度變化而保持不變。而對于DTAB和12-6-12，它們的每一個分子分別帶1個和2個正電荷、帶1條和2條疏水鏈，因此，它們與葉酸的靜電吸引作用和疏水相互作用都比葉酸與12-3-12-3-12的相互作用弱，進而對葉酸的共軛結(jié)構(gòu)影響較弱，它們對葉酸的最大吸收波長λmax的影響主要來自于形成聚集體之后葉酸所處微環(huán)境極性的降低，所以，葉酸的最大吸收波長在DTAB和12-6-12存在時只發(fā)生紅移。

由以上結(jié)果可知，當表面活性劑寡聚度增加時，葉酸的最大吸收波長紅移幅度增大，可能的原因是，隨著表面活性劑寡聚度的增加，表面活性劑與葉酸的靜電吸引作用和疏水相互作用都顯著增強，加之，寡聚度的增加，使得表面活性劑自身的聚集能力顯著增強，使得葉酸所處的微環(huán)境發(fā)生了更加顯著的變化。進一步的機理研究將在下面的文中闡述。

3.2 SDS、DTAB、12-6-12和12-3-12-3-12與葉酸混合體系的聚集體尺寸

四種表面活性劑在100 μmol·L-1葉酸存在時聚集體的大小隨濃度的變化規(guī)律如圖3所示。SDS在所研究的濃度范圍內(nèi)，始終形成約為2 nm的小聚集體，這表明葉酸的存在不能誘導(dǎo)SDS發(fā)生聚集體轉(zhuǎn)變。DTAB在濃度為5.0-7.0 mmol·L-1時形成的是400 nm左右的大聚集體，當濃度大于10.0 mmol·L-1時，聚集體尺寸逐漸變小，濃度為15.0 mmol·L-1時，開始出現(xiàn)小聚集體，之后隨著濃度的增加，小聚集體逐漸增加，大聚集體逐漸減少；12-3-12-3-12的聚集體變化規(guī)律和DTAB相似，都是在較低濃度時形成大聚集體，在濃度為0.7 mmol·L-1時開始出現(xiàn)小聚集體。DTAB帶一個正電荷，12-3-12-3-12帶3個正電荷，葉酸帶兩個負電荷，我們推測，當表面活性劑濃度較低時，表面活性劑分子與葉酸完全結(jié)合，表面活性劑極性頭基的電荷被中和，頭基間的靜電排斥減弱，因而極性頭基可以緊密排列，此時有利于形成曲率較小、尺寸較大的聚集體；當表面活性劑濃度增加時，葉酸分子的數(shù)目不足以與所有的表面活性劑分子結(jié)合，表面活性劑分子本身可以自組裝形成聚集體。對于DTAB，在濃度遠遠大于葉酸濃度時，尾鏈之間的疏水相互作用較12-6-12和12-3-12-3-12弱，而頭基之間的靜電排斥作用較它們強，因而容易自聚集形成小聚集體；對于12-3-12-3-12，在濃度為0.7 mmol·L-1時，由于葉酸的濃度為0.10 mmol·L-1，因此，與葉酸的電荷計量比為21 : 2，此時12-3-12-3-12與葉酸的靜電結(jié)合早已達到飽和，由于12-3-12-3-12在濃度剛過CMC時容易形成球形小膠束，所以此時12-3-12-3-12與葉酸混合體系中小聚集體的出現(xiàn)有可能是12-3-12-3-12本身形成的球形膠束。但是，在整個研究范圍內(nèi)12-6-12與葉酸形成的都是100 nm左右的聚集體，借鑒我們課題組之前對于表面活性劑與姜黃素相互作用的研究結(jié)果27推測：12-6-12有兩個正電荷，而葉酸具有兩個負電荷，葉酸分子為了中和更多的電荷以及更好地與12-6-12的疏水鏈發(fā)生疏水相互作用，即更好地插入12-6-12形成的聚集體中，一個葉酸分子有可能分別與兩個12-6-12結(jié)合，葉酸分子有可能將更多地與12-6-12橋連起來，形成類似于寡聚表面活性劑的復(fù)合體，這樣12-6-12頭基之間的靜電排斥能很好地被屏蔽，因而，12-6-12與葉酸形成的都是尺寸較大的聚集體。

圖3 pH 7.0時(a) SDS，(b) DTAB，(c) 12-6-12(d) 12-3-12-3-12在100 μmol·L-1葉酸存在時聚集體尺寸分布隨表面活性劑濃度的變化Fig. 3 Size distributions of (a) SDS, (b) DTAB,(c) 12-6-12, (d) 12-3-12-3-12 at different concentration in the presence of 100 μmol·L-1 folic acid at pH 7.0.

3.3 SDS、DTAB、12-6-12和12-3-12-3-12對葉酸穩(wěn)定性的影響

圖4 pH 7.0時100 μmol·L-1葉酸在(a) SDS，(b) DTAB，(c) 12-6-12，(d) 12-3-12-3-12存在時剩余量隨時間的變化Fig. 4 Decay of 100 μmol·L-1 folic acid in the presence of(a) SDS, (b) DTAB, (c) 12-6-12, (d) 12-3-12-3-12 at pH 7.0.

葉酸在紫外光的照射下會發(fā)生光氧化降解，降解是因為對氨基苯甲酸與喋呤啶連接處的仲胺對光不穩(wěn)定，降解分為兩步進行，第一步氨基氧化為醛基，第二步是醛基氧化為羧基。當葉酸沒有降解時，谷氨酸片段會產(chǎn)生熒光猝滅效應(yīng)，因此檢測不到熒光信號；而當葉酸降解時，熒光強度會顯著增加。產(chǎn)生熒光的片段是喋呤啶片段，因此我們可以通過表征體系的熒光強度變化來確定葉酸的穩(wěn)定性。圖4表示的是在不同濃度的四種表面活性劑存在時，葉酸剩余量與時間的變化曲線。我們將初始的葉酸含量定義為100%，根據(jù)熒光強度的比值計算得到隨時間增加葉酸的剩余量。從圖中可以看出，在沒有表面活性劑存在時，葉酸在140 min后幾乎完全降解，而在有表面活性劑存在時，葉酸剩余量明顯增加，且隨著四種表面活性劑濃度的提高剩余量都逐漸增加。但四種表面活性劑對葉酸剩余量的影響差異較大，在所研究的濃度范圍內(nèi)，SDS在15.0 mmol·L-1時，葉酸的剩余量基本保持穩(wěn)定為43%，而對于三種陽離子表面活性劑DTAB、12-6-12、12-3-12-3-12，最后的剩余量分別為89%、96%和96%，但達到最大剩余量的濃度有較大差異，分別為15.0、4.0以及0.30 mmol·L-1。這表明隨著表面活性劑寡聚度的增加，可以使用少量的表面活性劑就能很好地保護葉酸。因為DTAB、12-6-12和12-3-12-3-12本身的聚集能力存在顯著差異，12-3-12-3-12的臨界膠束濃度很低，在很低的濃度下就能形成聚集體，因而能很好地增溶與包裹葉酸。

3.4 SDS、DTAB、12-6-12和12-3-12-3-12與葉酸的作用機理

我們利用等溫滴定量熱技術(shù)(ITC)研究了葉酸與表面活性劑的相互作用過程40，實驗結(jié)果如圖5所示。為了減少實驗誤差，得到較強的熱量信號，在此實驗中，我們提高了葉酸的使用濃度。實驗過程是將0.50 mmol·L-1的葉酸水溶液滴定到高濃度的表面活性劑的膠束水溶液中。圖中曲線已經(jīng)扣除葉酸溶液滴定水的熱量變化。如圖所示，SDS與葉酸的相互作用和其它三種陽離子表面活性劑與葉酸的相互作用顯著不同。葉酸逐滴滴入SDS時，呈現(xiàn)出來的是一個逐漸吸熱的過程且能量變化很小，這表明葉酸與SDS的相互作用很弱。三種陽離子表面活性劑與葉酸相互作用時的熱量變化趨勢一致：首先出現(xiàn)的是一個放熱過程，此過程歸因于葉酸分子與表面活性劑的靜電結(jié)合；然后隨著表面活性劑濃度的增加，放熱量逐漸增加；當DTAB、12-6-12、12-3-12-3-12的濃度分別大于2.0、2.5、0.5 mmol·L-1時，放熱量逐漸減少時，體系熱量變化趨向于0，這意味著相互作用已經(jīng)結(jié)束，或是葉酸已經(jīng)完全增溶于陽離子表面活性劑膠束中，這也證明對于增溶或包裹同等濃度的葉酸，對于同種類型的表面活性劑，隨著表面活性劑寡聚度的增加，所需表面活性劑的濃度降低。

圖5 pH 7.0時葉酸溶液滴定(a) SDS，(b) DTAB，(c) 12-6-12，(d) 12-3-12-3-12的ITC曲線Fig. 5 ITC curves of titrating folic acid into (a) SDS, (b) DTAB, (c) 12-6-12, (d) 12-3-12-3-12 at pH 7.0.

圖6 (a) SDS，(b) DTAB，(c) 12-6-12在葉酸存在時的NOE光譜Fig. 6 (a) NOE spectra of the (b) SDS (c) DTAB (d) 12-6-12 in the presence of folic acid.

為了進一步研究葉酸與表面活性劑的作用機理，我們利用二維核磁氫譜(NOE)試圖了解葉酸與表面活性劑作用時的空間位置。二維NOE增強譜(Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy，NOESY)能直接提供質(zhì)子空間距離的信息。由于核間的Overhauser效應(yīng)，核間距離小于或者接近0.5 nm的兩個質(zhì)子會出現(xiàn)交叉峰，其強度與質(zhì)子間距(d)的六次方成反比。NOESY能直觀地呈現(xiàn)出分子的微觀結(jié)構(gòu)，因此可以判斷表面活性劑分子的排列方式。如圖6所示，SDS的相關(guān)峰很弱，且只存在自相關(guān)峰，表明SDS分子在空間上排列得較為松散。黃色部分的相關(guān)峰在DTAB和12-6-12當中都存在，a-bc對應(yīng)了表面活性劑烷基鏈之間重疊，bc-de處的交叉峰意味著DTAB和12-6-12分子的疏水鏈排列緊密。顯著不同的是，在12-6-12的NOE圖譜中，存在綠色部分的abcde-f相關(guān)峰，表明12-6-12在形成的聚集體中烷基尾鏈的末端質(zhì)子(a)和頭基上的質(zhì)子(e和f)在空間上距離很近，這說明12-6-12分子排列更加緊密疏水鏈彼此交叉深入。與前兩種表面活性劑的聚集體相比，12-6-12表面活性劑在此結(jié)構(gòu)中的排列更加緊密，這種緊密的堆積使得葉酸能夠更好地隔絕外部環(huán)境，這也就解釋了為什么12-6-12抑制葉酸光氧化降解的效率比DTAB高。對于12-3-12-3-12，情況更加不同，由于12-3-12-3-12形成的聚集體中的分子排布非常緊密，核磁信號非常微弱，交叉峰淹沒在了噪音中，實驗無法得到高質(zhì)量的圖譜。

4 結(jié)論

綜上所述，本工作研究了pH為7.0時葉酸對四種不同電荷、不同寡聚度的表面活性劑表面活性、膠束化行為、聚集體尺寸的影響以及表面活性劑對葉酸光氧化降解行為的影響。表面張力測試結(jié)果表明，葉酸能明顯提高陽離子型表面活性劑的表面活性，這體現(xiàn)在顯著降低的臨界聚集濃度和表面張力上，葉酸卻對陰離子型表面活性劑SDS的表面活性幾乎沒有影響。葉酸與陽離子型表面活性劑之間存在強烈的靜電相互作用，可以屏蔽表面活性劑極性頭基之間的靜電斥力，從而促進表面活性劑的聚集。動態(tài)光散射結(jié)果表明，葉酸不會誘導(dǎo)SDS發(fā)生聚集轉(zhuǎn)變，卻會誘導(dǎo)陽離子型表面活性劑首先形成尺寸較大的聚集體，然后向小聚集體轉(zhuǎn)變，在葉酸存在時，12-6-12和12-3-12-3-12與葉酸都形成了較大的聚集體。這些葉酸參與形成的表面活性劑聚集體顯著影響了葉酸的光氧化降解行為，其中，陽離子型表面活性劑能夠抑制葉酸的光氧化降解，且隨著表面活性劑寡聚度的增加，抑制效率增大，而所需表面活性劑的濃度顯著降低。我們推測隨著陽離子型表面活性劑寡聚度的增加，二者之間靜電相互作用的位點增加，疏水相互作用增強。等溫滴定量熱和NOE的結(jié)果表明，葉酸與12-6-12和12-3-12-3-12作用時，由于強烈的靜電相互作用和疏水相互作用，表面活性劑分子在聚集體中緊密排列，這樣葉酸的不穩(wěn)定部分能更好地被包裹在聚集體的疏水微區(qū)，從而能夠與外界環(huán)境更好地隔離，得到保護。簡而言之，本工作實現(xiàn)了用簡單的小型功能分子調(diào)控表面活性劑聚集行為，同時又為不穩(wěn)定小分子選擇合適的載體提供了新的思路。