類胡蘿卜素聚集體的研究進(jìn)展

趙英源，賈慧慧，李紫薇，梁 晉，張勝夢(mèng)，李一帆，王昭萱，李瑞芳

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

1831年德國(guó)化學(xué)家Wackenroder從胡蘿卜根中分離得到一種色素，將其命名為胡蘿卜素[1]。Berzelius[2]從落葉中分離提取出黃色的極性色素，將其命名為葉黃素。隨后研究人員又分離出一系列的天然色素，并將其統(tǒng)稱為類胡蘿卜素。目前被發(fā)現(xiàn)的天然類胡蘿卜素已達(dá)800多種[3]。類胡蘿卜素由于極強(qiáng)的抗氧化能力備受人們青睞，但水分散性和穩(wěn)定性的不足也使其應(yīng)用受到一定限制[4]，在水合有機(jī)體系中類胡蘿卜素可自發(fā)形成聚集體的形態(tài)，這種聚集體能表現(xiàn)出不同于其單體形式的特殊光學(xué)性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征[5]，所以研究類胡蘿卜素聚集體具有重要意義。作者重點(diǎn)綜述了在水合有機(jī)體系中類胡蘿卜素聚集體的形成機(jī)理、影響因素、研究方法及潛在應(yīng)用，有望為其在食品、醫(yī)藥、生物和化工等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 類胡蘿卜素概述

1.1 類胡蘿卜素的來源

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，廣泛存在于動(dòng)物、高等植物、藻類和微生物中[6]。不同類型的類胡蘿卜素的分布有所差異，以6種典型類胡蘿卜素(番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、蝦青素、β-胡蘿卜素和巖藻黃質(zhì))為代表具體介紹。番茄紅素幾乎僅存在于番茄和以番茄為基礎(chǔ)的產(chǎn)品中[7]；葉黃素廣泛存在于水果、蔬菜、花卉和一些藻類中，其中萬(wàn)壽菊中含量最高[8]；玉米黃質(zhì)與葉黃素互為同分異構(gòu)體，主要來源于綠色葉類蔬菜、花卉、水果、枸杞和黃玉米等[9]；蝦青素的主要來源為甲殼類動(dòng)物的殼和紅法夫酵母菌[10]；β-胡蘿卜素主要來源于南瓜、芒果、胡蘿卜和菠菜等水果或蔬菜[11]；巖藻黃質(zhì)廣泛存在于各種藻類、海洋浮游植物、水生貝殼類等動(dòng)植物中[12]。

1.2 類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)和種類

大多數(shù)類胡蘿卜素可以用通式C40H56On(n為0～6)來表示，典型的類胡蘿卜素是由8個(gè)異戊二烯單位首尾相連形成。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同可以分為2大類[13]：一類只含C、H兩種元素，如番茄紅素和β-胡蘿卜素等；一類含C、H、O 3種元素，可形成羥基、酮基、羧基、甲氧基等含氧官能團(tuán)，如蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)和巖藻黃質(zhì)等[14]。

1.3 類胡蘿卜素的生理活性

類胡蘿卜素有很多生理活性，它不僅是動(dòng)物體內(nèi)維生素A的主要來源，同時(shí)還具有抗氧化[15]、免疫調(diào)節(jié)[16]、抗癌[17]、預(yù)防心血管疾病[18]等功效，在食品[19]、醫(yī)藥[20]、生物和化工[21]等領(lǐng)域中均發(fā)揮著重要作用。

番茄紅素在防癌、治癌方面的功效不斷被證實(shí)，且其抗氧化作用在類胡蘿卜素中最強(qiáng)[22]。葉黃素可通過抑制活性氧自由基的活性，阻止活性氧自由基對(duì)正常細(xì)胞的破壞，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力[23]。玉米黃質(zhì)因其抗炎和抗氧化作用，可作為治療潰瘍性結(jié)腸炎的有效治療候選物[24]。Miki[25]早在1991年就研究了類胡蘿卜素的猝滅單線態(tài)氧和清除自由基能力，蝦青素在抗氧化方面有顯著效果，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)人體健康、預(yù)防各種疾病的作用[10]。β-胡蘿卜素的代謝、在組織中的積累以及向維生素A的轉(zhuǎn)化，決定了β-胡蘿卜素在滿足人類對(duì)維生素A需求方面所起的作用[26]。巖藻黃質(zhì)具有抗肥胖、調(diào)節(jié)血糖、抗腫瘤、抗氧化、抗血管新生等多種生理活性[27]。

2 類胡蘿卜素聚集體

Jelley[28]和Scheibe[29]發(fā)現(xiàn)了分子的聚集現(xiàn)象，聚集體往往具有不同于單體分子的光學(xué)特性和理化性質(zhì)。在有機(jī)溶劑-水體系中，類胡蘿卜素單個(gè)分子可自發(fā)形成不同結(jié)構(gòu)的聚集體[5]。根據(jù)體系的紫外-可見吸收光譜的變化可分為2類，即光譜藍(lán)移為H聚集體，光譜紅移為J聚集體。除了含水體系外，在自然或人工控制的環(huán)境下，類胡蘿卜素也能形成一定的聚集體類型[30]。常見的番茄紅素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、蝦青素、β-胡蘿卜素和巖藻黃質(zhì)等類胡蘿卜素在一定條件下均可形成H聚集體或J聚集體，而其他類胡蘿卜素的聚集體目前尚未見相關(guān)深入的研究報(bào)道。

2.1 類胡蘿卜素聚集體的形成機(jī)理

聚集體形成的原因是多個(gè)非共價(jià)分子間的相互作用[31-32]，如范德華力、疏水相互作用力、靜電相互作用力和氫鍵力等[4]。通過分子間相互作用的激發(fā)，類胡蘿卜素分子可在有機(jī)溶劑-水體系中自聚集形成有序的不同類型的聚集體[4,33-34]。強(qiáng)相互作用使分子間面對(duì)面平行緊密堆積，形成H聚集體，系統(tǒng)形成較高的激發(fā)態(tài)；弱相互作用使分子間錯(cuò)位松散堆積，形成J聚集體，系統(tǒng)形成較低的激發(fā)態(tài)。從紫外-可見吸收光譜看，H聚集體在有機(jī)溶劑-水體系中的吸收光譜發(fā)生藍(lán)移，J聚集體的吸收光譜發(fā)生紅移[35-36]。用動(dòng)力學(xué)模型來解釋，聚集體的形成是兩步連續(xù)的反應(yīng)。在一定條件下，一些影響因素單一或共同作用，通過影響速率常數(shù)來形成H聚集體或J聚集體[36]。

2.2 類胡蘿卜素聚集體類型的影響因素

在有機(jī)溶劑-水體系中，水的占比、溫度、pH值、類胡蘿卜素的初始濃度、反應(yīng)時(shí)間、表面活性劑等對(duì)聚集體類型都有重要影響[5,36-37]。而有機(jī)溶劑-水體系中水的占比，即有利于氫鍵形成的羥基和羰基的多少是影響聚集體類型的根本因素[38]。主要介紹有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)、初始濃度、加樣速度、溫度及外來添加溶劑等對(duì)聚集體類型的影響。其中，在一定條件下，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)和類胡蘿卜素初始濃度是決定聚集體類型的因素，溫度和外來添加溶劑是改變聚集體類型的因素，但是關(guān)于加樣速率和溫度是否決定聚集體類型尚無(wú)更多報(bào)道。

2.2.1 有機(jī)溶劑的體積分?jǐn)?shù)

體系中促進(jìn)氫鍵生成有利于H聚集體的形成，抑制氫鍵生成則有利于J聚集體的形成[39]。類胡蘿卜素具有強(qiáng)疏水性，水體積分?jǐn)?shù)增大，則形成更多的氫鍵，有利于類胡蘿卜素形成卡包結(jié)構(gòu)的H聚集體。相反，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)增大，有利于形成J聚集體。劉翔等[4]研究發(fā)現(xiàn)，水分含量高易形成玉米黃質(zhì)H聚集體，水分含量低則易形成頭尾結(jié)構(gòu)的J聚集體。此外，Billsten等[40]在不同比例的水-乙醇溶液體系中同樣發(fā)現(xiàn)玉米黃質(zhì)J聚集體的形成需要乙醇含量高。Zhu等[41]通過不同比例的DMSO-水溶液體系的蝦青素吸收光譜確定了有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)為10%～50%是蝦青素聚集體存在的范圍，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)為50%左右，蝦青素大多以J聚集體的形式存在，有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)減小，則形成了H聚集體。

2.2.2 類胡蘿卜素的初始濃度

盧禮萍[30]采用Frenkel激子理論，模擬了3類典型的色素聚集體的吸收光譜和激子動(dòng)力學(xué)過程，結(jié)果表明色素聚集體中分子間距是決定其激子動(dòng)力學(xué)過程的主要因素之一。由此可見，類胡蘿卜素的初始濃度影響分子間距，從而決定類胡蘿卜素的聚集體類型。劉翔等[4]研究發(fā)現(xiàn)，高初始濃度是導(dǎo)致玉米黃質(zhì)J聚集體的形成因素，低初始濃度是導(dǎo)致玉米黃質(zhì)H聚集體的形成因素。此外，Billsten等[40]同樣發(fā)現(xiàn)在不同比例的水-乙醇溶液體系中玉米黃質(zhì)J聚集體的形成需要較高的初始濃度。Zhu等[41]選擇525 nm處的吸光度來確定水與乙醇的臨界聚集比(Critical aggregation ratio，CAR)，高初始濃度時(shí)制備的J聚集體的CAR低于低初始濃度，即高初始濃度更有利于形成J聚集體。

2.2.3 水入有機(jī)相的加樣速率

水入有機(jī)相的速率會(huì)影響分子間氫鍵的形成，所以水入有機(jī)相的加樣速率也是影響聚集體類型的一個(gè)重要因素。Zhu等[41]發(fā)現(xiàn)：當(dāng)快速將水滴加入巖藻黃質(zhì)乙醇溶液中時(shí)，巖藻黃質(zhì)的吸收光譜從445 nm藍(lán)移至435 nm，形成卡包結(jié)構(gòu)的H聚集體；當(dāng)緩慢加入水時(shí)，巖藻黃質(zhì)的吸收光譜從445 nm紅移至466 nm，形成頭尾結(jié)構(gòu)的J聚集體。選擇419 nm和525 nm處的吸光度來確定水與乙醇的臨界聚集比。當(dāng)水/乙醇迅速增加(500 μL/min)到66.7/33.3(V/V)時(shí)，巖藻黃質(zhì)在419 nm處的吸光度開始密集地下降。當(dāng)水/乙醇緩慢增加(20 μL/min)到60/40(V/V)時(shí)，巖藻黃質(zhì)在525 nm處的吸光度開始上升，這被認(rèn)為是J聚集體的CAR[41]。即有機(jī)溶劑-水體系中，在水分含量增加的情況下，即有利于氫鍵的生成時(shí)，快速加水稀釋形成H聚集體，緩慢加水稀釋形成J聚集體。

2.2.4 水合有機(jī)體系的溫度

溫度作為環(huán)境影響因素，作用于溶液中的氫鍵，對(duì)類胡蘿卜素聚集類型的轉(zhuǎn)變和聚集分子的能量轉(zhuǎn)移發(fā)揮了重要的作用[30]。盧禮萍[30]研究發(fā)現(xiàn)在15 ℃時(shí)，1∶ 1的乙醇-水溶液中β-胡蘿卜素形成H聚集體和J聚集體，隨著溫度的增加，H聚集體逐漸轉(zhuǎn)化為J聚集體。魏良淑等[42]研究發(fā)現(xiàn)，在乙醇-水溶液中，葉黃素部分形成聚集體，部分以單體形式存在，隨著溫度的升高，H聚集體吸收減弱，M單體吸收增強(qiáng)。較高溫度(45 ℃以上)時(shí)，高濃度的葉黃素溶液中葉黃素又以H聚集體形式存在，低濃度葉黃素溶液中以M單體形式穩(wěn)定存在。Giovannetti等[36]在蝦青素甲醇-水溶液中發(fā)現(xiàn)，低溫有利于蝦青素H聚集體的形成，而要實(shí)現(xiàn)H聚集體向J聚集體的轉(zhuǎn)化，溫度至少升高至50 ℃。由此可見，低溫有利于氫鍵的形成與穩(wěn)定，因此形成H聚集體，隨著溫度升高，氫鍵被破壞，從而影響了反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，促使H聚集體向J聚集體轉(zhuǎn)化。同時(shí)，較高溫度下，分子間距也是影響類胡蘿卜素聚集類型的重要因素。

2.2.5 混合溶液的外來添加溶劑

外來溶劑的加入，會(huì)使得類胡蘿卜素分子與環(huán)境產(chǎn)生一定的相互作用，通過此作用影響類胡蘿卜素聚集體的轉(zhuǎn)變和能量轉(zhuǎn)移。Dong等[43]研究發(fā)現(xiàn)，番茄紅素在丙酮-水、異丙醇-水和DMSO-水混合溶液中可形成H聚集體和J聚集體。通過紫外-可見光譜測(cè)定番茄紅素聚集體的變化，當(dāng)丙酮-水、異丙醇-水和DMSO-水混合溶劑在0 ℃下加入3種不同量的甲苯時(shí)，均呈現(xiàn)H聚集體向J聚集體轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，H聚集體吸收減弱，J聚集體吸收增強(qiáng)，并且丙酮-水混合溶劑光譜變化不大，相對(duì)穩(wěn)定。異丙醇-水混合溶劑中，光譜吸光度變化較為明顯。在DMSO-水混合溶劑中，光譜變化明顯，并析出微晶[43]。即加入外來添加劑也會(huì)影響聚集體的類型。

2.2.6 其他

類胡蘿卜素分子間存在相互作用，分子與環(huán)境間也存在弱相互作用，都影響著類胡蘿卜素聚集體的構(gòu)型及能量轉(zhuǎn)移。除以上介紹的影響類胡蘿卜素聚集體的因素外，有機(jī)溶劑-水體系的pH值通過影響氫鍵的形成從而間接影響類胡蘿卜素聚集體的形成，如強(qiáng)堿條件下，生成氫鍵的能力被抑制，則有利于形成J聚集體[4]；向體系中添加的表面活性劑也能改變聚集體的類型，如向蝦青素的水溶液中加入不同濃度的表面活性劑，聚集體類型發(fā)生改變，加入的表面活性劑濃度越大，形成的H聚集體越多[4]；薛長(zhǎng)湖等[44]在制備不同類型聚集體時(shí)，除了不同的有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)和攪拌時(shí)間外，所用的磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速也是影響聚集體類型的因素。

2.3 類胡蘿卜素聚集體的研究方法

2.3.1 紫外-可見光光譜法

Zajac等[45]研究發(fā)現(xiàn)葉黃素在丙酮-水體系中會(huì)形成H聚集體和J聚集體。根據(jù)紫外-可見光譜的變化，發(fā)現(xiàn)溶液中葉黃素的吸收光譜分為兩部分，一部分從447 nm處藍(lán)移至378 nm處形成H聚集體，另一部分從447 nm處紅移至454 nm處形成J聚集體[45]。劉翔等[4]研究發(fā)現(xiàn)在乙醇-水的體系中，玉米黃素單體特征吸收峰為485 nm，其H聚集體的特征吸收峰為400 nm(藍(lán)移)，其J聚集體的特征吸收峰為530 nm(紅移)。

2.3.2 顯微鏡觀察法

Subramanian等[46]在場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM)下觀察丙酮-水溶液中產(chǎn)生的蝦青素H和J聚集體，發(fā)現(xiàn)卡包結(jié)構(gòu)的蝦青素H聚集體呈現(xiàn)片狀結(jié)構(gòu)具有層狀特征，頭尾結(jié)構(gòu)的J聚集體則呈現(xiàn)纖維狀結(jié)構(gòu)，這表明2種聚集體可能有著不同的結(jié)合機(jī)制。Zsila等[47]在原子力顯微鏡(AFM)下觀察到葉黃素的纖維狀結(jié)構(gòu)，可能有助于光譜的移動(dòng)。

2.3.3 圓二色性光譜法

Zagac等[45]根據(jù)圓二色譜變化，發(fā)現(xiàn)在葉黃素H聚集體中光譜顯示了一個(gè)強(qiáng)烈的負(fù)激子耦合效應(yīng)，這是由于緊密的、平行堆積的多烯發(fā)色團(tuán)具有左手螺旋性的手性排列。在葉黃素J聚集體中具有正激子耦合效應(yīng)，這表明J聚集體具有右旋螺旋性[45]。Dudek等[48]通過圓二色譜檢測(cè)乙醇-水體系中的玉米黃質(zhì)H聚集體和J聚集體，發(fā)現(xiàn)玉米黃質(zhì)單體由于存在末端環(huán)，在288 nm和249 nm處導(dǎo)致了低旋光性，主吸收帶內(nèi)沒有CD信號(hào)。較低的有機(jī)相比例制備出的玉米黃質(zhì)H聚集體和J聚集體均表現(xiàn)出正手性，呈現(xiàn)出右旋螺旋結(jié)構(gòu)。

2.3.4 拉曼光譜法

2.3.5 熒光光譜法

Zhu等[41]研究表明，乙醇中的巖藻黃質(zhì)單體沒有出現(xiàn)明顯的散射峰。去離子水稀釋后，巖藻黃質(zhì)的三維熒光圖中可見一階散射峰，這證實(shí)了H聚集體和J聚集體的存在。這種效應(yīng)可能是由于巖藻黃質(zhì)聚合導(dǎo)致分子大小的增加，進(jìn)而導(dǎo)致散射增加。盧禮萍[30]研究表明，形成聚集體后，由于分子間的相互作用，使得系統(tǒng)的電子能級(jí)也發(fā)生了變化。在368 nm的激發(fā)下，葉黃素聚集體的發(fā)射峰位于421 nm，來源于聚集體中較高能級(jí)的發(fā)射，右側(cè)的發(fā)射峰來源于較高電子激發(fā)態(tài)上不同振動(dòng)能級(jí)的發(fā)射。當(dāng)葉黃素聚集體溶液被445 nm激發(fā)時(shí)(該波段對(duì)應(yīng)單體分子的吸收)，出現(xiàn)2個(gè)主要發(fā)射帶512 nm和564 nm，這主要來源于1→0，0→0的發(fā)射，為單體發(fā)射。

2.3.6 其他研究方法

分子聚集體中電子轉(zhuǎn)移可觀察到激子效應(yīng)，表現(xiàn)為吸收峰的較大移動(dòng)等光譜變化。激子理論模型可通過光譜變化計(jì)算集體的結(jié)構(gòu)參數(shù)。其他關(guān)于聚集體分子的相關(guān)研究方法未見報(bào)道，但是根據(jù)現(xiàn)有的技術(shù)，有較多研究方法可對(duì)類胡蘿卜素單體進(jìn)行定性和定量表征，如高效液相色譜法[49]、紅外光譜法[50]、差示掃描量熱法等[51]。

2.4 類胡蘿卜素聚集體的潛在應(yīng)用

類胡蘿卜素聚集體較類胡蘿卜素單體不同的狀態(tài)和可能存在的生理活性的差異，使類胡蘿卜素可更好地應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域。薛長(zhǎng)湖等[44]已研究出H1、H2或J型蝦青素聚集體水分散體系，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、生物等方面。類胡蘿卜素聚集體具有優(yōu)良的耐光性，對(duì)食品、化妝品、藥物制品以及非食用物品的著色非常有利[52]。

類胡蘿卜素化合物在食品中的存在形式對(duì)其生理活性和營(yíng)養(yǎng)功能具有較大影響[4]。Hempel等[53]研究發(fā)現(xiàn)，在不同條件下玉米黃質(zhì)H和J聚集體的生物利用度有一定的區(qū)別。魏良淑等[42]發(fā)現(xiàn)在丙酮-水溶液中，葉黃素均以較為穩(wěn)定的H聚集體存在，為開發(fā)可溶性類胡蘿卜素的功能性食品和藥品提供了參考。趙文紅等[54]發(fā)現(xiàn)在丙酮-水溶液體系中番茄紅素呈H聚集體，在弱酸或弱堿條件下較穩(wěn)定。以上均為拓展類胡蘿卜素聚集體在醫(yī)藥、食品、化妝品等方面的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

3 總結(jié)與展望

主要對(duì)6種類胡蘿卜素分子在水合有機(jī)溶劑中聚集體的類型、結(jié)構(gòu)、形成機(jī)理、影響因素、研究方法等進(jìn)行了詳細(xì)的闡述。目前可控制備可以穩(wěn)定存在的聚集體還是一個(gè)很大的挑戰(zhàn)，不同類胡蘿卜素間的生理活性差異和區(qū)別也不明晰，導(dǎo)致類胡蘿卜素聚集體在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域尚無(wú)成熟的應(yīng)用。拓寬小分子的研究范圍、解決聚集體生物利用度低等問題、可控單一制備聚集體并研究其生理活性差異是進(jìn)一步的研究方向。如今作為研究熱點(diǎn)的納米技術(shù)或許可以解決類胡蘿卜素不穩(wěn)定、難溶于水和生物利用率低等問題。此外，還可以改造類胡蘿卜素聚集體的結(jié)構(gòu)使其穩(wěn)定存在。在此條件下，探究不同聚集體間生理活性的差異也就水到渠成。