三種淀粉樣前體蛋白胞外結(jié)構(gòu)域突變體的建立及功能驗證*

張鵬， 崔冬冰， 舒莉萍**， 范安然**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室, 組織工程與干細(xì)胞實驗中心， 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點實驗室， 貴州 貴陽 550004; 2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550004)

阿爾茨海默綜合征(alzheimer's disease,AD)是最常見的一種神經(jīng)退行性疾病，也是癡呆癥的最常見類型，全球范圍內(nèi)每7 s就有一個AD新病人產(chǎn)生[1]。盡管AD的病原學(xué)以及病理學(xué)傳播機(jī)制仍存在很大爭議，但是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)及其加工被認(rèn)為在AD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用[2]。APP是一種I型跨膜蛋白，是AD病人大腦中淀粉樣斑塊中的β-淀粉肽的來源[3]，但對APP的各個結(jié)構(gòu)域的空間結(jié)構(gòu)、以及各個結(jié)構(gòu)域怎樣通過與其他分子相互作用發(fā)揮功能仍不清楚[4]。APP的胞外結(jié)構(gòu)域，特別是可以與多種胞外蛋白相互作用的E1和E2結(jié)構(gòu)域 (extracellular domain 1,extracellular domain 2)，可能是APP激活信號通路及發(fā)揮生理學(xué)功能的重要原因[5]。因此，為研究APP胞外結(jié)構(gòu)域的功能，本研究建立了3種表達(dá)APP胞外結(jié)構(gòu)域突變體的細(xì)胞株及表達(dá)野生型APP的細(xì)胞株，并對這幾種細(xì)胞株是否可以作為APP結(jié)構(gòu)域功能研究的有利模型進(jìn)行篩選，報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰消化酶、100×非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇及100 000 U/L青鏈霉素均來自Gibco公司，F(xiàn)uGENE 6質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑購自Roche公司，6E10抗體、G418及β-巰基乙醇購自Sigma公司，羊抗鼠IgG來自北京索萊寶科技有限公司，24孔板、T25培養(yǎng)瓶及T75培養(yǎng)瓶購自Corning公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自天根公司；2× hot start PCR 預(yù)混液購自TAKARA公司，T4連接酶、內(nèi)切酶SgfI及MluI購于NEB公司，pCMV-APP695質(zhì)粒購自Addgene，CHO細(xì)胞為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1CHO細(xì)胞培養(yǎng) CHO細(xì)胞系培養(yǎng)于T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并使用DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基組成包括10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、10 mmol/L β-巰基乙醇、1%谷氨酰胺及1%青鏈霉素；每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)， 3 d換1次液，細(xì)胞生長融合度至90%時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2APP突變體片段擴(kuò)增 (1)使用Touchdown PCR的方法進(jìn)行APP突變體片段的擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系： APP695質(zhì)粒2 μL、PCR mix 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，最后用無RNA酶水補(bǔ)足體積到25 μL。Touchdown PCR包括2個階段：階段1為降落階段，以比引物Tm值高10 ℃的溫度作為起始退火溫度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后每經(jīng)過一個循環(huán)退火溫度降低1 ℃，直到退火溫度降到比Tm值低5 ℃為止，共進(jìn)行15個循環(huán)；階段2為普通擴(kuò)增階段，在此階段中，使用第1個階段中所確定的最終退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增。(2)使用融合PCR構(gòu)建E2結(jié)構(gòu)域突變體，融合PCR是將多個基因片段連接起來的PCR方法，主要包括3個階段：第1個階段為常規(guī)PCR階段，主要擴(kuò)增E2上游和下游基因，反應(yīng)條件和反應(yīng)體系同Touchdown PCR；第2階段為融合階段，25 μL反應(yīng)體系為上游片段 2 μL、下游片段 2 μL、PCR mix 12.5 μL、最后用無RNA酶水補(bǔ)足體積到25 μL，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性20 s、57 ℃退火20 s、72 ℃延伸40 s、進(jìn)行10個循環(huán)，72 ℃延伸5 min；第3階段是融合后擴(kuò)增階段，取第2階段的反應(yīng)管加入上下游特異性引物，進(jìn)行15個循環(huán)。最后瓊脂糖電泳進(jìn)行驗證。

1.2.3APP突變體蛋白表達(dá)檢測 使用Western blot的方法鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中APP突變體的表達(dá)，步驟為：配制10%分離膠10 mL，并用70%的酒精進(jìn)行液封，分離膠凝好后配制4 mL濃縮膠。細(xì)胞裂解液以及上清的上樣體積為20 μL，將其分別于2×上樣緩沖液混勻后，置于100 ℃水浴煮10 min即可上樣。指示帶泳至膠底部后停止電泳，4 ℃轉(zhuǎn)膜過夜。轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃過夜。次日取出PVDF膜用純水漂洗3次，10 min/次。然后加入二抗窒溫孵育1 h，純水漂洗3次，10 min/次。用ECL液室溫避光孵育，暗室顯影。

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 在CHO細(xì)胞生長融合度為90%時進(jìn)行傳代。使用細(xì)胞計數(shù)板按照1×105密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后換成新鮮培養(yǎng)液；分別將Opti-MEM 50 μL與Fugen HD 3 μL試劑混合，將APP突變體質(zhì)粒1 μg與Opti-MEM 50 μL混合，然后將稀釋后的質(zhì)粒與稀釋后的Fugen HD試劑混合后室溫孵育15 min，最后加入24孔板，每孔50 μL，轉(zhuǎn)染6 h后，換成新鮮培養(yǎng)液。

1.2.5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的篩選 在CHO細(xì)胞轉(zhuǎn)染APP突變體質(zhì)粒后24 h，換成篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基組成為完全培養(yǎng)基加1 g/L的G418，每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，以未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞作為對照。第7 天對照組細(xì)胞基本全部死亡，實驗組部分細(xì)胞繼續(xù)存活；在存活細(xì)胞融合度至90%時，胰酶消化細(xì)胞，稀釋至10 000個/L，然后以100 μL/孔接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后，在顯微鏡下篩選只含1個細(xì)胞的孔，并做標(biāo)記，標(biāo)記孔內(nèi)即為單克隆細(xì)胞系。細(xì)胞融合度至90%時進(jìn)行傳代擴(kuò)大培養(yǎng)，此后降低G418濃度為400 mg/L維持轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 APP蛋白E1結(jié)構(gòu)域突變體細(xì)胞株的建立

通過Touch down PCR方法，將APP基因中編碼E1結(jié)構(gòu)域(extracellular domain 1)的59～608 bp片段進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了長度為1 502 bp的編碼片段(圖1A中的1～5泳道)。將E1結(jié)構(gòu)域突變后的片段與pCMV6載體進(jìn)行重組，使用SgfI和MluI雙酶切驗證，結(jié)果表明重組質(zhì)粒中切出大小為1 502 bp的片段(圖1B泳道1～2，泳道3～4為未酶切質(zhì)粒)，證明載體進(jìn)行了正確重組。最后通過G418抗性篩選出表達(dá)E1結(jié)構(gòu)域突變體的單克隆細(xì)胞株并驗證其表達(dá)和分泌。細(xì)胞總蛋白在75 kDa附近有雜交條帶，且與預(yù)測分子量一致，證明了重組載體可以正常表達(dá)(圖1C泳道1～8)。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中也有與預(yù)測分子量一致的條帶，證明了其可以正常分泌(圖1D泳道1、3～7)。

圖1 APP蛋白E1結(jié)構(gòu)域突變體細(xì)胞株的建立Fig.1 The effect of ED1 deletion on APP expression and secretion

2.2 APP蛋白E2結(jié)構(gòu)域突變體細(xì)胞株的建立

通過常規(guī)PCR的方法，獲得了APP基因中位于E2結(jié)構(gòu)域上游的基因片段，長度為873 bp；同時獲得位于E2結(jié)構(gòu)域下游的基因片段，長度為582 bp(圖2A)，然后通過融合PCR的方法將上下游片段連接，獲得了長度約為1 500 bp的E2結(jié)構(gòu)域編碼序列缺失的APP片段(圖2B)。使用E2結(jié)構(gòu)域突變的片段與pCMV6載體構(gòu)建重組載體，通過SgfI和MluI雙酶切獲得5 000 bp和1 500 bp目的片段，證實了載體的正確重組(圖2C)。通過G418抗性篩選出單克隆細(xì)胞株，使用Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞培養(yǎng)液中dE1突變體蛋白表達(dá)，結(jié)果證實dE1突變體不僅在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖2D)，并且可以正常分泌到胞外空間(圖2E)。

圖2 APP蛋白E2結(jié)構(gòu)域突變體細(xì)胞株的建立Fig.2 The effect of ED2 deletion on APP expression and secretion

2.3 信號肽在調(diào)控胞外結(jié)構(gòu)域的釋放

為了研究信號肽(signal peptide，SP)在APP分泌中的作用，本研究將載體通過SgfI和MluI進(jìn)行雙酶切，去除了大小約為3 000 bp 的APP 全長片段(如圖3A泳道1)，然后與PCR獲得了信號肽缺失的dE1-APP片段(圖3A泳道2)連接后獲得了信號肽缺失的dE1-APP重組載體(dE1-APPΔSP，圖3B)。Western blot結(jié)果顯示信號肽缺失后，APP雖然可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)(圖3C)，但是不能正常分泌到細(xì)胞外空間(圖3D)。

圖3 APP蛋白信號肽缺失和E1結(jié)構(gòu)域突變體細(xì)胞株的建立Fig.3 The effect of ED1 & SP deletion on APP expression and secretion

3 討論

AD的主要病理學(xué)特點是大腦中形成淀粉樣斑塊和神經(jīng)纖維結(jié)節(jié)，其中淀粉樣斑塊是由于APP切割產(chǎn)物Aβ在細(xì)胞外積累形成的，而神經(jīng)纖維結(jié)是由于磷酸化的微管蛋白(Tau)沉積形成[6-7]。盡管AD的病原學(xué)以及病理學(xué)傳播機(jī)制仍存在很大爭議，但是由于APP或者其酶切產(chǎn)物可以導(dǎo)致Tau蛋白磷酸化、突觸功能異常、神經(jīng)元死亡等現(xiàn)象[8-9]，據(jù)此形成了APP處于AD疾病形成的中心位置的假說。所以對APP功能的研究對于揭示AD的發(fā)病機(jī)制的理解具有重要意義。因此，本研究建立起3種APP的突變體，并希望通過觀察3種APP的突變體對APP蛋白的胞外分泌有無影響，探索APP結(jié)構(gòu)跟功能之間的關(guān)系。

APP被α-分泌酶切割后，氨基端會釋放形成可溶性的胞外結(jié)構(gòu)域片段(sAPPα)和由83個氨基酸組成的羧基端(C83會繼續(xù)固定在細(xì)胞膜上)。停留在細(xì)胞膜上的C83會被γ分泌酶繼續(xù)切割形成P3肽段和APP胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域片段(APP intracellular domain，AICD)，這個過程被稱為APP的非淀粉樣形成過程[10-11]。與此類似，APP還可以被β-分泌酶切割形成可溶性的胞外結(jié)構(gòu)域片段(sAPPβ)以及與細(xì)胞膜結(jié)合的99個氨基酸組成的C99片段，C99片段可以被γ分泌酶繼續(xù)切割形成具有神經(jīng)毒性的Aβ片段以及AICD[12]。APP的這種多位點切割以及代謝產(chǎn)物的多樣性使APP可以發(fā)揮多種生理學(xué)功能，但是也使APP的功能確定產(chǎn)生困難[13]。因此合適的APP功能的體外研究模型對于確定APP的正常生理功能和在AD病理學(xué)中的功能至關(guān)重要，本研究建立的幾種細(xì)胞模型，都可以正常表達(dá)APP及其突變體蛋白，并且不會影響它們的正常分泌，因此可以廣泛以用于APP功能的確定。

APP的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，在過去的研究中對于APP結(jié)構(gòu)以及對應(yīng)結(jié)構(gòu)域的具體生物學(xué)功能進(jìn)行了大量研究。APP胞外結(jié)構(gòu)域主要是由E1和E2兩個結(jié)構(gòu)域以及插入在兩者之間的Kunitz結(jié)構(gòu)域(KPI)以及酸性結(jié)構(gòu)域(AcD)組成[14]。E1結(jié)構(gòu)域中含有肝素結(jié)合亞結(jié)構(gòu)域(heparan binding subdomain， HBD)，HBD具有正電荷表面，能夠和帶有負(fù)電荷的分子結(jié)，HBD結(jié)構(gòu)域與生長因子及其受體類似蛋白的結(jié)合位點相似[15]。HBD區(qū)域可以與APP或者淀粉樣前體蛋白類似蛋白(APLP之間通過二硫鍵形成同源二聚體或異源二聚體，從而增加APP在細(xì)胞表面的穩(wěn)定性[16-17]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)APP的E1結(jié)構(gòu)域可以作為類生長因子促進(jìn)神經(jīng)節(jié)的生長[15]；Beher等[18]發(fā)現(xiàn)E1區(qū)域還可以與膠原蛋白I結(jié)合。E1結(jié)構(gòu)域還可以作為肝素的結(jié)合位點，在APP形成二聚體的過程中發(fā)揮重要作用[19]。在E2結(jié)構(gòu)域的近膜端還含有第2個HBD，其對于硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)具有低親和力的結(jié)合能力[20]。E2與HSPG的結(jié)合可以增加APP與其低親和性受體的結(jié)合能力[21-22]。Dahms等[23]通過結(jié)晶學(xué)手段發(fā)現(xiàn)E2結(jié)構(gòu)域可以作為Cd2+的結(jié)合位點，與Cd2+結(jié)合后，可以增加E2結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性。Mayer等[24]的另一項研究發(fā)現(xiàn)E2結(jié)構(gòu)域可以通過與金屬離子的結(jié)合調(diào)節(jié)APP寡聚物的形成。E2結(jié)構(gòu)域也可以做作為硫化肝素的結(jié)合位點，通過與硫化肝素結(jié)合后增加APP的親和性，從而有利于APP與其它輔因子結(jié)合[20]。盡管如此，APP的胞外結(jié)構(gòu)域E1和E2的生理學(xué)作用仍有待于進(jìn)一步研究，與E1和E2結(jié)構(gòu)域相互作用的大量分子也有待于進(jìn)一步擴(kuò)充，并且不同的互作分子與E1和E2結(jié)構(gòu)域結(jié)合后在AD中發(fā)揮什么作用，這些問題對于理解AD的疾病進(jìn)程十分重要。本研究建立的E1和E2結(jié)構(gòu)域突變體細(xì)胞株可以作為確定E1和E2結(jié)構(gòu)域生物學(xué)功能、發(fā)現(xiàn)其互作蛋白的有效模型，在解決上述問題中起到關(guān)鍵作用。

APP的定位和胞內(nèi)轉(zhuǎn)運對于APP的加工和處理十分重要，特定基序缺失的APP，其Aβ的產(chǎn)生會減少[11]。APP蛋白序列中的YENPTY基序?qū)τ贏PP內(nèi)吞和加工發(fā)揮重要作用[25]。在APP蛋白中，其1～18號氨基酸是SP序列，APP的信號肽其作用是在編碼APP的基因翻譯后，將APP前體蛋白導(dǎo)向到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，APP進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后會產(chǎn)生蛋白折疊、磷酸化和糖基化等，同時也是其進(jìn)入細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的關(guān)鍵步驟。本研究發(fā)現(xiàn)缺失信號肽后，盡管APP可以在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，但是其向細(xì)胞外的分泌會受到影響。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了3種淀粉樣前體蛋白胞外結(jié)構(gòu)域突變體細(xì)胞株，并且通過Western blot驗證了不同細(xì)胞株中APP蛋白的表達(dá)及分泌。構(gòu)建的細(xì)胞株可在APP正常生理學(xué)功能和在AD病理學(xué)功能的研究中發(fā)揮重要作用。