Tau蛋白通過(guò)外泌體傳遞到細(xì)胞外空間的研究*

張鵬， 舒莉萍， 周艷華**， 范安然**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心， 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004)

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，在微管聚集和穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用。正常狀態(tài)下，Tau蛋白自身幾乎不表現(xiàn)出聚集的傾向，但是Tau蛋白聚集形成的雙螺旋纖維以及神經(jīng)纖維結(jié)節(jié)是一系列神經(jīng)退行性疾病的主要特征，這些神經(jīng)退行性疾病被稱為Tau蛋白病，其中包括阿爾茨海默綜合征(alzheimer disease，AD)和亨廷頓病額顳葉癡呆等[1]。雖然Tau蛋白的聚集是導(dǎo)致這些神經(jīng)退行性疾病的原因，但是Tau蛋白在神經(jīng)退行性疾病形成聚集物的機(jī)制以及Tau蛋白的病理學(xué)傳播機(jī)制仍然存在爭(zhēng)議[2-3]。外泌體是后期胞內(nèi)體向內(nèi)出芽形成多泡體、是一類納米級(jí)別的生物膜封閉囊泡，隨后在多泡體與細(xì)胞膜融合后被釋放到胞外環(huán)境，這種起源過(guò)程賦予了外泌體具有與起源細(xì)胞類似的膜結(jié)構(gòu)，它們富含膽固醇脂閥、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺[4-5]。研究認(rèn)為外泌體不僅僅是一種消除了多余蛋白或分子的垃圾處理囊泡，還可能是促進(jìn)胞間交流的重要信使，不僅在正常的生理學(xué)過(guò)程中發(fā)揮作用，它們還與許多疾病的病理學(xué)相關(guān)[6-8]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞之間的信息傳遞中也發(fā)揮重要作用[9]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可能是Tau蛋白在細(xì)胞之間傳遞的方式[10]；研究發(fā)現(xiàn)在AD病人中，其外泌體的Tau蛋白水平顯著升高[11]。因此本研究通過(guò)經(jīng)典的超速離心結(jié)合超濾法分離獲得HEK293-Tau細(xì)胞的外泌體，采用Western blot鑒定外泌體特異性標(biāo)記物(HSP70、CD63及CD9)及外泌體和細(xì)胞培養(yǎng)液中Tau蛋白表達(dá)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要材料

DMEM-F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)用血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25%胰消化酶、100×非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇和100 000 U/L青鏈霉素均購(gòu)自Gibco公司，外泌體鑒定抗體和無(wú)外泌體血清購(gòu)自ABI公司，蛋白預(yù)染marker 購(gòu)自Biorad公司，羊抗鼠IgG購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，24孔板、T25培養(yǎng)瓶和25 cm培養(yǎng)板購(gòu)自Corning公司產(chǎn)品，超速離心用離心管和100 KD超濾管購(gòu)自Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HEK293-Tau細(xì)胞培養(yǎng)于T75的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并使用DME-F12完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。完全培養(yǎng)基組成包括10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、10 mmol/L β-巰基乙醇、1%谷氨酰胺及1%青鏈霉素。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，3 d換液1次，細(xì)胞生長(zhǎng)融合度為90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2外泌體分離 HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在25 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿加完全培養(yǎng)基液20 mL，收集前48 h換成無(wú)外泌體血清配制的培養(yǎng)基。48 h后收集細(xì)胞上清液200 mL(10塊細(xì)胞培養(yǎng)皿)，3 462 r/min離心10 min收集上清液，將上清液6 924 r/min繼續(xù)離心20 min去除細(xì)胞；再取上清液15 482 r/min 離心60 min去除細(xì)胞碎片。取上清液用Millipore 100 KD的超濾管濃縮至10 mL，濃縮后48 958 r/min離心90 min，取沉淀用PBS重懸，48 958 r/min離心90 min，PBS重懸沉淀，0.22 μm針頭式過(guò)濾器過(guò)濾，-80 ℃保存。

1.2.3外泌體標(biāo)志物鑒定及Tau蛋白檢測(cè) 采用Western blot方法，配制10%的分離膠10 mL，分離膠凝好后配制4 mL濃縮膠。細(xì)胞裂解液以及上清的上樣體積為20 μL，將其分別于2×上樣緩沖液混勻后，置于100 ℃水浴煮10 min即可上樣；指示帶泳至膠底部時(shí)停止電泳，4 ℃轉(zhuǎn)膜過(guò)夜；轉(zhuǎn)膜完成后，取出PVDF膜，用5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃過(guò)夜；次日取出PVDF膜用雙蒸水漂洗3次，10 min/次。然后加入二抗窒溫孵育1 h，雙蒸水漂洗3次，10 min/次；用ECL液室溫避光孵育，暗室顯影。

1.2.4外泌體測(cè)定 采用Sigma公司的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，在第1孔添加標(biāo)準(zhǔn)品20 μL，2～8孔添加1% SDS 20 μL。然后在第2孔添加蛋白標(biāo)準(zhǔn)品20 μL，混勻后轉(zhuǎn)移20 μL到第3孔進(jìn)行倍比稀釋，通過(guò)這種倍比稀釋的方法將樣品進(jìn)行稀釋逐孔、共7孔，第7孔混勻后取20 μL丟棄。每孔加入BCA工作液200 μL，37 ℃孵育30 min。根據(jù)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)各個(gè)樣本孔的吸光度值求得其實(shí)際濃度。

2 結(jié)果

2.1 外泌體形態(tài)

收集HEK293-Tau細(xì)胞培養(yǎng)液，超速離心結(jié)合超濾離心法，分離外泌體，分離的外泌體稀釋后在透射電鏡下進(jìn)行形態(tài)觀察；外泌體生理狀態(tài)下是球狀結(jié)構(gòu)，但是由于脫水的原因會(huì)造成中間內(nèi)陷，使內(nèi)部折射變?nèi)?，電鏡下外泌體會(huì)呈現(xiàn)杯狀結(jié)構(gòu)。所以本研究所分離獲得的外泌體在電鏡下呈典型的杯狀結(jié)構(gòu)(圖1箭頭所示)。

圖1 透射電鏡下外泌體形態(tài)Fig.1 The morphology of isolated exosomes under transmission electron microscopy

2.2 外泌體表達(dá)特異性標(biāo)記物

通過(guò)細(xì)胞裂解液獲取外泌體總蛋白，然后使用Western blot方法，用外泌體中特異性高表達(dá)的蛋白標(biāo)記物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，外泌體的特異性標(biāo)記物HSP70(圖2A)、CD63(圖2B)和CD9(圖2C)都呈現(xiàn)陽(yáng)性，與電鏡結(jié)果相結(jié)合，更進(jìn)一步證明了所分離的外泌體的可靠性。

注：A為Hsp70、B為CD63、C為CD91，泳道1為外泌體蛋、2為細(xì)胞總蛋白圖2 外泌體標(biāo)志物鑒定(Western blot)Fig.2 The expression of exosome markers on isolated exosomes

2.3 細(xì)胞裂解液、外泌體及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Tau蛋白表達(dá)

使用Tau12抗體對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液及外泌體進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液及外泌體中都可以檢測(cè)到Tau蛋白表達(dá)(圖3)。

圖3 細(xì)胞、外泌體及細(xì)胞培養(yǎng)液中Tau蛋白表達(dá)(Western blot)Fig.3 Tau protein in isolated exosomes and supernatants derived culture media with HEK293-Tau cells

3 討論

Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，在微管聚集和穩(wěn)定方面發(fā)揮重要的作用。正常狀態(tài)下，Tau蛋白自身幾乎不展現(xiàn)出聚集的傾向。但是在AD中，Tau蛋白會(huì)超磷酸化，導(dǎo)致其錯(cuò)誤折疊以及聚集形成神經(jīng)纖維結(jié)節(jié)(neurofibromatosis，NFT)[12]。NFT沉積的出現(xiàn)是以一種獨(dú)特的可預(yù)測(cè)的時(shí)空特異性方式發(fā)生。Braak等[13]將Tau的傳播分為6階段，前兩個(gè)階段的主要特點(diǎn)是Tau先在旁嗅皮層然后在嗅皮層沉積，所以該階段也別稱為旁嗅皮層階段。這一階段，病人的絕大多數(shù)認(rèn)知是正常的；在III、IV階段，NFT密集的出現(xiàn)在嗅皮層的前alpha區(qū)以及CA1區(qū)，海馬下托區(qū)也開始出現(xiàn)NFT；在IV階段CA4區(qū)、杏仁區(qū)、屏狀體、扣帶、丘腦核都受到影響。由于IV階段主要影響大腦的邊緣系統(tǒng)，所以該階段也叫邊緣期；這一階段病人開始表現(xiàn)出輕度認(rèn)知障礙，但是仍可以進(jìn)行日常工作；在第V、VI階段，病原性的Tau幾乎在海馬區(qū)的所有區(qū)域出現(xiàn)，病人表現(xiàn)出大規(guī)模的神經(jīng)元損失，也被稱為島旁區(qū)階段[13]。在AD進(jìn)程中，Tau在大腦中的傳播多數(shù)情況下可以用突觸間傳播解釋，但是其側(cè)向傳播以及長(zhǎng)距離傳播仍不能解釋，但Tau的這種傳播方式如果是通過(guò)大腦的外泌體傳播方式就可以解釋。最近已經(jīng)有研究開始探索AD中外泌體作用于錯(cuò)誤折疊的Tau傳播的可能性[3]。

外泌體是一類納米級(jí)別的生物膜封閉囊泡，其存在于生物體液中，直徑在50～150 nm之間[14]。本研究獲得的外泌體在電鏡下直徑絕大多數(shù)位于這個(gè)范圍。外泌體通?？赏ㄟ^(guò)差速離心方法獲得，但是各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的獲得方法又有所不同。本研究采用超速離心結(jié)合超濾的方法非常有效的分離獲得了外泌體。外泌體生理狀態(tài)下是球狀結(jié)構(gòu)，但是由于脫水的原因會(huì)造成中間內(nèi)陷，使內(nèi)部折射變?nèi)?，電鏡呈現(xiàn)杯狀結(jié)構(gòu)[15]。本研究獲得的外泌體具有典型的杯狀結(jié)構(gòu)。并且外泌體由于其起源于多泡體，所以腔內(nèi)體的蛋白標(biāo)記物被用來(lái)作為外泌體鑒定的標(biāo)記，比如CD81、CD9、CD63和TSG102等[16]。本研究分離的外泌體經(jīng)鑒定HSP70、CD63和CD9均呈現(xiàn)陽(yáng)，進(jìn)一步證明本研究獲得的外泌體的可信度。

最近，有研究發(fā)現(xiàn)外泌體參與了Tau的病理學(xué)過(guò)程[17]，來(lái)源于小膠質(zhì)細(xì)胞的外泌體中的Tau參與大腦中Tau的病理學(xué)傳播，使用GW4869清除小膠質(zhì)細(xì)胞和抑制外泌體的合成能夠限制Tau在病人大腦中的傳播[18]。該研究認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞能夠吞噬含有Tau蛋白病變的神經(jīng)元，隨后將Tau釋放到外泌體中來(lái)傳遞病變神經(jīng)元，小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以將Tau從嗅皮層(Tau病理學(xué)的最早位點(diǎn)之一)傳播到齒狀回區(qū)域(Tau晚期影響的區(qū)域，但是也在早期受到影響)，封閉nSMase2 抑制外泌體生物合成后可顯著減少Tau的傳播[18]。研究還發(fā)現(xiàn)外泌體中含有AD的典型生物標(biāo)記Tau和Aβ[19]。本研究也發(fā)現(xiàn)外泌體中確實(shí)存在Tau蛋白，說(shuō)明了外泌體在Tau蛋白的傳播中可能發(fā)揮作用，在后期胞內(nèi)體內(nèi)陷形成多泡體的時(shí)候，在細(xì)胞中表達(dá)的Tau蛋白會(huì)隨之被分選到多泡體的腔內(nèi)體中，當(dāng)多泡體與細(xì)胞膜融合后釋放外泌體，此時(shí)tau蛋白會(huì)隨之被釋放到胞外空間。釋放的外泌體可以與相鄰以及不相鄰的細(xì)胞膜融合，并將其包含的外泌體再釋放到受體細(xì)胞中，從而造成Tau蛋白在不同細(xì)胞之間的傳播。

此外，外泌體中的蛋白質(zhì)的分選機(jī)制仍不清楚，但是似乎是被特異性分選的，因?yàn)樗鼈兣c其親本細(xì)胞的組成不同[20]，并且外泌體中裝載的分子還會(huì)根據(jù)親本細(xì)胞的狀態(tài)而改變[21]。關(guān)于外泌體中的蛋白分子分選機(jī)制有3種途徑被提出。第1種是利用胞漿體系，比如ALIX和ESCRT蛋白以及LBPA[22-23]，ESCRT途徑可以募集ILV中單泛素化的蛋白進(jìn)行胞內(nèi)溶酶體降解；第2種途徑是以富含鞘磷脂的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，將細(xì)胞膜鑲嵌蛋白進(jìn)行分離以及將脂閥上的flotilins和Tetraspanins蛋白及其結(jié)合蛋白共同分離到ILV中[24-25]；第3種途徑是由凝集素等因子在胞內(nèi)體腔內(nèi)發(fā)起的裝載，這一途徑主要是招募糖基化蛋白到外泌體中。但是Tau蛋白具體是通過(guò)什么方式被分選到外泌體中去的，其機(jī)制仍然不清楚，這也是下一步外泌體在Tau蛋白傳播中需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。

綜上，神經(jīng)元可能在外泌體中分泌Tau的病原性形式，這種裝載有病原性蛋白的外泌體可以被神經(jīng)元攝取。這些證據(jù)表明包含Tau的外泌體在神經(jīng)元之間相互傳遞Tau，可能是大腦中Tau傳播的一個(gè)重要組成途徑。本研究通過(guò)經(jīng)典的超速離心結(jié)合超濾法成功分離獲得外泌體，并驗(yàn)證了HEK293-Tau細(xì)胞的外泌體中存在Tau蛋白，但Tau蛋白是否能夠在細(xì)胞間通過(guò)外泌體傳播，有待進(jìn)一步研究。