甲基結(jié)合蛋白1對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞增殖及克隆形態(tài)的影響*

張鵬， 楊紅蘭， 劉含， 周艷華， 楊燕， 范安然， 何志旭， 舒莉萍**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室, 組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心， 貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 兒科學(xué)教研室， 貴州 遵義 563000)

全能性干細(xì)胞是一類處于未分化狀態(tài)、可以長(zhǎng)期自我更新和自我分化、具有在一定條件下分化形成各種組織細(xì)胞潛能的細(xì)胞[1]，在體外獲得足夠數(shù)量的全能干細(xì)胞對(duì)于再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要。隨著體外誘導(dǎo)多能干細(xì)胞以及體外多能干細(xì)胞分化技術(shù)的發(fā)展，體外獲得組織特異性及疾病特異性的細(xì)胞已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)，但是其過(guò)程還需要進(jìn)一步的優(yōu)化，其分化的相關(guān)機(jī)制還需進(jìn)一步的闡明。干細(xì)胞分化及誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞獲得過(guò)程中伴隨著全基因組轉(zhuǎn)錄水平及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，而這些變化會(huì)受細(xì)胞內(nèi)的表觀修飾及其識(shí)別蛋白的影響[1-6]。因此，研究DNA表觀修飾及其與甲基結(jié)合蛋白(methyl-CpG binding domain，Mbd)的相互關(guān)系對(duì)闡明干細(xì)胞分化以及重編程的機(jī)制至關(guān)重要。Mbd2和Mbd3在胚胎干細(xì)胞分化以及重編程過(guò)程中具有非常重要的作用[7-10]，提示同家族蛋白Mbd1可能在多能性獲得和喪失過(guò)程中也具有非常重要的作用。神經(jīng)退行性疾病危害人類的健康，如何修復(fù)損傷的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于治療神行退行性疾病至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，多能性胚胎干細(xì)胞在體外可以分化為神經(jīng)干細(xì)胞，這為神經(jīng)退行性疾病的治療提供了新的思路[2-3]。有研究發(fā)現(xiàn)Mbd1在神經(jīng)干細(xì)胞多能性的維持過(guò)程中具有非常重要的作用[11]。Mbd1敲除的神經(jīng)干細(xì)胞分化潛力下降，其分化為β-tubulin陽(yáng)性的神經(jīng)細(xì)胞能力下降[12]。這一結(jié)果暗示在神經(jīng)前體細(xì)胞獲得多能性的過(guò)程中Mbd1可能起到非常重要的作用。本研究通過(guò)研究Mbd1在胚胎干細(xì)胞多能性維持過(guò)程中的功能，為神經(jīng)退行性疾病的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)中所用的化學(xué)試劑除非特殊指明，都來(lái)源于Sigma公司；小鼠胚胎干細(xì)胞(J1)制備參考文獻(xiàn)[13]，用于gRNA和Cas9表達(dá)的質(zhì)粒px459來(lái)源于Addgene，寡聚核苷酸合成于ITD公司，Mbd1抗體購(gòu)買于Abcam公司，HRP標(biāo)記二抗和ECL液體購(gòu)買于Thermo Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1gRNA設(shè)計(jì)及克隆 根據(jù)Crispr/Cas9的工作原理，使用gRNA在線設(shè)計(jì)軟件(https://benchling.com/enterprise/crispr)針對(duì)Mbd1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)設(shè)計(jì)gRNA，然后在正義鏈5′端添加CACC，反義鏈5′端添加AAAC。序列分別為gRNA oligo 上游引物為5′-CACCGTTCTGTCCCTGAAGCATCTA，gRNA oligo 下游引物為5′-AAACTAGATGCTTCAGGGACAGAAC。合成的正義鏈和反義鏈DNA在1× NEBuffer2.0中退火后與BbsI限制性內(nèi)切酶酶切后的骨架載體使用T4-DNA連接酶連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到JM109感受態(tài)細(xì)胞中，并在含有氨芐抗性的平板過(guò)夜生長(zhǎng)。挑取單個(gè)克隆在含有氨芐抗性的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，收集細(xì)胞提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證gRNA序列是否克隆成功。

1.2.2小鼠胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 小鼠胚胎干細(xì)胞J1培養(yǎng)在明膠(0.1%明膠溶解于水中)處理過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)液為高糖DMEM含有16% FBS，2 mmol/L L-谷氨酰胺，0.1 mmol/L的β巰基乙醇，1×雙抗(青霉素，鏈霉素)，1×非必需氨基酸，1 000 000 U/L LIF(Leukemia inhibitory factor),1 μmol/L PD0325901和3 μmol/L CHIR99021(2i，2 inhibitors)。將構(gòu)建好的質(zhì)粒使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后48 h消化細(xì)胞，然后重懸細(xì)胞，在含有終濃度為1 mg/L的嘌呤霉素培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h，最后細(xì)胞在不含抗性的培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.2.3基因敲除細(xì)胞的鑒定 使用10 μL槍頭在體視顯微鏡下挑取胚胎干細(xì)胞單克隆，并將其轉(zhuǎn)入含有0.05%的胰酶中消化為單細(xì)胞，然后將2/3(板1)和1/3(板2)的細(xì)胞分別培養(yǎng)在兩個(gè)不同的96孔板中。72 h后，去除板2中的培養(yǎng)液，然后加入50 μL細(xì)胞裂解液，在55 ℃處理3 h，90 ℃處理20 min。最終取2 μL細(xì)胞裂解液進(jìn)行PCR鑒定。Mbd1 PCR鑒定的上游引物序列為5′CGGGAGACGTTGGAAACTCA，下游引物為5′GAGCACACCCGTTACCTCTG。PCR條件為95 ℃ 3 min， 95 ℃ 10 s、63.5 ℃ 20 s、72 ℃ 40 s重復(fù)40次。最后瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，并將獲得的PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序鑒定，最終根據(jù)測(cè)序結(jié)果選擇板1中保留的基因敲除細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)的觀察 Mbd1敲除和野生型胚胎干細(xì)胞在添加或者不添加抑制劑(2i)的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3代，然后使用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的克隆形態(tài)并拍照。

1.2.5Mbd1蛋白檢測(cè) 取1.5×106個(gè)細(xì)胞在細(xì)胞裂解液中裂解后離心，取上清進(jìn)行Western blot分析。蛋白在PAGE膠中分離后，使用半干轉(zhuǎn)膜的方法將蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，并進(jìn)行立春紅染色。然后使用3% 牛奶進(jìn)行非特異性結(jié)合位點(diǎn)的封閉。之后使用Mbd1抗體和辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidas，HRP)標(biāo)記的二抗孵育，最后使用成像系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)光信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 通過(guò)Crispr/Cas9技術(shù)獲得敲除Mbd1的小鼠胚胎干細(xì)胞

根據(jù)gRNA在線設(shè)計(jì)軟件(https://benchling.com/enterprise/crispr)在Mbd1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)gRNA，然后選擇敲除效率較高，但脫靶效率較低的gRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)體外合成的方式獲得gRNA序列后，將其連接于px459載體中，然后通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式將構(gòu)建成功的px459轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞中，最后通過(guò)PCR方法鑒定獲得敲除Mbd1的純合子細(xì)胞(圖1A)?；蚪M序列和測(cè)序結(jié)果相比對(duì)序列完全一致，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)并未發(fā)生Mbd1的敲除(圖1B上半部分)，如果在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近發(fā)生缺失，說(shuō)明Mbd1基因序列發(fā)生了變化(圖1B下半部分)。另外，通過(guò)Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)是否還存在完整的Mbd1蛋白，如圖1C所示，敲除Mbd1的細(xì)胞總蛋白和野生型細(xì)胞中總蛋白相似的情況下(Ponceau S染色)，野生型胚胎干細(xì)胞在70 KDa附近能夠檢測(cè)到兩個(gè)條帶，分別為完整的Mbd1(Mbd1a)和缺失CXXC3的Mbd1(Mbd1b)，但是Mbd1敲除細(xì)胞在70 KDa附近并不能檢測(cè)到任何Mbd1的特異性條帶。

圖1 小鼠胚胎干細(xì)胞中Mbd1敲除的驗(yàn)證Fig.1 The design of gRNA against Mbd1 and the efficiency of Mbd1 deletion in mESCs

2.2 敲除Mbd1的胚胎干細(xì)胞喪失了小鼠胚胎干細(xì)胞經(jīng)典的3D克隆形態(tài)

為了驗(yàn)證Mbd1對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞多能性維持的作用，Mbd1敲除和野生型小鼠胚胎干細(xì)胞分別在抑制劑(2i)存在(2iLIF)和缺少(-2i)情況下培養(yǎng)，培養(yǎng)3代后使用倒置相差顯微鏡觀察Mbd1對(duì)胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)的影響，結(jié)果顯示，在抑制劑存在的情況下，野生型小鼠胚胎干細(xì)胞呈現(xiàn)3D克隆形態(tài)(圖2左上)，當(dāng)抑制劑去除的情況下，多數(shù)克隆呈現(xiàn)單層扁平形態(tài)，但是部分克隆仍然保持3D克隆形態(tài)(圖2左下)。和野生型胚胎干細(xì)胞相比較，敲除Mbd1的胚胎干細(xì)胞在抑制劑存在的情況下已經(jīng)有部分克隆喪失了3D克隆形態(tài)(圖2右上)。當(dāng)抑制劑去除后，幾乎所有的克隆喪失3D克隆形態(tài)，并且細(xì)胞表現(xiàn)出分化的狀態(tài)(圖2右下)。

注：標(biāo)尺大小為1 000 μm圖2 敲除Mbd1小鼠胚胎干細(xì)胞及野生型小鼠胚胎干細(xì)胞的形態(tài)Fig.2 The effect of Mbd1 deletion on colony morphology of mESCs

2.3 敲除Mbd1對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞增殖的影響

為了驗(yàn)證Mbd1是否能夠影響胚胎干細(xì)胞的增殖速度，實(shí)驗(yàn)使用敲除Mbd1和野生型胚胎干細(xì)胞，在無(wú)抑制劑的情況下培養(yǎng)，并且每隔24 h左右收集細(xì)胞使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞數(shù)量。如圖3所示，與野生型胚胎干細(xì)胞比較，敲除Mbd1的胚胎干細(xì)胞增殖速率明顯下降。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，圖中顯示結(jié)果為3次的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

圖3 Mbd1敲除和野生型胚胎干細(xì)胞增殖速率Fig.3 The effect of Mbd1 deletion on cell proliferation rate of mESCs

3 討論

為了驗(yàn)證基因的功能，基因敲除的方法已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[14]。在眾多的基因敲除方法中，Crispr/Cas9技術(shù)是比較常用的方法[15-16]。細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)gRNA和Cas9蛋白后，Cas9蛋白被gRNA特異性的定位于Mbd1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近，然后Cas9蛋白利用其核酸內(nèi)切酶的活性將雙鏈DNA切開(kāi)[17]。斷裂的DNA會(huì)依賴于細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)機(jī)制使得重新恢復(fù)到雙鏈DNA，但恢復(fù)過(guò)程中有可能會(huì)有新的堿基摻入和缺失(隨機(jī)修復(fù))，因此會(huì)出現(xiàn)一些和原基因組無(wú)法匹配的堿基，最終造成Mbd1基因的編碼序列發(fā)生變化?；蜣D(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)被破壞后，合成的mRNA會(huì)尋找新的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，因此，細(xì)胞內(nèi)并不能表達(dá)完整的蛋白[19]。Mbd1在小鼠細(xì)胞中有不同的亞型，其分布和功能也不同[13,18-19]。在小鼠細(xì)胞中Mbd1主要有4種亞型，分別為Mbd1a、Mbd1b、Mbd1c及Mbd1d，不同亞型之間的功能區(qū)別主要取決于是否包含CXXC3結(jié)構(gòu)域，完整的Mbd1蛋白預(yù)期大小為69.62 kDa，缺失CXXC3的蛋白大小為63.23 kDa[18-20]。由于本研究中敲除的位點(diǎn)位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的改變會(huì)影響到所有Mbd1亞型的表達(dá)，因此，所有Mbd1亞型不存在于本研究獲得的Mbd1敲除細(xì)胞中。

胚胎干細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中為了保持多能性，細(xì)胞內(nèi)的通路蛋白起到了非常重要的作用。在眾多的通路中，PD0325901和CHIR99021抑制劑在胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)中應(yīng)用比較廣泛，并且效果較好。這2個(gè)抑制劑分別作用于FGF/MEK/ERK及Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從而保證了多能性基因的正常表達(dá)，維持了胚胎干細(xì)胞的多能性[21]。在2i+LIF培養(yǎng)液中，Mbd1的敲除輕微的影響到小鼠胚胎干細(xì)胞的克隆形態(tài)。但當(dāng)細(xì)胞在LIF培養(yǎng)液中培養(yǎng)3代后，敲除Mbd1的小鼠胚胎干細(xì)胞多數(shù)為單層細(xì)胞，失去了小鼠胚胎干細(xì)胞經(jīng)典的3D克隆形態(tài)[22]。小鼠胚胎干細(xì)胞克隆形態(tài)的變化最終會(huì)影響到其多能性，因此推斷Mbd1對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞多能性維持具有重要作用。

多能性胚胎干細(xì)胞具有非常短的細(xì)胞周期[23]，因此其在體外擴(kuò)增過(guò)程中具有非常高的增殖速率。本研究結(jié)果表明，敲除Mbd1的胚胎干細(xì)胞其增殖速率較野生胚胎干細(xì)胞明顯下降，說(shuō)明Mbd1對(duì)于胚胎干細(xì)胞的增殖具有非常重要的作用。Mbd1敲除后小鼠胚胎干細(xì)胞增殖速率變慢，從而不能快速的在體外增殖，可能最終喪失了多能性。

綜上所述，本研究成功獲得了敲除Mbd1的胚胎干細(xì)胞系，并且發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞中Mbd1缺失后，細(xì)胞的增殖速率較野生型胚胎干細(xì)胞慢，Mbd1缺失后小鼠胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)中經(jīng)典的3D克隆形態(tài)消失，提示Mbd1對(duì)于胚胎干細(xì)胞多能性維持具有一定的作用。本研究結(jié)果也為胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞提供理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。