袁桃花, 李欣芯, 陳麗亞, 曹勝宇, 孫見飛, 劉華, 吳昌學(xué), 吳寧*
(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550004)
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種侵犯滑膜關(guān)節(jié)的慢性、炎癥性自身免疫系統(tǒng)疾病[1],主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫、畸形等,致殘率在所有關(guān)節(jié)病中高居首位[2-3]。目前,臨床上沒有特異且有效的治療RA藥物[4-5]。苗藥驗(yàn)方“四大血”(sidaxue,SX)由苗藥黑骨藤、見血飛、五花血藤、雞血藤4味藤本藥材組成,是苗族地區(qū)治療氣血瘀阻等疾病的天然藥方,也是其作為治療RA的特有藥方,但至今僅為經(jīng)驗(yàn)用藥階段,關(guān)于其治療RA的作用機(jī)制研究較少[6]。本課題組前期研究結(jié)果顯示,SX對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠有良好的療效,能緩解關(guān)節(jié)腫脹程度、抑制關(guān)節(jié)滑膜組織增生等病理表現(xiàn)[7-8]。膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎大鼠(collagen induced arthritis in rats,CIA)關(guān)節(jié)局部的炎癥等病理表現(xiàn)與RA相似,是研究RA的常用模型[9-10],本研究通過復(fù)制CIA大鼠動(dòng)物模型,采用不同劑量的SX對(duì)其治療,觀察SX治療前后CIA大鼠關(guān)節(jié)足腫脹度(ER)、病理組織變化, 分析SX對(duì)CIA大鼠白細(xì)胞介素17(interleukin-17,IL-17)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量的影響,評(píng)估SX對(duì)RA的治療效果、探討其作用機(jī)制,為臨床開發(fā)SX提供理論基礎(chǔ)。
1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及藥物 42只SD(Sprague Dawley)大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量180~220 g,由Chongqing Tengxin Biological Technology Co. Ltd提供,合格證號(hào)[SCXK(渝)2007.005];苗藥SX由貴州中醫(yī)藥大學(xué)苗醫(yī)藥教研室提供并經(jīng)田振華副教授鑒定,雷公藤多苷片購自HUANGSHI FEIYUN CO.LTD,20080301;Freund’S Complete Adjuvent(IFA)購自美國Sigma公司,批號(hào)033K8933。
1.1.2主要試劑 大鼠IL-17 ELISA試劑盒購于Shenzhen zike Biological Technology,大鼠VEGF試劑盒購于安徽巧伊生物技術(shù)有限公司,Prime ScriptRT Reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自TaKaRa Biomedical Technology (Beijing),AceQ qpCR SYBR Green Master Mix購自Vazyme Biotech Co,Ltd,多功能酶標(biāo)儀為美國,熒光定量pCR儀為Applied Biosystems公司。
1.2.1分組 42只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(NG組,n=7)和造模組(n=35),造模組大鼠用牛Ⅱ型膠原適量與等量不完全弗氏佐劑混合乳化劑于尾根部皮下注射復(fù)制CIA動(dòng)物模型,造模第14天時(shí)將造模組大鼠分為5組,即模型對(duì)照組(Mod組,n=7),SX 高、中、低藥物治療組( 40、20、10 g/kg組,n=7)以及陽性藥物對(duì)照組(雷公藤多甙片,GTW組,n=7)。
1.2.2構(gòu)建CIA動(dòng)物模型 將4 g/L牛Ⅱ型膠原與等量不完全弗氏佐劑在冰上充分混勻乳化后,滴一滴于水中不擴(kuò)散,取乳劑200 μL于大鼠尾根及左足墊部皮下注射,NG組用等量生理鹽水(physiological saline,NS)注射,一周后加強(qiáng)免疫,總計(jì)300 μL;造模第14天時(shí),通過關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)評(píng)分判定造模情況[11]。AI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):關(guān)節(jié)無紅腫為0分,關(guān)節(jié)有紅色斑點(diǎn)或輕度腫脹為1分,關(guān)節(jié)病變并有中度紅腫為2分,關(guān)節(jié)除中度紅腫外并伴有輕度功能障礙為3分,關(guān)節(jié)重度紅腫、僵直甚至畸形并伴嚴(yán)重功能障礙為4分;AI評(píng)分≥2分為造模成功。
1.2.3SX制備 給藥單味苗藥五花血藤、雞血藤、見血飛、黑骨藤按照15∶22∶15∶8的比例配制,共取2 000 g,參考文獻(xiàn)[6-8]煎制成濃度為4 kg/L的試藥(按生藥量計(jì)),置于4 ℃冰箱備用。給藥方案:造模成功后,藥物治療組大鼠按0.1 L/kg劑量給予SX進(jìn)行灌胃治療,SX 40 g/kg、20 g/kg、10 g/kg組濃度依次為4 g/mL、2 g/mL及1 g/mL,GTW組按4 g/mL進(jìn)行灌胃,NG組和Mod組用等量NS灌胃,灌胃給藥21 d。
1.3.1足趾ER測(cè)量 造模前及造模第7、14天,給藥第7、14及21天時(shí),采用自制足腫儀測(cè)量大鼠左右后足跖容積,反復(fù)3次取均值,計(jì)算足趾ER,公式為ER(%)=(V1-V2)/V2×100%(其中V2為造模前的容積,V1造模后的容積)。
1.3.2標(biāo)本采集及大鼠血清IL-17、VEGF的含量 給藥第21天,最后一次SX灌胃結(jié)束時(shí),用10%水合氯醛麻醉大鼠,心臟取血,常溫下垂直靜置2 h,見淡黃色血清析出后,3 000 r /min離心10 min,分離血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法測(cè)定大鼠血清IL-17、VEGF含量,操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行;同時(shí)取出大鼠滑膜組織,部分制作病理組織切片,觀察其炎癥反應(yīng),部分用于檢測(cè)VEGFmRNA表達(dá)。
1.3.3大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織的炎癥反應(yīng)及VEGFmRNA表達(dá) 取大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織制作的病理組織切片,4%中性甲醛固定液中進(jìn)行固定,觀察其炎癥反應(yīng);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織VEGFmRNA表達(dá)水平,根據(jù)GenBank提供的大鼠VEGFmRNA序列(AY702972)、GApDHmRNA序列(內(nèi)對(duì)照,NM_017008);進(jìn)行引物設(shè)計(jì)并合成,VEGF上游引物為5′ CCTGGCTTTACTGCTGTACCT 3′,下游引物為5′ GCTGGTAGACGTCCATGAACT 3′;GApDH上游引物為5′ GTGCCAAAAGGGTCATCATCTC 3′,下游引物為5′ GGTTCACACCCATCACAAACATG 3′;提取樣本總RNA,溶于DEPC水中(-80 ℃保存?zhèn)溆?,用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)RNA樣品A260/280值及濃度,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA樣本,采用pCR操作擴(kuò)增目的基因,條件為95 ℃預(yù)變性 5 min, 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s循環(huán)40次,溶解曲線擴(kuò)增條件為95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,95 ℃ 15 s,用2^-△△CT法處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
在造模第7天時(shí),NG組大鼠生理狀態(tài)正常、毛色光滑,體重增加。而Mod組部分大鼠注射乳化劑的關(guān)節(jié)出現(xiàn)輕微紅腫,活躍程度降低,毛色光澤下降;造模第14天時(shí),Mod組大鼠致炎關(guān)節(jié)基本都出現(xiàn)不同程度的紅腫,甚至無法直立行走,活動(dòng)程度整體降低,毛色缺乏光澤。藥物治療第7天時(shí),與NG組比較,SX 40 g/kg、20 g/kg組、GTW組大鼠活動(dòng)程度稍微變大,部分大鼠關(guān)節(jié)紅腫開始減退;治療第14天時(shí),除SX 10 g/kg組外,各治療組大鼠關(guān)節(jié)紅腫情況都開始得到緩解;治療第21天時(shí),SX 10 g/kg組小部分大鼠關(guān)節(jié)有輕度紅腫,但均能正常行走,其余各治療組大鼠關(guān)節(jié)紅腫消退,大鼠狀態(tài)良好。見圖1。
注:A、B、C、D、E及F依次為NG、Mod、GTW、SX 40 g/kg、SX 20 g/kg及SX 10 g/kg組圖1 各組大鼠藥物治療第21天時(shí)足趾外觀Fig.1 Joint swelling degree of rats in each group after 21th day of drug treatment
造模第14天時(shí),除NG組外,其余各組大鼠左右后足趾均表現(xiàn)紅腫,經(jīng)過SX及GTW治療后,灌胃給藥第7天時(shí),與Mod組比較,各組大鼠后足趾ER均不同程度下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),藥物治療第14、21天時(shí),SX和GTW治療組與Mod組比較,后足趾ER均下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。
分組造模第14天給藥第7天第14天第21天NG組0.14±0.030.12±0.050.11±0.010.15±0.04Mod組0.57±0.07(1)0.85±0.22(1)0.82±0.24(1)0.88±0.23(1)GTW組0.43±0.08(1)0.37±0.16(1)(3)0.29±0.04(1)(3)0.20±0.06(1)(3)40 g/kg組0.42±0.09(1)0.35±0.16(1)(2)0.27±0.07(1)(3)0.15±0.01(1)(3)20 g/kg組0.50±0.02(1)0.39±0.20(1)0.30±0.14(1)(3)0.17±0.15(1)(3)10 g/kg組0.54±0.11(1)0.41±0.11(1)0.39±0.12(1)(3)0.19±0.07(1)(3)
(1)與NG組比較,P<0.01;與Mod組比較,(2)P<0.05,(3)P<0.01
給藥第21天時(shí),與NG組比較,Mod組血清IL-17、VEGF含量升高(P<0.05);與Mod組比較,NG、SX 40 g/kg組血清IL-17含量下降(P<0.05),SX 20 g/kg、GTW組血清IL-17含量下降更明顯(P<0.01);與Mod組比較,SX 40、20、10 g/kg組及GTW組血清中VEGF含量顯著降低(P<0.01)。見表2。
表2 各組大鼠血清IL-17及VEGF含量Tab.2 Serum IL-17, VEGF content in each group of CIA rats
與NG組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01;與Mod組比較,(3)P<0.05,(4)P<0.01
從圖2中可以看出,NG組大鼠滑膜組織由1~2層滑膜細(xì)胞構(gòu)成,分布緊密、整齊,無炎癥細(xì)胞的浸潤及血管增生;Mod組大鼠滑膜組織排列紊亂、增生明顯,多達(dá)5~6層排列,且組織水腫嚴(yán)重,周圍可見大量炎性細(xì)胞浸潤、血管增生現(xiàn)象,在軟骨面,還可見部分軟骨細(xì)胞增生。SX 10 g/kg組較Mod組的滑膜組織水腫程度較Mod組有所改善,增生及炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象均減少;而SX 40 、20 g/kg組及GTW組僅可見少量的炎性細(xì)胞浸潤及新生組織血管,增生較少,沒有明顯的軟骨及骨組織的破壞,提示滑膜組織病理狀況明顯改善。
給藥第21天時(shí),與NG組相比,Mod組VEGFmRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.05);與Mod組比較,SX 40 g/kg、10 g/kg組VEGFmRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05);SX各組與GTW組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。
表3 VEGF mRNA在大鼠滑膜組織中的表達(dá)Tab.3 Expression of VEGF mRNA in synovial tissue of CIA rats
(1)與NG組比較,P<0.05,(2)與Mod組比較,P<0.05
RA作為一種系統(tǒng)性的慢性自身免疫疾病,在全球均有發(fā)病,在我國,其患病率為0.32%~0.36%,是造成人類喪失勞動(dòng)力和致殘的主要原因之一[1-3],其病變可以累及全身不同臟器(如肺、心、腎、神經(jīng)及消化系統(tǒng)等)[12],但尤以關(guān)節(jié)受累最為突出,其病理表現(xiàn)為多發(fā)性外周關(guān)節(jié)炎,關(guān)節(jié)局部紅腫,嚴(yán)重致關(guān)節(jié)畸形,病理變化為增生性滑膜炎,關(guān)節(jié)軟骨破壞、骨侵蝕,關(guān)節(jié)腔內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤[13]。目前,臨床上沒有治療RA的特效藥物,且常用的藥物如改善關(guān)節(jié)炎癥狀的非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs,NSAIDs)、改變病情抗風(fēng)濕藥(disease modifying anti-rheumatic drug,DMARDs)等均具有一定的毒副作用[14]。RA作為難治性疾病之一,目前無法根治,國內(nèi)外學(xué)者為了更好地對(duì)RA開展研究,根據(jù)RA的病因病機(jī)、病理學(xué)、免疫學(xué)特點(diǎn)等進(jìn)行了大量的動(dòng)物試驗(yàn),形成了一些較為成熟的AA、CIA模型動(dòng)物模型,二者在臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)和病理機(jī)制上與人RA有著相似的特點(diǎn),是常用的兩種RA模型,其中CIA模型較為穩(wěn)定,是研究RA發(fā)病機(jī)制和篩選治療RA藥物的理想模型,也是目前國際上公認(rèn)的關(guān)節(jié)炎模型[9-10]。而RA作為一種慢性免疫性炎癥疾病,目前發(fā)病機(jī)理尚不清楚,而機(jī)體炎癥反應(yīng)與多種促炎細(xì)胞因子密切相關(guān),在RA中白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、IL-17、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)等炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在RA滑膜的病變過程中起重要作用,其中IL-17 已被證實(shí)在組織炎癥、自身免疫和宿主防御機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,是一種較強(qiáng)的炎性細(xì)胞因子,RA患者關(guān)節(jié)滑液中出現(xiàn)高水平IL-17[15-17]。目前許多研究證實(shí)炎癥因子(如TNF-α、IL-1β)的異常表達(dá)是RA發(fā)病及血管形成的重要原因,近年來,人們發(fā)現(xiàn)在RA的滑膜病變過程中有豐富的血管形成因子的表達(dá),其中VEGF是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子,是促血管生成的主要因素之一,是目前已知的作用最強(qiáng)的促血管生成因子,其能增加 RA微血管通透性,促使RA血管新生,加重血管翳癥狀[18-20]。實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),SX能減輕CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度,較好的改善CIA模型大鼠關(guān)節(jié)組織病理狀況,且SX 40 g/kg改善明顯,SX能下調(diào)血清中IL-17及VEGF的表達(dá),且下調(diào)VEGF的水平比IL-17的稍高,初步說明在CIA大鼠的病理表現(xiàn)中,SX下調(diào)血管因子VEGF的作用比炎癥因子IL-17的作用稍強(qiáng)。同時(shí),本研究還檢測(cè)出SX 10 g/kg對(duì)CIA大鼠血清IL-17的影響較小,而對(duì)于VEGF則是SX 40 g/kg影響相對(duì)較小,說明RA血管翳程度與炎癥反應(yīng)在一定程度上不呈正向發(fā)展關(guān)系。
注:A、B、C、D、E及F依次為NG、Mod、GTW、SX 40 g/kg、SX 20 g/kg及SX 10 g/kg組圖2 各組大鼠滑膜組織HE染色結(jié)果(400×) Fig.2 Pathological tissue section of each group
綜上所述,SX能通過調(diào)節(jié)IL-17、VEGF含量的變化對(duì)CIA大鼠病情的改善起到積極的作用,這為下一步深入研究SX通過調(diào)控VEGF及IL-17發(fā)揮對(duì)RA治療的具體作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。