南五味子根黃酮提取物的抗菌抗氧化活性

林雄平 曾思 穎彭彪等

摘要 [目的]研究南五味子根黃酮提取物的抗菌抗氧化活性。[方法]采用乙醇和水為溶劑提取南五味子根的黃酮類(lèi)物質(zhì)，并對(duì)其黃酮提取物進(jìn)行抗菌及抗氧化試驗(yàn)。[結(jié)果]南五味子

根醇提黃酮粗提物提取率大于水提，其中醇提法提取率為13.67%，水提法提取率為7.80%。醇提黃酮提取物對(duì)黑曲霉的抑菌效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到12.94 mm。南五味子根的黃酮提取物具有抑制羥自由基的能力。醇提黃酮提取物的抑制羥自由基能力高于水提，抑制羥自由基能力隨著稀釋倍數(shù)的增加呈遞減趨勢(shì)。其中稀釋100倍醇提時(shí)所提取的黃酮類(lèi)物質(zhì)抑制能力最強(qiáng)，達(dá)13 560.78 U/mL。 [結(jié)論]根部是貯存抗菌抗氧化活性物質(zhì)的主要器官，南五味子根具有較強(qiáng)的抗菌抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 南五味子;黃酮提取物;抗菌效果;抗氧化活性

中圖分類(lèi)號(hào) S789.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2019）04-0173-03

Abstract [Objective]The research aimed to study the antibacterial and antioxidation activities of flavonoids extract from the roots of Kadsura longipedunculata.[Method]Ethanol and water were used as solvents to extract flavonoids from the roots of Kadsura longipedunculata， and antibacterial and antioxidant tests was made on flavonoids extracts.[Result]The extraction rate of crude flavonoids extract by alcohol extraction from the roots of K. longipedunculata was greater than that by water extraction. The extraction rate of crude flavonoids extract by alcohol extraction rate was 13.67% and that by water extraction rate was 7.80%.The flavonoids extract by alcohol extraction from the roots of K. longipedunculata had the best inhibitory effect on Aspergillus niger，and the diameter of inhibition zone reached 12.94 mm. The flavonoids extract from the roots of K. longipedunculata had the inhibitory effect on hydroxyl radicals. The inhibitory activity of flavonoids extract by alcohol extraction from the roots of K. longipedunculata on hydroxyl radicals was greater than that by water extraction， and the inhibitory activity on hydroxyl radicals showed the decreased trend with the dilution times. The inhibitory activity inhibitory activity of flavonoids extract by diluting 100 times of alcohol with from the roots of K. longipedunculata on hydroxyl radicals was the strongest， reaching 13 560.78 U/mL. [Conclusion]The root is the main organ for the storage of antibacterial and antioxidative active substances. The root of K. longipedunculata had stronger antibacterial and antioxidant activities.

Key words Kadsura longipedunculata;Flavonoid extract;Antibacterial effect;Antioxidant activity

南五味子（Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.）為五味子科（Schisandraceae）南五味子屬（Kadsura Kaempf.ex Juss.）植物，主要分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以南，是一種地道的中藥材。南五味子全草具有理氣活血、活絡(luò)祛風(fēng)、止痛消腫的作用。藥用部位為根部，味澀，性溫，具有消腫活血、通絡(luò)祛風(fēng)、止痛理氣的功效[1]。

張明華等[2]研究發(fā)現(xiàn)五味子對(duì)肝臟有保護(hù)作用;Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)異型南五味子具有抗氧化作用;Xiao等[4]研究表明南五味子中含有許多種抗菌抗氧化的活性物質(zhì)，這些物質(zhì)的極性較強(qiáng)，可能是黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)、多糖類(lèi)等化合物。根據(jù)相似相溶的原理，可以用乙醇將這些物質(zhì)提取出來(lái)。南五味子藥材資源豐富，用藥方便，患者口服就能達(dá)到藥效，毒性小，療程短，制成一定藥劑用于臨床，對(duì)潰瘍病、胃腸炎、中暑、腹痛和關(guān)節(jié)炎等疾病有較好的療效?，F(xiàn)代研究表明，南五味子具有抗氧化、血小板活化因子拮抗活性[5]。南五味子是我國(guó)重要的藥用植物資源之一，被衛(wèi)生部列為可用于保健食品的物質(zhì)[6]。

近年來(lái)，人工合成的具有毒性、天然可食用、低成本、高效率的抗菌抗氧化物質(zhì)研究越來(lái)越受到人們的重視。南五味子的研究與利用主要集中在藥理作用、藥用成分及栽培技術(shù)方面[7]。有關(guān)南五味子提取物的抗氧化和抑菌作用研究報(bào)道較少。

隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的生活水平也越來(lái)越高，人們開(kāi)始關(guān)注健康。常用的食品防腐劑和抗氧化劑大多數(shù)為化工產(chǎn)品，如苯甲酸、山梨酸、丙酸和對(duì)羥基苯甲酸等及其鹽與酯類(lèi)[8]。由于化學(xué)防腐劑和抗氧化劑可能存在某些安全隱患，所以各國(guó)都十分重視天然食品防腐劑和抗氧化劑的研究與開(kāi)發(fā)，有關(guān)植物提取物的抑菌防腐和抗氧化作用已成為當(dāng)今食品研究的一個(gè)熱點(diǎn)問(wèn)題。

筆者以南五味子根的黃酮提取物為試驗(yàn)材料，以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、啤酒酵母、黑曲霉菌等食品腐敗細(xì)菌為供試菌，研究南五味子根黃酮提取物的體外抑菌活性和抗氧化性，以期為開(kāi)發(fā)新的天然食品防腐劑和抗氧化劑提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。

南五味子的根采自福建省寧德市屏南縣安溪村。

1.1.2 受試菌種。

真菌菌種包括黑曲霉[Aspergillus nigev.Tiegh]、啤酒酵母（Saccharomyces carlsbergensis Han-sen）;細(xì)菌菌種包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus Rosenbach）、大腸桿菌[Escherichia coli （Migula）Casleillni and Chalmers]、枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis（Ehren-berg）Cohn]。

1.2 方法

1.2.1 材料的處理。

將南五味子的根淘洗干凈并晾干，置于恒溫干燥箱45 ℃下烘干，用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目篩，制成南五味子干粉，備用。

1.2.2 南五味子根黃酮活性物質(zhì)的提取。

1.2.2.1 采用水提法提取黃酮類(lèi)物質(zhì)。

稱(chēng)取南五味子根干粉15 g置于蒸餾瓶中，按照料液比1∶10加入蒸餾水浸提，在60 ℃水浴鍋中加熱提取24 h，過(guò)濾，相同方法提取2次，合并提取液，得到的提取液在60 ℃水浴條件下將其蒸干至恒重，得到總黃酮并稱(chēng)重。

1.2.2.2 采用乙醇提取法提取黃酮類(lèi)物質(zhì)。

稱(chēng)取南五味子根干粉15 g置于錐形瓶中，用200 mL石油醚浸提2次，5 h/次，脫脂。將濾渣60 ℃烘干至恒重備用，在料液比1∶20、80 ℃提取溫度的條件下，用70 %乙醇浸提2次，3 h/次，合并濾液。經(jīng)抽濾，得到南五味子根的黃酮粗提液。將粗提液轉(zhuǎn)入大燒杯中，在80 ℃水浴條件下將其蒸干至恒重，得到總黃酮并稱(chēng)重。

1.2.3 南五味子根黃酮提取物的抗菌活性測(cè)定。

1.2.3.1 培養(yǎng)基的配制。

將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和牛肉蛋白胨培養(yǎng)基、無(wú)菌水、盛有水并編號(hào)的10支試管等置于手提式壓力蒸汽滅菌器中121 ℃，分別滅菌20 min，80 ℃恒溫箱中干燥。將接種環(huán)、培養(yǎng)皿、無(wú)菌水等置于無(wú)菌操作臺(tái)上，紫外滅菌30 min以上，打開(kāi)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 min。

1.2.3.2 細(xì)菌懸液的制備。

無(wú)菌操作下，將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿20～25 mL左右，靜置冷卻制成平板置于一旁備用。將濾紙片放入提取液中浸透，用鑷子夾出放在備好的培養(yǎng)皿中晾干備用。用接種環(huán)粘取菌種加入第一支101倍稀釋的10 mL試管中，振蕩并搖勻，使菌液與水充分混勻。從101倍稀釋的試管中吸取1 mL稀釋液，注入102倍稀釋的9 mL試管中，混勻。以此類(lèi)推，直到完成最后一支試管的稀釋。

1.2.3.3 涂布法涂皿并培養(yǎng)。

吸取少量菌液（不超過(guò) 0.1 mL）滴加到培養(yǎng)基表面，將蘸有少量乙醇的涂布器在火焰上引燃，待乙醇燃盡后冷卻8～10 s，用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面，涂布時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液分布均勻，并做好標(biāo)簽。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，在平板表面的4個(gè)位置等距離貼上蘸有樣品（樣品濃度為0.1 g/mL）的濾紙片、陽(yáng)性對(duì)照（山梨酸鉀）和空白對(duì)照的濾紙片，設(shè)3個(gè)重復(fù)組。

在37 ℃培養(yǎng)箱中放置金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)18 h;在28 ℃培養(yǎng)箱中放置啤酒酵母、黑曲霉培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)48 h，此后觀察各分離組分的菌種生長(zhǎng)狀況，測(cè)定抑菌圈直徑，取平均值。

1.2.4 南五味子根黃酮提取物的抗氧化活性測(cè)定。

按照羥自由基測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)，最常見(jiàn)的產(chǎn)生羥自由基的化學(xué)反應(yīng)為Fenton反應(yīng)，H2O2的量與Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的·OH量成正比，當(dāng)給予電子受體后，用Griess試劑顯色，形成紅色物質(zhì)，其呈色與·OH的量成正比。

將不同溶劑提取的南五味子根的黃酮類(lèi)物質(zhì)分別配制成10 mg/mL溶液，分別取0.2 mL進(jìn)行試驗(yàn)，具體操作步驟按照羥自由基測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

先進(jìn)行各種應(yīng)用液的配制，將配制好的應(yīng)用液，先在37 ℃水浴中預(yù)溫3 min，每個(gè)管加液時(shí)都要在37 ℃條件下進(jìn)行。試驗(yàn)設(shè)置空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對(duì)照管及測(cè)定管，空白管加入0.4 mL蒸餾水，標(biāo)準(zhǔn)管加入0.2 mL蒸餾水和0.2 mL 0.03%H2O2標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，對(duì)照管加入0.2 mL蒸餾水和0.2 mL底物應(yīng)用液，測(cè)定管加入0.2 mL底物應(yīng)用液和0.2 mL的待測(cè)樣本，最后各管均加入0.4 mL Fenton 試劑及2 mL顯色劑。

一次只能做一個(gè)管，加完試劑混勻，從加完Fenton試劑開(kāi)始要準(zhǔn)確用秒表計(jì)時(shí)，要在37 ℃下反應(yīng)1 min，結(jié)束后要立即加入顯色劑終止反應(yīng);混勻，室溫放置20 min，波長(zhǎng)550 nm，1 cm 光徑，用蒸餾水調(diào)零，測(cè)定各管的吸光度值。對(duì)提取黃酮的抗氧化活性測(cè)定均重復(fù)3次，并進(jìn)行差異顯著性分析。

按以下公式計(jì)算抑制羥自由基能力：

抑制羥自由基能力（U/mL）=對(duì)照OD值-測(cè)定OD值標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×1 mL取樣量×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

式中，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為8.824 mmol/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 南五味子根黃酮提取物的提取率

試驗(yàn)表明，醇提南五味子根的黃酮粗提物提取率大于水提，其中醇提法提取率為13.67%，水提物提取率為7.80%。由此可見(jiàn)，醇提法提取的黃酮得率較高，可能原因是水和乙醇都屬于極性溶劑，極性物質(zhì)易溶解于極性溶劑，水的極性大于乙醇，相對(duì)于水而言，粗黃酮提取物的活性成分易溶于乙醇，而水提取法由于水的極性較高，只能浸提出溶于水的黃酮類(lèi)物質(zhì)，對(duì)于不溶于水或極性較低的黃酮類(lèi)物質(zhì)則無(wú)法提取出來(lái)。因此，若要采用水提法提取黃酮類(lèi)物質(zhì)，可根據(jù)相似相容原理，采用有效方法增加水提取法中溶于水或極性較高的黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取。

2種溶劑所提取的黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取率普遍不高，可能是由于受溫度、液料比、浸提次數(shù)、浸提時(shí)間等因素的影響所致。

2.2 南五味子根黃酮提取物的抗菌活性

由表1可知，不同溶劑提取的南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)真菌有抑菌效果。試驗(yàn)所用的陽(yáng)性對(duì)照組（山梨酸鉀）除了對(duì)枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑制效果外，對(duì)其他菌種都有抑制效果。水提黃酮提取物的抑菌效果均低于醇提。

比較不同溶劑黃酮提取物對(duì)受試菌種的抗菌活性，發(fā)現(xiàn)醇提南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑菌能力大于水提。水提法對(duì)2種細(xì)菌、2種真菌有抑制效果，且對(duì)黑曲霉的抑制效果最好，抑菌圈直徑為11.30 mm。醇提法提取的南五味子根黃酮提取物對(duì)2種細(xì)菌、2種真菌有抑制效果，與水提法黃酮提取物的抑菌效果一致，同時(shí)其對(duì)黑曲霉的抑制效果最好，抑菌圈直徑達(dá)到12.94 mm。南五味子根的水提和醇提黃酮提取物對(duì)黑曲霉的抑菌效果以及醇提黃酮提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌效果均強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照組為市面上常見(jiàn)的抑菌產(chǎn)品山梨酸鉀，除了對(duì)枯草芽孢桿菌沒(méi)有抑菌效果外，對(duì)其他菌種都有明顯的抑菌效果。

通過(guò)對(duì)5種受試菌的敏感度分析發(fā)現(xiàn)，除枯草芽孢桿菌外，其他4種受試菌對(duì)南五味子根黃酮提取物較為敏感，其中對(duì)黑曲霉最為敏感。

比較真菌與細(xì)菌的抑菌圈直徑大小發(fā)現(xiàn)，不同溶劑提取的南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)真菌和細(xì)菌的抑菌效果強(qiáng)弱不一，不能具體分出。

2.3 南五味子根黃酮提取物的抗氧化活性

設(shè)置2個(gè)重復(fù)組，計(jì)算平均值，南五味子根的黃酮提取物具有抑制羥自由基能力。不同溶劑提取的南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化能力不同，醇提黃酮提取物的抑制羥自由基能力強(qiáng)于水提。稀釋200倍水提黃酮提取物的抗氧化能力為6 505.32 U/mL，醇提黃酮提取物的抗氧化能力為6 585.6U/mL;稀釋150倍水提黃酮提取物的抗氧化能力為9 727.93 U/mL，醇提黃酮提取物的抗氧化能力為10 341.57 U/mL;稀釋100倍的水提黃酮提取物的抗氧化能力為12 860.4 U/mL，醇提黃酮提取物的抗氧化能力為13 560.78 U/mL。由此可見(jiàn)，抑制羥自由基能力隨著稀釋倍數(shù)的增加呈遞減趨勢(shì)，其中稀釋100倍的醇提黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑制羥自由基能力最強(qiáng)，高達(dá)13 560.78 U/mL（圖1）。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，水提和醇提黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑制羥自由基能力相差不大，可見(jiàn)不同溶劑對(duì)南五味子根黃酮提取物的抗氧化能力影響不大，但水提黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑制羥自由基能力略低于醇提法，原因是水提法只能浸提出溶于水的黃酮類(lèi)物質(zhì)，對(duì)于不溶于水或極性較低的黃酮類(lèi)物質(zhì)不能提取出來(lái)，所以其抑制羥自由基能力稍弱。稀釋200倍黃酮提取物的抑制羥自由基能力小于150倍、100倍的黃酮提取物，可見(jiàn)稀釋倍數(shù)越高，南五味子根黃酮提取物的抗氧化能力越弱。這說(shuō)明當(dāng)采用稀釋倍數(shù)低的醇提法時(shí)提取的南五味子根黃酮提取物的抗氧化能力更強(qiáng)。

3 討論

通過(guò)測(cè)定不同溶劑提取南五味子根黃酮提取物的提取率發(fā)現(xiàn)，醇提黃酮提取物的提取率大于水提。據(jù)文獻(xiàn)[9]報(bào)道，南五味子果實(shí)的乙醇提取率大于水提取率。該試驗(yàn)進(jìn)一步研究不同溶劑南五味子根黃酮提取物的提取率，發(fā)現(xiàn)醇提黃酮提取物的提取率大于水提。

抗菌試驗(yàn)結(jié)果表明，不同溶劑提取的南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)真菌有抑菌效果，且醇提黃酮提取物的抑菌能力大于陽(yáng)性對(duì)照及水提黃酮提取物。林雄平等[10]報(bào)道南五味子果實(shí)有抑菌效果，不同溶劑提取的南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)枯草桿菌無(wú)抑菌效果，但對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉和啤酒酵母均有抑菌作用，且不同溶劑提取的五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)真菌的抑制效果強(qiáng)于果實(shí)。劉麗等[9]研究表明，醇提南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑菌效果高于水提，且均有抑菌效果。這說(shuō)明南五味子根的抑菌活性物質(zhì)存在于黃酮類(lèi)物質(zhì)中，因此可有效利用南五味子根的黃酮類(lèi)物質(zhì)作為現(xiàn)代食品行業(yè)的天然防腐劑。

抗氧化試驗(yàn)結(jié)果表明，南五味子根的黃酮提取物具有抑制羥自由基能力。不同溶劑提取的南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化能力不同，水提黃酮類(lèi)物質(zhì)的抑制羥自由基能力低于醇提，稀釋100倍黃酮提取物的抑制羥自由基能力大于稀釋150倍、200倍的黃酮提取物。據(jù)報(bào)道，南五味子果實(shí)中的活性物質(zhì)也具有抑制羥自由基能力，清除羥自由基能力達(dá)4 011.48 U/mL[10]。該試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溶劑提取的南五味子根黃酮類(lèi)物質(zhì)的抗氧化能力強(qiáng)于果實(shí)，說(shuō)明從抗氧化能力的角度來(lái)看，水提、醇提法所提取的南五味子根所含的抗氧化活性物質(zhì)更多，稀釋倍數(shù)越低，抗氧化能力也越強(qiáng)。南五味子既可作為野生水果，也可作為藥材，以莖、根入藥，說(shuō)明南五味子根的藥用價(jià)值很高，其根中所含的黃酮類(lèi)物質(zhì)還可作為天然防腐劑和抗氧化劑，為人類(lèi)的食品安全和抗衰老方面做出貢獻(xiàn)。

目前對(duì)南五味子的抗菌抗氧化研究較多，但深入研究南五味子根的抗菌抗氧化活性較少。筆者研究了不同溶劑對(duì)南五味子根黃酮提取物抗菌抗氧化活性的影響，后續(xù)可進(jìn)一步研究不同因素對(duì)南五味子根抗菌抗氧化活性的影響。南五味子可作為天然抗氧化劑進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)，南五味子根的黃酮提取物可作為天然抗菌和抗氧化的食品添加劑添加到食品中，在安全性、抗氧化性等方面效果好于抗氧化劑。

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