• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    麻黃內(nèi)生真菌的初步研究

    2015-10-13 21:51于淼等
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年18期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)生真菌抗氧化活性麻黃

    于淼等

    摘要:從寧夏回族自治區(qū)賀蘭山高鹽堿地區(qū)采集的麻黃樣本中分離得到7株內(nèi)生真菌,體外抗氧化活性測(cè)定表明,所分離到的內(nèi)生真菌中有5株具有較高的抑制羥基自由基能力;有5株菌的發(fā)酵液具有中等強(qiáng)度的總抗氧化能力。在抗菌活性測(cè)定中,所分離到的7株麻黃內(nèi)生真菌對(duì)細(xì)菌指示菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用,但對(duì)真菌指示菌炭疽桿菌和黑曲霉均未檢測(cè)到抑菌活性。

    關(guān)鍵詞:麻黃(Ephedra sinica);內(nèi)生真菌;抗菌活性;抗氧化活性

    中圖分類(lèi)號(hào):S432 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)18-4482-03

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.023

    自1898年Vogl從黑麥草(Lolium temulentum L.)種子內(nèi)將第一株內(nèi)生真菌分離出來(lái)至今,已有100多年的歷史,但是最近20年才正式開(kāi)展藥用植物內(nèi)生真菌的研究[1]。1993年美國(guó)Montana州大學(xué)植物病理系博士Stierle等分離紅豆杉韌皮部的內(nèi)生真菌,得到產(chǎn)生化合產(chǎn)物紫杉醇的內(nèi)生真菌[2]。該類(lèi)菌株的發(fā)現(xiàn)使得微生物學(xué)者的目光都放在植物,特別是藥用植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物研究上。這類(lèi)研究使得目前致病菌對(duì)抗生素的耐藥性蔓延起到了至關(guān)重要的改善作用。

    在自然界存在很多極端環(huán)境,如高鹽、高堿、高酸、高干旱、高壓以至高濃度重金屬離子和低營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境為一般生物生長(zhǎng)和存活的極限,但卻能生長(zhǎng)著相應(yīng)的、能適應(yīng)這些極端環(huán)境的植物和微生物。這些生物經(jīng)長(zhǎng)期自然選擇,具備了較強(qiáng)且穩(wěn)定的特殊結(jié)構(gòu)、機(jī)能和遺傳基因,以應(yīng)答強(qiáng)烈的限制因子[3]。寧夏回族自治區(qū)位于西北地區(qū)東部、黃河中上游,地處中溫帶半干旱、干旱區(qū),降水稀少(平均年降水量292 mm),蒸發(fā)強(qiáng)烈(水面蒸發(fā)量1 296 mm),當(dāng)?shù)厮Y源總量為1 117億m3,僅占全國(guó)水資源總量的0.104%。近年來(lái),引黃灌區(qū)的土壤鹽漬化問(wèn)題受到了寧夏自治區(qū)的高度關(guān)注,銀川北部地區(qū)鹽堿地已占總耕地面積的49%以上[4]。所以,寧夏賀蘭山地區(qū)的土地鹽堿化程度高,本試驗(yàn)選取該地區(qū)高鹽堿環(huán)境下生長(zhǎng)的麻黃作為極端環(huán)境下的研究樣本。

    木賊麻黃(E.equisetina Bunge)、草麻黃(E.sinica Stapf)和中麻黃(E.intermedia Schrenk ex Mey)主要被《中國(guó)藥典》1985年版收載作為藥用的麻黃植物。從麻黃的作用和功效上看,其具有利水消腫、宣肺平喘、發(fā)汗散寒等功效,在中醫(yī)醫(yī)學(xué)上受到廣泛地利用[5]。本研究以寧夏回族自治區(qū)鹽堿地生長(zhǎng)的草麻黃為樣本,對(duì)麻黃根、莖、葉分別進(jìn)行了內(nèi)生真菌的分離、純化,并對(duì)得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行了抗菌活性、抗氧化活性的測(cè)定。對(duì)極端環(huán)境下藥用植物內(nèi)生真菌的研究,探討在外界惡劣環(huán)境下,植物與內(nèi)生真菌之間協(xié)同抵御環(huán)境影響的關(guān)系,并期望從中分離篩選出具有高生物活性的內(nèi)生真菌菌株。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)樣品

    選取寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭山區(qū)采集的麻黃。采集時(shí)間為2014年4~5月。采集麻黃新鮮枝葉,以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇擦拭表面后裝入保鮮袋,4 ℃封存。

    1.2 指示菌

    抗菌試驗(yàn)指示菌:大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphalococcus aureus)、炭疽桿菌(Bacillus anthraci)、黑曲霉(Aspergillus niger),均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌懸液。

    1.3 培養(yǎng)基

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200 g,加去離子水煮沸30 min,8層紗布過(guò)濾,濾液加入葡萄糖20 g,去離子水定容至1 000 mL,并加入2%~2.5%的瓊脂制成固體培養(yǎng)基。121 ℃高壓滅菌30 min。

    馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB):去皮馬鈴薯200 g,加去離子水煮沸30 min,8層紗布過(guò)濾,濾液加入葡萄糖20 g,去離子水定容至1 000 mL。121 ℃高壓滅菌30 min。

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA):蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂15~20 g,加入去離子水定容至1 000 mL,校正pH至7.2~7.4。121 ℃高壓滅菌30 min。

    1.4 儀器與設(shè)備

    ZSD-1160全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱、KYC-11021C恒溫培養(yǎng)搖床、臺(tái)式高速冷卻離心機(jī)、T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)、Multicontrol12L/18L型高壓滅菌鍋、PB303-E電子天平(METTLER-TOLEDO儀器公司)、北京長(zhǎng)源水浴控溫儀(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、R201D-11旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、超凈工作臺(tái)、試管、燒杯、錐形瓶。

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 內(nèi)生真菌的分離

    試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[6~9],將采集來(lái)的麻黃置于水槽中用流動(dòng)水沖洗5 min,將麻黃置于濾紙上自然風(fēng)干。將風(fēng)干的麻黃分為根、莖、葉三部分,分別剪成大小為2~3 cm的組織塊,在超凈工作臺(tái)再將樣品剪成0.5 cm×0.5 cm大小,并用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡1 min,去離子水漂洗2次;在2.5%的次氯酸溶液中浸泡2 min,去離子水漂洗3次。置于濾紙上風(fēng)干后,接種于含有磷酸慶大霉素的PDA培養(yǎng)基中(每皿3~4個(gè)組織塊)。置于恒溫培養(yǎng)箱中,28~30 ℃培養(yǎng)5~7 d,12 h觀察一次,48 h內(nèi)長(zhǎng)出的菌絲,均用無(wú)菌解剖刀連培養(yǎng)基切去。48 h后,將組織塊邊緣菌絲挑至另外PDA斜面進(jìn)行分離培養(yǎng),保種。

    2.2 內(nèi)生真菌的純化

    將分離出的菌種再次進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(此次培養(yǎng)基中不加磷酸慶大霉素),28~30 ℃培養(yǎng)5~7 d,48 h后將長(zhǎng)出的菌落邊緣菌絲挑至新配制的PDA培養(yǎng)基中。進(jìn)行3~4次重復(fù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后將菌種挑至斜面進(jìn)行保種。

    2.3 內(nèi)生真菌的發(fā)酵

    將上述經(jīng)純化的內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基中活化(28~30 ℃),5 d后配制液體培養(yǎng)基PDB,將經(jīng)活化的內(nèi)生真菌單個(gè)菌落的1/4用無(wú)菌解剖刀連培養(yǎng)基切下,放入PDB中,置于恒溫?fù)u床進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)間為14 d。發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液經(jīng)8層紗布過(guò)濾,以8 000 r/min速度離心10 min。離心結(jié)束后,取上清液進(jìn)行旋蒸,冷卻至室溫后置于洗凈的錐形瓶中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.4 抗氧化活性的測(cè)定

    2.4.1 抑制羥自由基能力測(cè)定 根據(jù)Fenton反應(yīng)測(cè)定樣品對(duì)羥自由基的抑制作用。采用南京建成公司生產(chǎn)的羥自由基測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A018 50T/48樣),依據(jù)其說(shuō)明配制應(yīng)用液。應(yīng)用液在37 ℃水浴中預(yù)溫3 min,并在水浴鍋中完成空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對(duì)照管和測(cè)定管的添加工作?;靹颍?7 ℃反應(yīng)1 min(以秒表計(jì)時(shí)),加入顯色劑終止反應(yīng),一次做一支試管。再次混勻后室溫放置20 min,而后以波長(zhǎng)550 nm,1 cm光徑,去離子水調(diào)零,測(cè)定各管的吸光值。

    抑制羥自由基能力(U/mL)

    =■×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(8.824 mmol/L)×■×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

    2.4.2 總抗氧化活性測(cè)定 機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì),能將Fe3+還原成為Fe2+,后者可與斐林類(lèi)物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物。采用南京建成公司生產(chǎn)的總抗氧化(T-AOC)測(cè)定試劑盒,依據(jù)說(shuō)明書(shū)配制應(yīng)用液。按要求加入相應(yīng)的應(yīng)用液,充分混勻后,37 ℃水浴30 min,向測(cè)定管和對(duì)照管中加入內(nèi)生真菌發(fā)酵液。再次混勻后放置10 min,而后以波長(zhǎng)520 nm,1 cm光徑,去離子水調(diào)零,測(cè)定各管的吸光值。

    總抗氧化能力(U/mL)=

    ■×■×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

    2.5 抗菌活性的測(cè)定

    取濾紙,用打孔器將濾紙打成直徑約0.5 cm的濾紙片,經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后備用。取本實(shí)驗(yàn)室保存的指示菌大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽桿菌(Bacillus anthraci)、黑曲霉(Aspergillus nige)進(jìn)行活化培養(yǎng),將經(jīng)活化的指示菌接種于培養(yǎng)基中,并在接種位置附近放置經(jīng)內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡的濾紙片。恒溫培養(yǎng)24 h后,測(cè)量濾紙片邊緣產(chǎn)生的抑菌圈大小。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 麻黃內(nèi)生真菌的分離

    用組織切片培養(yǎng)法從麻黃組織的葉片內(nèi)、莖和根部中共分離得到7株內(nèi)生真菌,其中葉片內(nèi)分離出2株、莖4株、根部1株。本試驗(yàn)分離到的麻黃內(nèi)生真菌數(shù)量較少,可能是由于麻黃生長(zhǎng)環(huán)境特殊所致;也可能是由于前期植物樣品經(jīng)消毒、滅菌的時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)于徹底導(dǎo)致。

    3.1 抗氧化活性測(cè)定

    3.1.1 抑制羥基自由基能力 經(jīng)羥基自由基測(cè)定試劑盒測(cè)定,7株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液經(jīng)稀釋20倍后抑制羥基自由基的能力如表1所示。

    用相同方法測(cè)得維生素C的抑制羥基自由基能力為908.47 U/mL。與維生素C的抑制羥基自由基能力相比較,7種內(nèi)生真菌發(fā)酵液中,除3號(hào)和6號(hào)抑制羥基自由基能力弱以外,其余5株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液均具有較高的抑制羥基自由基能力。

    3.1.2 總抗氧化測(cè)定 經(jīng)總抗氧化(T-AOC)測(cè)定試劑盒測(cè)定,7株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液總抗氧化能力如表2所示。

    用相同方法計(jì)算維生素C的總抗氧化能力為43.78 U/mL。由表2可知,7種內(nèi)生真菌發(fā)酵液中,2號(hào)和6號(hào)菌株發(fā)酵液的總抗氧化能力較弱,其余5株麻黃內(nèi)生真菌具有中等強(qiáng)度的總抗氧化活性。

    3.2 抗菌活性測(cè)定

    以金黃色葡萄球菌(SA)、大腸桿菌(EC)、炭疽桿菌(BA)、黑曲霉(AN)作為指示菌,采用濾紙片法對(duì)分離的7株麻黃內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)定。抑菌結(jié)果見(jiàn)表3。

    由表3可知,在7株供試菌中,對(duì)細(xì)菌類(lèi)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用,但對(duì)真菌類(lèi)的炭疽桿菌和黑曲霉均無(wú)抑菌作用。其中有5株對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出了較強(qiáng)的抗菌活性。

    4 小結(jié)與討論

    中國(guó)中草藥資源豐富,使用年代久遠(yuǎn),中草藥是具有價(jià)值的藥用資源[10]。麻黃作為一種傳統(tǒng)的中藥材在民間和中醫(yī)中廣泛采用。本研究選取寧夏回族自治區(qū)賀蘭山鹽堿化較重地區(qū)生長(zhǎng)的麻黃作為試驗(yàn)材料,分離得到7株內(nèi)生真菌。在麻黃內(nèi)生真菌的抗氧化活性測(cè)定中,選取抗氧化活性較強(qiáng)的維生素C作為陽(yáng)性對(duì)比,有5株顯示出中等強(qiáng)度的總抗氧化活性,5株顯示出較強(qiáng)抑制羥自由基能力。樣品的抗菌活性分析中,濾紙片法測(cè)定結(jié)果顯示,各株麻黃內(nèi)生真菌對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌具有一定的抑菌活性,但對(duì)炭疽桿菌和黑曲霉等真菌無(wú)抑菌作用。

    本研究對(duì)寧夏回族自治區(qū)鹽堿化地區(qū)生長(zhǎng)的藥用植物麻黃進(jìn)行了內(nèi)生真菌的初步分離,并對(duì)其生物活性進(jìn)行了初步探討,為藥用植物內(nèi)生真菌的研究添加了植物樣本。同時(shí),對(duì)內(nèi)生真菌生物活性研究為從特殊生境的藥用植物中得到結(jié)構(gòu)新穎的藥物先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ),對(duì)藥用植物的保護(hù)與合理開(kāi)發(fā)利用意義重大。

    參考文獻(xiàn):

    [1] 華永麗,歐陽(yáng)少林,陳美蘭,等.藥用植物內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2008,10(4):105-111.

    [2] 常明進(jìn),李春強(qiáng),彭 明.天然藥物紫杉醇的研究與開(kāi)發(fā)[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(2):257-258.

    [3] 范光南,傅世宗,蔡海洋.極端環(huán)境微生物的研究概況[J].福建熱作科技,2000,25(2):12-15.

    [4] 李 茜,孫兆軍,秦 萍.寧夏鹽堿地現(xiàn)狀及改良措施綜述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(33):10808-10810,10813.

    [5] 聶 毅,張洪林.中草藥麻黃和益母草中的生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌代謝作用的微量量熱法研究[J].化學(xué)世界,2005(3):133-136,154.

    [6] TAECHOWISAN T,PEBERDY J F,LUMYONG S. Isolation of endophytic actinomycetes from selected plants and their antifungal activity[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology,2003,19(4):381-385.

    [7] 何 穎,談 鋒,謝建平.紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2006(18):519-523,513.

    [8] LI Y,SONG Y C,LIU J Y,et al. Anti-Helicobacter pylori substance from endophytic fungal culture[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2005(21):553-558.

    [9] 廖友媛,曾松榮,馬建波,等.藥用植物辣木內(nèi)生真菌的分離及其抗菌活性分析[J].株洲工學(xué)院學(xué)報(bào), 2006,20(6):36-38.

    [10] KUO Y C,LIN Y L,LIU C P,et al. Herpes simplex virus type propagation in Hela cells interrupted by Nelumbo nucifera[J]. Journal of Biomedical Science,2005,12(6):1021-1034.

    猜你喜歡
    內(nèi)生真菌抗氧化活性麻黃
    A Network Pharmacology Study on the Effects of Ma Xing Shi Gan Decoction on Influenza
    Systematic Pharmacological Strategies to Explore the Regulatory Mechanism of Ma Xing Shi Gan Decoction on COVID-19
    關(guān)注麻黃的配伍禁忌
    雞骨草葉總生物堿的含量測(cè)定及其體外抗氧化活性研究
    黃草烏根部?jī)?nèi)生真菌的分離與鑒定
    麒麟尾總黃酮提取及其抗氧化作用研究
    茶樹(shù)內(nèi)生真菌研究進(jìn)展
    海洋藥物
    麻黃多糖提取工藝優(yōu)化
    亚洲中文字幕日韩| 婷婷色综合大香蕉| or卡值多少钱| 亚洲欧美日韩高清专用| 观看免费一级毛片| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人国产一区最新在线观看| 少妇的逼好多水| 欧美黑人巨大hd| 国产v大片淫在线免费观看| 成人一区二区视频在线观看| 在线观看66精品国产| 日韩中字成人| 免费看美女性在线毛片视频| 国产v大片淫在线免费观看| 9191精品国产免费久久| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美在线黄色| 国产精品精品国产色婷婷| 能在线免费观看的黄片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 在线天堂最新版资源| 婷婷六月久久综合丁香| 日本a在线网址| 色视频www国产| 中文字幕av在线有码专区| 国产高清视频在线播放一区| 国产一区二区在线av高清观看| 午夜福利视频1000在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 此物有八面人人有两片| 露出奶头的视频| 国产麻豆成人av免费视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 日本黄色视频三级网站网址| 亚洲18禁久久av| 性色avwww在线观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 深夜精品福利| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 精品久久久久久久久久免费视频| 伦理电影大哥的女人| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日本与韩国留学比较| 亚洲无线在线观看| 欧美3d第一页| 亚洲色图av天堂| av国产免费在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 麻豆av噜噜一区二区三区| 久久久久久久久中文| 日韩人妻高清精品专区| 欧美一区二区国产精品久久精品| 很黄的视频免费| 午夜日韩欧美国产| 亚洲精品成人久久久久久| 日本免费a在线| 美女高潮的动态| 国产精品不卡视频一区二区 | 一个人免费在线观看的高清视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 中文字幕高清在线视频| 波多野结衣高清无吗| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲成人久久性| 国产高清视频在线观看网站| 国产人妻一区二区三区在| 精品国内亚洲2022精品成人| 波多野结衣高清无吗| 乱人视频在线观看| 久久草成人影院| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品久久久久久精品电影| 色精品久久人妻99蜜桃| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 亚洲精品在线美女| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国内精品久久久久久久电影| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 欧美bdsm另类| 亚洲欧美清纯卡通| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 中文字幕av成人在线电影| 成人特级av手机在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产 | 悠悠久久av| 少妇的逼好多水| 一进一出抽搐动态| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 中亚洲国语对白在线视频| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 最近最新中文字幕大全电影3| 在线a可以看的网站| 国产高清激情床上av| 91久久精品国产一区二区成人| 国产v大片淫在线免费观看| 婷婷亚洲欧美| 日韩欧美三级三区| 热99re8久久精品国产| 欧美日本视频| 在线观看一区二区三区| 午夜精品在线福利| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久亚洲精品不卡| 国产亚洲精品久久久com| 久久久精品大字幕| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲无线在线观看| 如何舔出高潮| 久久国产精品影院| 国产精品免费一区二区三区在线| 99在线视频只有这里精品首页| 看黄色毛片网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 一夜夜www| 精品久久久久久成人av| 日本黄色视频三级网站网址| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产亚洲欧美98| 亚洲最大成人中文| 亚洲av免费在线观看| 久9热在线精品视频| 少妇的逼水好多| 国产成人福利小说| 国产成人aa在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产男靠女视频免费网站| 69人妻影院| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 老司机福利观看| av天堂中文字幕网| 90打野战视频偷拍视频| 日韩欧美在线二视频| 全区人妻精品视频| 听说在线观看完整版免费高清| 夜夜夜夜夜久久久久| 成人国产综合亚洲| 亚洲精品色激情综合| 精品熟女少妇八av免费久了| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 熟女人妻精品中文字幕| 日韩国内少妇激情av| 久久亚洲精品不卡| 可以在线观看的亚洲视频| 国产精品不卡视频一区二区 | 一本精品99久久精品77| 免费看a级黄色片| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 午夜久久久久精精品| 亚洲中文字幕日韩| 久久久精品欧美日韩精品| 91麻豆av在线| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜福利免费观看在线| 久久久久精品国产欧美久久久| 三级国产精品欧美在线观看| 一夜夜www| 99久久成人亚洲精品观看| 日本成人三级电影网站| 亚洲av电影在线进入| 如何舔出高潮| 两个人的视频大全免费| 欧美激情在线99| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 伦理电影大哥的女人| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产单亲对白刺激| 欧美三级亚洲精品| 日本a在线网址| av在线老鸭窝| 丁香欧美五月| 亚洲国产色片| 99国产精品一区二区三区| 欧美午夜高清在线| 又爽又黄无遮挡网站| 精品不卡国产一区二区三区| 18禁在线播放成人免费| 日本在线视频免费播放| av天堂在线播放| 欧美黑人巨大hd| 99热精品在线国产| 国产高清激情床上av| 禁无遮挡网站| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日韩欧美三级三区| 国产精品伦人一区二区| av在线蜜桃| 天美传媒精品一区二区| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 性色avwww在线观看| 在线国产一区二区在线| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲欧美激情综合另类| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 直男gayav资源| 91久久精品电影网| 亚洲av熟女| 中文字幕久久专区| 一区福利在线观看| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| av专区在线播放| 97碰自拍视频| 禁无遮挡网站| 国产毛片a区久久久久| 亚洲av电影不卡..在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 十八禁国产超污无遮挡网站| 精品人妻1区二区| 成人无遮挡网站| 久久久久久久久中文| 热99在线观看视频| 国产视频内射| 在线观看66精品国产| 舔av片在线| 最近最新中文字幕大全电影3| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日韩有码中文字幕| 国语自产精品视频在线第100页| 国产一区二区激情短视频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 中文字幕av成人在线电影| 中亚洲国语对白在线视频| 国产亚洲精品av在线| 欧美午夜高清在线| 国产精品久久久久久久久免 | 午夜福利在线观看吧| 少妇的逼水好多| 国产精品一及| 免费黄网站久久成人精品 | 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 人妻久久中文字幕网| 国产爱豆传媒在线观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 少妇熟女aⅴ在线视频| 亚洲熟妇熟女久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 色噜噜av男人的天堂激情| 精品人妻熟女av久视频| 欧美三级亚洲精品| 午夜老司机福利剧场| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久久久久国产a免费观看| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品影院久久| 一级作爱视频免费观看| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产伦人伦偷精品视频| 欧美高清成人免费视频www| 欧美黄色片欧美黄色片| 天堂影院成人在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 看片在线看免费视频| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 国产日本99.免费观看| 国内精品美女久久久久久| 99在线人妻在线中文字幕| 别揉我奶头 嗯啊视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 午夜免费激情av| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 成人三级黄色视频| 美女黄网站色视频| 久久亚洲真实| 精品久久久久久久久久久久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲五月婷婷丁香| 免费av不卡在线播放| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 怎么达到女性高潮| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品乱码久久久久久99久播| 日韩欧美在线二视频| 精品久久久久久,| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产高潮美女av| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美日韩黄片免| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲国产精品合色在线| 69人妻影院| 在线播放无遮挡| 国产欧美日韩精品亚洲av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| eeuss影院久久| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲精品久久国产高清桃花| 特级一级黄色大片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 麻豆一二三区av精品| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲在线观看片| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 国产v大片淫在线免费观看| av天堂在线播放| 亚洲人成电影免费在线| 1000部很黄的大片| 麻豆成人午夜福利视频| 免费在线观看影片大全网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 悠悠久久av| 日本一二三区视频观看| 在线观看免费视频日本深夜| 淫秽高清视频在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 最新中文字幕久久久久| 久99久视频精品免费| 国产免费男女视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 在线播放无遮挡| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 国产伦精品一区二区三区四那| 亚洲,欧美精品.| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 香蕉av资源在线| 校园春色视频在线观看| 国产高清激情床上av| 色综合欧美亚洲国产小说| 精品久久久久久,| 桃色一区二区三区在线观看| 国产野战对白在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产美女午夜福利| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精华一区二区三区| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美日韩国产亚洲二区| 18禁在线播放成人免费| 久久久久久久久久成人| 69人妻影院| 国产免费男女视频| 欧美成人性av电影在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲黑人精品在线| 国产黄片美女视频| 中亚洲国语对白在线视频| 成年版毛片免费区| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲专区国产一区二区| 俺也久久电影网| 在线观看免费视频日本深夜| 久久九九热精品免费| 日本黄色视频三级网站网址| 1024手机看黄色片| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 99热精品在线国产| 欧美一区二区国产精品久久精品| 久久草成人影院| 成人国产一区最新在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 男人舔奶头视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产成人aa在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 好男人在线观看高清免费视频| 999久久久精品免费观看国产| 俺也久久电影网| 午夜两性在线视频| 欧美色视频一区免费| 精品一区二区三区人妻视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 无人区码免费观看不卡| 国产男靠女视频免费网站| 99热这里只有是精品在线观看 | 国产av一区在线观看免费| 丰满的人妻完整版| 真实男女啪啪啪动态图| www.999成人在线观看| 啦啦啦韩国在线观看视频| 国产一区二区激情短视频| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 最近视频中文字幕2019在线8| 可以在线观看毛片的网站| 国产免费av片在线观看野外av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲国产高清在线一区二区三| 男女视频在线观看网站免费| 99视频精品全部免费 在线| 俺也久久电影网| 亚洲国产高清在线一区二区三| 免费观看的影片在线观看| 欧美日韩黄片免| 国产人妻一区二区三区在| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 一本综合久久免费| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 十八禁人妻一区二区| 久久精品91蜜桃| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久亚洲av毛片大全| 午夜激情欧美在线| 日韩欧美精品v在线| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产不卡一卡二| 久久精品国产亚洲av天美| 99久久精品热视频| 淫妇啪啪啪对白视频| 十八禁网站免费在线| 成人一区二区视频在线观看| 欧美性感艳星| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 最后的刺客免费高清国语| 永久网站在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 亚洲美女黄片视频| 亚洲人成网站在线播| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲在线观看片| 国产精品日韩av在线免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产高清有码在线观看视频| 国产精品1区2区在线观看.| 俺也久久电影网| 亚洲成人久久性| 精品无人区乱码1区二区| 无遮挡黄片免费观看| 老司机福利观看| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲av成人精品一区久久| 国产黄a三级三级三级人| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美三级亚洲精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日本与韩国留学比较| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲激情在线av| 欧美日本亚洲视频在线播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 一进一出好大好爽视频| 可以在线观看毛片的网站| 18禁在线播放成人免费| 婷婷亚洲欧美| 久久午夜福利片| 精品一区二区三区人妻视频| 国产视频内射| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产探花极品一区二区| 啪啪无遮挡十八禁网站| 999久久久精品免费观看国产| 51国产日韩欧美| 久久国产乱子免费精品| 一本精品99久久精品77| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产伦一二天堂av在线观看| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产一级毛片七仙女欲春2| 午夜激情福利司机影院| 最新中文字幕久久久久| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 欧美性猛交黑人性爽| 欧美精品啪啪一区二区三区| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 校园春色视频在线观看| 亚洲av成人av| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 久久精品人妻少妇| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 看黄色毛片网站| 丝袜美腿在线中文| 两个人的视频大全免费| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 97超视频在线观看视频| 中文资源天堂在线| 亚洲五月天丁香| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产成人欧美在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 一夜夜www| 亚洲电影在线观看av| 久久久久性生活片| 亚洲美女视频黄频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 最近中文字幕高清免费大全6 | 中文字幕av成人在线电影| 特大巨黑吊av在线直播| 亚州av有码| 91九色精品人成在线观看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 1000部很黄的大片| 亚洲欧美精品综合久久99| 99热只有精品国产| 韩国av一区二区三区四区| 一区二区三区免费毛片| 嫩草影视91久久| 国产成人啪精品午夜网站| 有码 亚洲区| 国内精品一区二区在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| av国产免费在线观看| 久久久精品大字幕| 日本a在线网址| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 桃色一区二区三区在线观看| 色吧在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 高清毛片免费观看视频网站| 日本与韩国留学比较| 国产综合懂色| 国产精品女同一区二区软件 | www.999成人在线观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲成av人片免费观看| 美女大奶头视频| 99热这里只有是精品50| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国内精品美女久久久久久| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲av免费在线观看| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 日韩成人在线观看一区二区三区| 观看免费一级毛片| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 成年女人看的毛片在线观看| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产私拍福利视频在线观看| 国产午夜精品论理片| 一本久久中文字幕| 国产真实伦视频高清在线观看 | 国语自产精品视频在线第100页| 男女视频在线观看网站免费| 一级黄色大片毛片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 一区二区三区高清视频在线| 能在线免费观看的黄片| 久久久久久九九精品二区国产| 精品无人区乱码1区二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 精品午夜福利在线看| 国产探花极品一区二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 男女下面进入的视频免费午夜| 看片在线看免费视频| 国产精品久久视频播放| 国产av在哪里看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 一级毛片久久久久久久久女| 三级国产精品欧美在线观看| 中文字幕免费在线视频6| 亚洲国产欧美人成| 又紧又爽又黄一区二区| 美女高潮的动态| 十八禁网站免费在线| 少妇高潮的动态图| 一级黄片播放器| 亚洲,欧美精品.| 国产精品乱码一区二三区的特点| 精品熟女少妇八av免费久了| 99久久精品热视频| 91狼人影院| 久久久色成人| 热99在线观看视频| 在线观看舔阴道视频| 成年人黄色毛片网站| 婷婷色综合大香蕉| 波多野结衣巨乳人妻| 十八禁人妻一区二区| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲三级黄色毛片| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 波多野结衣高清无吗| 男女那种视频在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 91久久精品电影网| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 亚洲av一区综合| 欧美一区二区精品小视频在线| 婷婷丁香在线五月| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 校园春色视频在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 成年女人看的毛片在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 亚洲一区高清亚洲精品| 九色成人免费人妻av| 麻豆成人av在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲中文字幕日韩| 欧美极品一区二区三区四区| 久久久精品欧美日韩精品| 精品一区二区三区人妻视频| 直男gayav资源| 国产黄色小视频在线观看| 日韩人妻高清精品专区| av在线老鸭窝| 夜夜爽天天搞| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 |