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    麻黃內(nèi)生真菌的初步研究

    2015-10-13 21:51于淼等
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015年18期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)生真菌抗氧化活性麻黃

    于淼等

    摘要:從寧夏回族自治區(qū)賀蘭山高鹽堿地區(qū)采集的麻黃樣本中分離得到7株內(nèi)生真菌,體外抗氧化活性測(cè)定表明,所分離到的內(nèi)生真菌中有5株具有較高的抑制羥基自由基能力;有5株菌的發(fā)酵液具有中等強(qiáng)度的總抗氧化能力。在抗菌活性測(cè)定中,所分離到的7株麻黃內(nèi)生真菌對(duì)細(xì)菌指示菌大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用,但對(duì)真菌指示菌炭疽桿菌和黑曲霉均未檢測(cè)到抑菌活性。

    關(guān)鍵詞:麻黃(Ephedra sinica);內(nèi)生真菌;抗菌活性;抗氧化活性

    中圖分類(lèi)號(hào):S432 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2015)18-4482-03

    DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.18.023

    自1898年Vogl從黑麥草(Lolium temulentum L.)種子內(nèi)將第一株內(nèi)生真菌分離出來(lái)至今,已有100多年的歷史,但是最近20年才正式開(kāi)展藥用植物內(nèi)生真菌的研究[1]。1993年美國(guó)Montana州大學(xué)植物病理系博士Stierle等分離紅豆杉韌皮部的內(nèi)生真菌,得到產(chǎn)生化合產(chǎn)物紫杉醇的內(nèi)生真菌[2]。該類(lèi)菌株的發(fā)現(xiàn)使得微生物學(xué)者的目光都放在植物,特別是藥用植物內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物研究上。這類(lèi)研究使得目前致病菌對(duì)抗生素的耐藥性蔓延起到了至關(guān)重要的改善作用。

    在自然界存在很多極端環(huán)境,如高鹽、高堿、高酸、高干旱、高壓以至高濃度重金屬離子和低營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境為一般生物生長(zhǎng)和存活的極限,但卻能生長(zhǎng)著相應(yīng)的、能適應(yīng)這些極端環(huán)境的植物和微生物。這些生物經(jīng)長(zhǎng)期自然選擇,具備了較強(qiáng)且穩(wěn)定的特殊結(jié)構(gòu)、機(jī)能和遺傳基因,以應(yīng)答強(qiáng)烈的限制因子[3]。寧夏回族自治區(qū)位于西北地區(qū)東部、黃河中上游,地處中溫帶半干旱、干旱區(qū),降水稀少(平均年降水量292 mm),蒸發(fā)強(qiáng)烈(水面蒸發(fā)量1 296 mm),當(dāng)?shù)厮Y源總量為1 117億m3,僅占全國(guó)水資源總量的0.104%。近年來(lái),引黃灌區(qū)的土壤鹽漬化問(wèn)題受到了寧夏自治區(qū)的高度關(guān)注,銀川北部地區(qū)鹽堿地已占總耕地面積的49%以上[4]。所以,寧夏賀蘭山地區(qū)的土地鹽堿化程度高,本試驗(yàn)選取該地區(qū)高鹽堿環(huán)境下生長(zhǎng)的麻黃作為極端環(huán)境下的研究樣本。

    木賊麻黃(E.equisetina Bunge)、草麻黃(E.sinica Stapf)和中麻黃(E.intermedia Schrenk ex Mey)主要被《中國(guó)藥典》1985年版收載作為藥用的麻黃植物。從麻黃的作用和功效上看,其具有利水消腫、宣肺平喘、發(fā)汗散寒等功效,在中醫(yī)醫(yī)學(xué)上受到廣泛地利用[5]。本研究以寧夏回族自治區(qū)鹽堿地生長(zhǎng)的草麻黃為樣本,對(duì)麻黃根、莖、葉分別進(jìn)行了內(nèi)生真菌的分離、純化,并對(duì)得到的內(nèi)生真菌進(jìn)行了抗菌活性、抗氧化活性的測(cè)定。對(duì)極端環(huán)境下藥用植物內(nèi)生真菌的研究,探討在外界惡劣環(huán)境下,植物與內(nèi)生真菌之間協(xié)同抵御環(huán)境影響的關(guān)系,并期望從中分離篩選出具有高生物活性的內(nèi)生真菌菌株。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)樣品

    選取寧夏回族自治區(qū)銀川市賀蘭山區(qū)采集的麻黃。采集時(shí)間為2014年4~5月。采集麻黃新鮮枝葉,以體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇擦拭表面后裝入保鮮袋,4 ℃封存。

    1.2 指示菌

    抗菌試驗(yàn)指示菌:大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphalococcus aureus)、炭疽桿菌(Bacillus anthraci)、黑曲霉(Aspergillus niger),均為本實(shí)驗(yàn)室保存菌懸液。

    1.3 培養(yǎng)基

    馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA):去皮馬鈴薯200 g,加去離子水煮沸30 min,8層紗布過(guò)濾,濾液加入葡萄糖20 g,去離子水定容至1 000 mL,并加入2%~2.5%的瓊脂制成固體培養(yǎng)基。121 ℃高壓滅菌30 min。

    馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB):去皮馬鈴薯200 g,加去離子水煮沸30 min,8層紗布過(guò)濾,濾液加入葡萄糖20 g,去離子水定容至1 000 mL。121 ℃高壓滅菌30 min。

    牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA):蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,氯化鈉5 g,瓊脂15~20 g,加入去離子水定容至1 000 mL,校正pH至7.2~7.4。121 ℃高壓滅菌30 min。

    1.4 儀器與設(shè)備

    ZSD-1160全自動(dòng)新型生化培養(yǎng)箱、KYC-11021C恒溫培養(yǎng)搖床、臺(tái)式高速冷卻離心機(jī)、T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)、Multicontrol12L/18L型高壓滅菌鍋、PB303-E電子天平(METTLER-TOLEDO儀器公司)、北京長(zhǎng)源水浴控溫儀(北京長(zhǎng)源實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)、R201D-11旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、超凈工作臺(tái)、試管、燒杯、錐形瓶。

    2 試驗(yàn)方法

    2.1 內(nèi)生真菌的分離

    試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[6~9],將采集來(lái)的麻黃置于水槽中用流動(dòng)水沖洗5 min,將麻黃置于濾紙上自然風(fēng)干。將風(fēng)干的麻黃分為根、莖、葉三部分,分別剪成大小為2~3 cm的組織塊,在超凈工作臺(tái)再將樣品剪成0.5 cm×0.5 cm大小,并用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇浸泡1 min,去離子水漂洗2次;在2.5%的次氯酸溶液中浸泡2 min,去離子水漂洗3次。置于濾紙上風(fēng)干后,接種于含有磷酸慶大霉素的PDA培養(yǎng)基中(每皿3~4個(gè)組織塊)。置于恒溫培養(yǎng)箱中,28~30 ℃培養(yǎng)5~7 d,12 h觀察一次,48 h內(nèi)長(zhǎng)出的菌絲,均用無(wú)菌解剖刀連培養(yǎng)基切去。48 h后,將組織塊邊緣菌絲挑至另外PDA斜面進(jìn)行分離培養(yǎng),保種。

    2.2 內(nèi)生真菌的純化

    將分離出的菌種再次進(jìn)行恒溫培養(yǎng)(此次培養(yǎng)基中不加磷酸慶大霉素),28~30 ℃培養(yǎng)5~7 d,48 h后將長(zhǎng)出的菌落邊緣菌絲挑至新配制的PDA培養(yǎng)基中。進(jìn)行3~4次重復(fù)培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后將菌種挑至斜面進(jìn)行保種。

    2.3 內(nèi)生真菌的發(fā)酵

    將上述經(jīng)純化的內(nèi)生真菌接種于PDA培養(yǎng)基中活化(28~30 ℃),5 d后配制液體培養(yǎng)基PDB,將經(jīng)活化的內(nèi)生真菌單個(gè)菌落的1/4用無(wú)菌解剖刀連培養(yǎng)基切下,放入PDB中,置于恒溫?fù)u床進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵時(shí)間為14 d。發(fā)酵結(jié)束后,將發(fā)酵液經(jīng)8層紗布過(guò)濾,以8 000 r/min速度離心10 min。離心結(jié)束后,取上清液進(jìn)行旋蒸,冷卻至室溫后置于洗凈的錐形瓶中,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.4 抗氧化活性的測(cè)定

    2.4.1 抑制羥自由基能力測(cè)定 根據(jù)Fenton反應(yīng)測(cè)定樣品對(duì)羥自由基的抑制作用。采用南京建成公司生產(chǎn)的羥自由基測(cè)定試劑盒(貨號(hào):A018 50T/48樣),依據(jù)其說(shuō)明配制應(yīng)用液。應(yīng)用液在37 ℃水浴中預(yù)溫3 min,并在水浴鍋中完成空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、對(duì)照管和測(cè)定管的添加工作?;靹颍?7 ℃反應(yīng)1 min(以秒表計(jì)時(shí)),加入顯色劑終止反應(yīng),一次做一支試管。再次混勻后室溫放置20 min,而后以波長(zhǎng)550 nm,1 cm光徑,去離子水調(diào)零,測(cè)定各管的吸光值。

    抑制羥自由基能力(U/mL)

    =■×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(8.824 mmol/L)×■×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

    2.4.2 總抗氧化活性測(cè)定 機(jī)體中有許多抗氧化物質(zhì),能將Fe3+還原成為Fe2+,后者可與斐林類(lèi)物質(zhì)形成穩(wěn)固的絡(luò)合物。采用南京建成公司生產(chǎn)的總抗氧化(T-AOC)測(cè)定試劑盒,依據(jù)說(shuō)明書(shū)配制應(yīng)用液。按要求加入相應(yīng)的應(yīng)用液,充分混勻后,37 ℃水浴30 min,向測(cè)定管和對(duì)照管中加入內(nèi)生真菌發(fā)酵液。再次混勻后放置10 min,而后以波長(zhǎng)520 nm,1 cm光徑,去離子水調(diào)零,測(cè)定各管的吸光值。

    總抗氧化能力(U/mL)=

    ■×■×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

    2.5 抗菌活性的測(cè)定

    取濾紙,用打孔器將濾紙打成直徑約0.5 cm的濾紙片,經(jīng)高壓滅菌鍋滅菌后備用。取本實(shí)驗(yàn)室保存的指示菌大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、炭疽桿菌(Bacillus anthraci)、黑曲霉(Aspergillus nige)進(jìn)行活化培養(yǎng),將經(jīng)活化的指示菌接種于培養(yǎng)基中,并在接種位置附近放置經(jīng)內(nèi)生真菌發(fā)酵液浸泡的濾紙片。恒溫培養(yǎng)24 h后,測(cè)量濾紙片邊緣產(chǎn)生的抑菌圈大小。

    3 結(jié)果與分析

    3.1 麻黃內(nèi)生真菌的分離

    用組織切片培養(yǎng)法從麻黃組織的葉片內(nèi)、莖和根部中共分離得到7株內(nèi)生真菌,其中葉片內(nèi)分離出2株、莖4株、根部1株。本試驗(yàn)分離到的麻黃內(nèi)生真菌數(shù)量較少,可能是由于麻黃生長(zhǎng)環(huán)境特殊所致;也可能是由于前期植物樣品經(jīng)消毒、滅菌的時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)于徹底導(dǎo)致。

    3.1 抗氧化活性測(cè)定

    3.1.1 抑制羥基自由基能力 經(jīng)羥基自由基測(cè)定試劑盒測(cè)定,7株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液經(jīng)稀釋20倍后抑制羥基自由基的能力如表1所示。

    用相同方法測(cè)得維生素C的抑制羥基自由基能力為908.47 U/mL。與維生素C的抑制羥基自由基能力相比較,7種內(nèi)生真菌發(fā)酵液中,除3號(hào)和6號(hào)抑制羥基自由基能力弱以外,其余5株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液均具有較高的抑制羥基自由基能力。

    3.1.2 總抗氧化測(cè)定 經(jīng)總抗氧化(T-AOC)測(cè)定試劑盒測(cè)定,7株麻黃內(nèi)生真菌發(fā)酵液總抗氧化能力如表2所示。

    用相同方法計(jì)算維生素C的總抗氧化能力為43.78 U/mL。由表2可知,7種內(nèi)生真菌發(fā)酵液中,2號(hào)和6號(hào)菌株發(fā)酵液的總抗氧化能力較弱,其余5株麻黃內(nèi)生真菌具有中等強(qiáng)度的總抗氧化活性。

    3.2 抗菌活性測(cè)定

    以金黃色葡萄球菌(SA)、大腸桿菌(EC)、炭疽桿菌(BA)、黑曲霉(AN)作為指示菌,采用濾紙片法對(duì)分離的7株麻黃內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性測(cè)定。抑菌結(jié)果見(jiàn)表3。

    由表3可知,在7株供試菌中,對(duì)細(xì)菌類(lèi)的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用,但對(duì)真菌類(lèi)的炭疽桿菌和黑曲霉均無(wú)抑菌作用。其中有5株對(duì)金黃色葡萄球菌顯示出了較強(qiáng)的抗菌活性。

    4 小結(jié)與討論

    中國(guó)中草藥資源豐富,使用年代久遠(yuǎn),中草藥是具有價(jià)值的藥用資源[10]。麻黃作為一種傳統(tǒng)的中藥材在民間和中醫(yī)中廣泛采用。本研究選取寧夏回族自治區(qū)賀蘭山鹽堿化較重地區(qū)生長(zhǎng)的麻黃作為試驗(yàn)材料,分離得到7株內(nèi)生真菌。在麻黃內(nèi)生真菌的抗氧化活性測(cè)定中,選取抗氧化活性較強(qiáng)的維生素C作為陽(yáng)性對(duì)比,有5株顯示出中等強(qiáng)度的總抗氧化活性,5株顯示出較強(qiáng)抑制羥自由基能力。樣品的抗菌活性分析中,濾紙片法測(cè)定結(jié)果顯示,各株麻黃內(nèi)生真菌對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌具有一定的抑菌活性,但對(duì)炭疽桿菌和黑曲霉等真菌無(wú)抑菌作用。

    本研究對(duì)寧夏回族自治區(qū)鹽堿化地區(qū)生長(zhǎng)的藥用植物麻黃進(jìn)行了內(nèi)生真菌的初步分離,并對(duì)其生物活性進(jìn)行了初步探討,為藥用植物內(nèi)生真菌的研究添加了植物樣本。同時(shí),對(duì)內(nèi)生真菌生物活性研究為從特殊生境的藥用植物中得到結(jié)構(gòu)新穎的藥物先導(dǎo)化合物奠定了基礎(chǔ),對(duì)藥用植物的保護(hù)與合理開(kāi)發(fā)利用意義重大。

    參考文獻(xiàn):

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