不同產(chǎn)地腌漬蘿卜化學(xué)成分分析及抑菌活性比較

趙 雪，盧珍華，曾榮急，蘇國成，李桂玲，2，李 健，2*

（1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

白蘿卜（Raphanus sativus）原產(chǎn)地歐洲，十字花科蘿卜屬的一種常見的根莖類蔬菜，在我國已有2 700年的栽種歷史[1]。民間一直流傳著“冬吃蘿卜夏吃姜，不勞醫(yī)生開藥方”等養(yǎng)生諺語。以白蘿卜為原材料制作的腌漬品，加工方式多樣，口感獨(dú)特，既提高了農(nóng)副產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，又延長了蘿卜的保質(zhì)期[2]。

白蘿卜在腌漬過程中發(fā)生了一系列復(fù)雜的化學(xué)變化，主要可以分為兩個方面：一方面是高鹽滲透作用使蘿卜脫水萎縮，形成了柔軟緊密的細(xì)胞結(jié)構(gòu)[3]，抑菌活性物質(zhì)4-甲硫基-3-丁烯基異硫氰酸鹽（4-（methylthio）-3-butenylisothiocyanate，MTBITC）隨鹽度的增加而降低[4-5]。另一方面微生物利用白蘿卜及其腌制液中的糖類物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)酸，形成了特殊的口感[6]。日本學(xué)者KUMAKURA K等[7]通過靶向代謝分析腌漬蘿卜營養(yǎng)成分變化得到：蘿卜鹽漬時(shí)間的加長，會使γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、多不飽和脂肪酸和支鏈氨基酸的水平升高。有研究發(fā)現(xiàn)漳浦白蘿卜經(jīng)過陳年發(fā)酵腌漬，產(chǎn)生了新的化學(xué)成分羥基苯甲醛、對羥基苯乙醇、β-谷甾醇、2,6-二羥基苯乙酮，松脂素等[8]，其中部分化學(xué)物質(zhì)存在抑菌活性。蘿卜品種、種植條件、加工工藝的不同會影響腌漬蘿卜的化學(xué)成分，為初步探究陳年腌漬蘿卜提取物的地域性差異，本研究以永新、漳浦、潮汕、樂清、蘇州蘿卜干及新鮮白蘿卜為實(shí)驗(yàn)材料，采用高效液相色譜法分析對比了不同產(chǎn)地的腌漬蘿卜化學(xué)成分差異，并對其提取物的抑菌活性和細(xì)胞毒性進(jìn)行分析，為腌漬蘿卜的抑菌功效及食品安全性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

新鮮白蘿卜：廈門市集美菜市場；漳浦蘿卜干：福建省漳州市漳浦縣；潮汕蘿卜干：廣東省潮汕縣；永新蘿卜干：江西省永新縣；樂清蘿卜干：廣西省樂清縣；蘇州蘿卜干：江蘇省蘇州市。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：中國微生物菌種保藏中心；人體肝臟腫瘤細(xì)胞（HepG2）、人體正常肝細(xì)胞（LO2）：中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.1.2 化學(xué)試劑

甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲亞砜（dimethylsuloxide，DMSO）：西隴化工股份有限公司；四甲基噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）：南京奧多福尼生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基、酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WK-1600A型高速藥物粉碎機(jī)：青州市精誠機(jī)械有限公司；RV8型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA集團(tuán)；HWY-2112型雙層恒溫培養(yǎng)搖床：廈門德維科技有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；JMY-2102C生化培養(yǎng)箱：上海久茂試驗(yàn)儀器制造公司；Synergy H1MF多功能酶標(biāo)儀：美國伯騰儀器有限公司；SW-CJ-2FD無菌超凈操作臺：蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Forma 3111水套式CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱：賽默飛世爾科技有限公司；SC-403生物安全柜：美國BAKER公司；DEAE203170高效液相色譜儀：安捷倫（中國）有限公司；SHZ-D（III）玻璃抽濾裝置：上海暉創(chuàng)化學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取物浸膏的制備

將購買的新鮮白蘿卜及其他5種不同地區(qū)的白蘿卜腌漬品切片，于55℃烘箱中干燥至恒質(zhì)量，高速粉碎后得到干粉，80目過篩，置于干燥器中保存?zhèn)溆?。稱取適量干粉，分別加入5倍體積的甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯、丙酮，密封后置于150 r/min的搖床中浸提24 h，抽濾后收集提取液，在抽濾得到的殘?jiān)屑尤胂嗤w積的有機(jī)試劑，在同樣的條件下重復(fù)浸提3次，合并濾液后，旋蒸濃縮，得到5種有機(jī)試劑的提取物浸膏，共得30個樣品，標(biāo)記后4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 高效液相色譜分析

使用DEAE203170高效液相色譜-紫外檢測器檢測法，將30種提取物浸膏用適量甲醇稀釋為30 mg/mL。用甲醇（A）-水（B）體系作為流動相進(jìn)行梯度洗脫：0～2 min，10%A和90%B；2～15 min，25%A和75%B；15～20 min，50%A和50%B；20～25 min，75%A和25%B；25～35 min，100%A和0%B；35～45 min，100%A和0%B；流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃，檢測波長為302nm[9]，色譜柱為693970-902 Agilent TC-C18（4.6 mm×150 mm，4 μm）。

1.3.3 抑菌活性的測定

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、釀酒酵母作為指示菌，采用牛津杯法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。參照AGOURRAM A等[10]的方法，用PDA培養(yǎng)基活化釀酒酵母菌菌種、PCA培養(yǎng)基活化大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌種2代，再分別制成菌懸液，使菌液濃度為108CFU/mL。待瓊脂培養(yǎng)基冷卻至40～50℃，加入1%的菌懸液，搖勻。用無菌鑷子將牛津杯平整放置于培養(yǎng)基上。然后向牛津杯中加入200 μL的質(zhì)量濃度為30 mg/mL的樣品，同時(shí)設(shè)置陽性對照和試劑空白對照。以1 mg/mL硫酸鏈霉素（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌），和0.5mg/mL兩性霉素作為陽性對照，并作各溶劑的空白對照。每個樣品設(shè)置3個平行對照。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌于37℃培養(yǎng)18～24 h，酵母菌于30℃條件下培養(yǎng)24～28 h。觀察菌種生長情況，測量抑菌圈直徑。

1.3.4 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

采用MTT法[11]檢測30種脂溶性化合物對人正常肝細(xì)胞（LO2）和腫瘤細(xì)胞（HepG2）增殖的抑制作用。將人體正常肝細(xì)胞（LO2）和人體腫瘤細(xì)胞（HepG2）制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞終濃度至5×104CFU/mL，然后以每孔100 μL的量接種至96孔板，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞完全貼壁后，檢測不同脂溶性化合物對細(xì)胞活性的影響。給藥組為濃度50 μg/mL的提取物樣品，每孔加入100 μL的樣品，每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔。以抗癌藥物紫杉醇作為陽性對照測定癌細(xì)胞系的敏感性。同時(shí)，設(shè)置溶劑對照組和空白組（培養(yǎng)基）。將板置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培育24 h后，每孔加20 μL 5 mg/mL的MTT，孵育4 h后，棄去培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在多功能酶標(biāo)儀OD490nm處測量各孔的吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率按如下公式計(jì)算：

式中：A0為空白組吸光度值；A1為試驗(yàn)組吸光值；A2為溶劑對照組吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地腌漬蘿卜化學(xué)成分差異性分析

為比較不同產(chǎn)地腌漬蘿卜的化學(xué)成分差異，選取了蘇州、永新、樂清、漳浦及潮汕蘿卜干，對其甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚提取物進(jìn)行HPLC分析，其色譜圖分別見圖1～圖5。由圖1～圖5可知，腌漬蘿卜的甲醇、乙醇提取物色譜峰個數(shù)較少，提取效果較差。不同極性溶劑對腌漬蘿卜的萃取效果不同，萃取效果由高到低依次為乙酸乙酯相＞丙酮相＞乙醚相＞乙醇相＞甲醇相。從乙酸乙酯提取效果來看，不同產(chǎn)地的腌漬蘿卜的色譜峰的出峰時(shí)間，峰面積存在較大差異，故不同產(chǎn)地的腌漬蘿卜化學(xué)成分不同。潮汕蘿卜干與漳浦蘿卜干的化學(xué)成分最為接近，可能是由于潮汕與漳浦地理位置接近，原材料品種相似度高，受閩南飲食文化影響以及加工工藝相似。

圖1 新鮮白蘿卜和不同產(chǎn)地腌漬蘿卜甲醇提取物高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of methanol extract of fresh white radish and preserved radish from different regions

圖2 新鮮白蘿卜和不同產(chǎn)地腌漬蘿卜乙醇提取物高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of ethanol extract of fresh white radish and preserved radish from different regions

圖3 新鮮白蘿卜和不同產(chǎn)地腌漬蘿卜丙酮提取物高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of acetone extract of fresh white radish and preserved radish from different regions

圖4 新鮮白蘿卜和不同產(chǎn)地腌漬蘿卜乙酸乙酯提取物高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of ethyl acetate extract of fresh white radish and preserved radish from different regions

圖5 新鮮白蘿卜和不同產(chǎn)地腌漬蘿卜乙醚提取物高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of ether extract of fresh white radish and preserved radish from different regions

2.2 不同腌漬蘿卜提取物的抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用牛津杯法對不同產(chǎn)地的腌漬蘿卜干不同溶劑30個提取物進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表1。由表1可知，30個提取物中有6個提取物對釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有抑制效果，抑菌圈直徑9.11～13.63 mm，16個提取物對大腸桿菌（Escherichia coli）有抑制效果，抑菌圈直徑10.84～31.92 mm，24個提取物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有抑制效果，抑菌圈直徑11.11～32.23 mm。潮汕蘿卜干的丙酮、乙酸乙酯提取物對釀酒酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（12.50±0.14）mm、（29.77±0.07）mm、（29.00±0.07）mm；（13.63±0.34）mm、（31.92±0.33）mm、（32.23±0.08）mm。漳浦蘿卜干的丙酮、乙酸乙酯提取物對釀酒酵母、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為（9.11±0.21）mm、（23.95±0.04）mm、（25.34±0.22）mm；（13.63±0.34）mm、（31.92±0.33）mm、（32.23±0.08）mm。潮汕和漳浦蘿卜干的丙酮、乙酸乙酯提取物對釀酒酵母抑制作用較弱；而對大腸桿菌，金黃色葡萄球菌抑制作用較強(qiáng)，并且二者對3種指示菌抑菌效果相當(dāng)。這可能是由于兩地原材料和腌漬工藝較為接近，提取物的抑菌活性成分較為接近。結(jié)果表明，甲醇、乙醇、乙醚、丙酮及乙酸乙酯提取物中分別有5種、6種、12種、11種、12種抑菌活性成分，其中乙酸乙酯提取物的抑菌活性最強(qiáng)。

表1 不同產(chǎn)地腌漬蘿卜提取物抑菌結(jié)果Table 1 Antimicrobial activity of extracts of preserved radish from different regions

2.3 提取物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果

選取正常人類肝細(xì)胞LO2和肝癌細(xì)胞HepG2作為供試細(xì)胞，采用MTT法測試30種腌漬蘿卜提取物的細(xì)胞毒性，結(jié)果見表2。

表2 腌漬蘿卜提取物對LO2和HepG2細(xì)胞的抑制率Table 2 Inhibition rates of preserved radish extracts on LO2 and HepG2 cell

由表2可知，當(dāng)永新、樂清蘿卜干的甲醇提取物，蘇州、樂清、潮汕蘿卜干的乙醇提取物，永新、樂清、潮汕蘿卜干的乙酸乙酯提取物，蘇州、永新、樂清蘿卜干的丙酮提取物質(zhì)量濃度為50μg/mL時(shí)，對正常肝細(xì)胞LO2無細(xì)胞毒作用，對腫瘤細(xì)胞HepG2的抑制率為22.60%～63.63%。因此，體外實(shí)驗(yàn)表明部分腌漬蘿卜提取物中可能存在抗癌活性成分。目前很多研究表明蘿卜中的抗癌活性成分主要為異硫氰酸鹽（isothiocyanate，ITCs）[17-19]，其中的蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）和異硫氰酸酯（4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate，4-MTBI）抗癌活性較強(qiáng)。SFN通過阻斷phaseⅠ和phaseⅡ酶和抑制DNA突變等前期調(diào)控，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，阻止癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[20]。BEEVI S S等[21]研究表明，蘿卜的正己烷提取物4-MTBI通過調(diào)節(jié)凋亡通路相關(guān)基因Bcl2來抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。蘿卜硫素和異硫氰酸酯的含量隨著腌漬的時(shí)間、蘿卜的品種、加工方式不同發(fā)生改變[3]。部分腌漬蘿卜提取物對HepG2細(xì)胞沒有抑制作用，原因可能是部分提取物中具有細(xì)胞毒性的成分含量相對較低，PAPI A等[22-23]報(bào)道了日本蘿卜芽提取物的使用劑量與人體結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖抑制率有關(guān)。蘿卜提取物抑制癌細(xì)胞的生長能力與細(xì)胞類型有關(guān)[24]。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過對比不同產(chǎn)地腌漬蘿卜的化學(xué)成分差異，抑菌活性和細(xì)胞毒性發(fā)現(xiàn)：不同極性溶劑對腌漬蘿卜的萃取效果不同，甲醇、乙醇、乙醚、丙酮及乙酸乙酯提取物中分別有5種、6種、12種、11種、12種抑菌活性成分，其中乙酸乙酯提取物的抑菌活性最強(qiáng)。大部分提取物對釀酒酵母沒有抑菌作用，而對腸道致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)抑制效果。在提取物的質(zhì)量濃度為50 μg/mL的條件下，22種提取物對LO2細(xì)胞無毒，對HepG2細(xì)胞的抑制率為22.60%～63.63%，表明腌漬蘿卜提取物中可能存在抗癌活性成分。

綜上所述，不同產(chǎn)地的腌漬蘿卜化學(xué)成分存在較大差異，且具有抗菌、抗癌活性作用，為天然抑菌藥物和抗癌藥物的開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。本研究僅對不同產(chǎn)地腌漬蘿卜的化學(xué)成分、抑菌活性、細(xì)胞毒性進(jìn)行了初步的探究，其脂溶性化合物中的抑菌、抗癌活性物質(zhì)進(jìn)行分離、純化和鑒定有待進(jìn)一步的研究。