不同菌種菊苣根發(fā)酵提取物的揮發(fā)性成分分析及應(yīng)用

常 健，徐世濤，黃 靜，劉勁云，王夸平，徐重軍，陳 媛，王乃定，段焰青，李源棟，楊培香*

（1.云南中煙新材料科技有限公司，云南 昆明 650106；2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650202）

菊苣（Cichorium intybus L.）是一種灌木叢生的多年生草本植物，根肉質(zhì)、短粗[1]，產(chǎn)于東北、西北、華北、山東、山西等地[2]。菊苣為藥食兩用植物，菊苣葉可調(diào)制生菜，根含菊糖及芳香族物質(zhì)，具有清熱解毒、降壓利尿[3]、健胃[4]、保肝作用[5]，同時(shí)還具有增強(qiáng)免疫能力、抗炎、降低膽固醇和血糖等功效[6-7]，目前被廣泛用于咖啡、飲料、茶、保健品、食品、中藥中。烘烤后的菊苣提取物具有類似可可或咖啡的焦香味，主要來(lái)源于菊苣干片經(jīng)焙炒后發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的香味物質(zhì)[8]，用于煙草加香中可改善刺激，增強(qiáng)勁頭。菊苣提取物已成為煙草工業(yè)的重要香料之一，其主要含有三萜、倍半萜、有機(jī)酸等成分[9]，何軼等[10]對(duì)菊苣根的非揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，鑒定出乙酸降香萜烯醇酯、蒲公英萜酮等12種化學(xué)成分。但對(duì)菊苣浸膏揮發(fā)性成分方面的研究報(bào)道相對(duì)較少；梁宇等[11]采用固相微萃取/氣相色譜-質(zhì)譜（solid-phase microextraction/gas chromatograph-mass spectrometer，SPME/GC-MS）聯(lián)用技術(shù)對(duì)菊苣浸膏揮發(fā)性成分進(jìn)行鑒定，共鑒定出38種化學(xué)成分；周靜媛等[12]對(duì)云南祿勸、石林以及青海西寧三個(gè)不同產(chǎn)地栽培的菊苣進(jìn)行揮發(fā)性成分分析對(duì)比，分別鑒定出29種、35種、26種化學(xué)成分。利用不同的菌種對(duì)菊苣根進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)其發(fā)酵提取物揮發(fā)性成分進(jìn)行分析和對(duì)比評(píng)吸，國(guó)內(nèi)還未見報(bào)道。

由于所提及的菊苣根發(fā)酵提取物主要應(yīng)用于卷煙加香，菌株的選擇無(wú)先例可參考，擬選取在煙葉發(fā)酵過程中，能夠使煙葉的青雜氣、刺激性、香氣質(zhì)量等得到顯著改善的菌株來(lái)對(duì)菊苣根進(jìn)行發(fā)酵，段焰青等[13]從煙葉中分離出長(zhǎng)孢諾德酵母菌（Lodderomyceselongisporus）并制成菌劑，噴灑于煙絲上進(jìn)行發(fā)酵，有效的提高烤煙品質(zhì)和增加煙葉香氣，煙葉評(píng)吸品質(zhì)得到明顯提升；黃靜文等[14]從煙葉表面分離出短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）制得菌劑，噴灑于煙絲上進(jìn)行發(fā)酵，煙葉的化學(xué)成分及比值更加協(xié)調(diào)，煙葉香氣質(zhì)改善，香氣量增加，煙葉內(nèi)固有的雜氣和刺激性減輕。因此，分別利用短小芽孢桿菌和酵母菌發(fā)酵微波預(yù)處理后的菊苣根提取物進(jìn)行揮發(fā)性成分分析對(duì)比，并通過卷煙加香實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)，探索不同菌種發(fā)酵菊苣提取物揮發(fā)性成分差異及對(duì)提高卷煙吸食品質(zhì)的作用，為進(jìn)一步開發(fā)菊苣根的香料價(jià)值提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菊苣根：云南石林基地；短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、長(zhǎng)孢洛德酵母（Lodderomyces elongisporus）：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（保藏號(hào)分別為CGMCCNO.3411、CGMCCNO.6645）；二氯甲烷、甲醇、正己烷（均為優(yōu)級(jí)純）、無(wú)水硫酸鈉（分析純）：百靈威科技有限公司提供；正構(gòu)烷烴C7-C30：美國(guó)Sigma-Aidrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；BUCHIR-215型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；WF20B型粉碎機(jī)：上海比朗制造有限公司；1 000 mL同時(shí)蒸餾萃取裝置：上海銀澤儀器設(shè)備有限公司；Milli-Q型超純水機(jī)：美國(guó)Millipore公司；MS204S萬(wàn)分之一電子天平：瑞士Mettler Tloede公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理方法

（1）菊苣根微波預(yù)處理

稱取一定量的菊苣根，利用微波烘烤技術(shù)進(jìn)行微波烘烤，微波功率45 kW，磁控管40根，出口溫度控制在110～120℃之間，烘烤時(shí)間6 min。

（2）長(zhǎng)孢諾德酵母菌發(fā)酵菊苣根提取物的制備

取長(zhǎng)孢諾德酵母菌CGMCCNO.6645活化培養(yǎng)，得到酵母菌活化菌液；菌種活化培養(yǎng)條件為28℃、160r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為28 h；將菊苣根粉碎后，添加15倍的水，滅菌制成待發(fā)酵樣品；將上述活化好的菌液接種于待發(fā)酵樣品中，菌株接種量為2%，發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速160 r/min，發(fā)酵溫度28℃，發(fā)酵時(shí)間36 h；發(fā)酵液經(jīng)過濾、6 000 r/min離心后，取上清液。

（3）短小芽孢桿菌發(fā)酵菊苣根提取物的制備

取短小芽胞桿菌CGMCCNO.3411活化培養(yǎng)，得到短小芽孢桿菌活化菌液；菌種活化培養(yǎng)條件為37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為16 h；將菊苣根粉碎后，添加15倍的水，滅菌制成待發(fā)酵樣品；將活化好的菌液接種于待發(fā)酵樣品中，菌株接種量為2.0%，發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速150 r/min，發(fā)酵溫度37℃，發(fā)酵時(shí)間16 h；發(fā)酵液經(jīng)過濾、6 000 r/min離心后，取上清液。

（4）揮發(fā)性香味成分的提取

稱取500 mL發(fā)酵上清液，倒入同時(shí)蒸餾萃取裝置（simultaneous distillation extraction，SDE）左側(cè)圓底燒瓶中，右側(cè)燒瓶中加入100 mL二氯甲烷，向兩個(gè)燒瓶中加入少許沸石，左側(cè)燒瓶用電熱套加熱，右側(cè)燒瓶60℃水浴加熱，同時(shí)蒸餾萃取3 h。收集二氯甲烷溶液，加入15 g無(wú)水硫酸鈉干燥12 h，除去水分，過濾，濾液減壓濃縮至1 mL。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)部分

（1）色譜條件

RXi-5sil MS石英毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣（純度為99.999%），流速：1.0mL/min。升溫程序：初始溫度60℃，保持6 min；以3℃/min的速率升溫至180℃；再以10℃/min的速率升溫至230℃，保持10 min。進(jìn)樣口溫度：250 ℃，進(jìn)樣量：1.0 μL，分流比：10∶1，溶劑延遲6 min。

（2）質(zhì)譜條件

離子源：電子電離（electron ionization，EI）源；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：280℃；掃描范圍（m/z）：40～450，質(zhì)譜檢索圖庫(kù)：Nist11譜庫(kù)。

（3）定性方法

采用GC-MS測(cè)定酵母菌發(fā)酵菊苣根后提取物和短小芽孢桿菌發(fā)酵后提取物的揮發(fā)性化學(xué)成分，通過Nist11圖庫(kù)進(jìn)行檢索確定其組分。

（4）感官評(píng)價(jià)

兩種菌種菊苣根發(fā)酵提取物添加到卷煙中后的感官評(píng)價(jià)及定性按照GB 5606.4—2005《卷煙第4部分：感官技術(shù)要求》規(guī)定的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 成分分析與鑒定

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定兩種發(fā)酵菊苣根提取物的揮發(fā)性成分，長(zhǎng)孢諾德酵母菌發(fā)酵菊苣根提取物的揮發(fā)性成分質(zhì)譜見圖1，短小芽孢桿菌發(fā)酵菊苣根提取物的揮發(fā)性成分質(zhì)譜見圖2，通過譜庫(kù)檢索并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖和有關(guān)文獻(xiàn)確定各組分，結(jié)合色譜峰面積歸一化法定量計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量，并對(duì)各成分氣味特征進(jìn)行描述[15，18]，具體結(jié)果見表1。

由表1可知，A提取物的揮發(fā)性成分主要包括有機(jī)酸類10種、醛類9種、酯類4種、醇類4種、吡啶類3種、酚類3種、吡嗪2種、酮類2種、烯烴類2種、吡咯類1種；B提取物的揮發(fā)性成分包括有機(jī)酸類7種、醛類7種、醇類3種、吡嗪類3種、酚類3種、酮類3種、酯類2種、吲哚1種、吡咯1種、吡啶1種。

圖1 長(zhǎng)孢諾德酵母菌發(fā)酵菊苣根揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of volatile components of chicory roots fermented by Lodderomyces elongisporus

圖2 短小芽孢桿菌發(fā)酵菊苣根揮發(fā)性成分的總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of volatile components of chicory roots fermented by Bacillus pumilus

表1 不同菌種發(fā)酵菊苣根的揮發(fā)性成分及相對(duì)含量Table 1 Volatile flavor components and relative contents of chicory roots fermented by different strains

續(xù)表

兩種菌種發(fā)酵菊苣根中共分析鑒定出44種揮發(fā)性成分，其中A提取物的揮發(fā)性成分40種，B提取物的揮發(fā)性成分31種，二者相同成分27種。A和B中相同的化學(xué)成分有糠醛、糠醇、2-乙?；秽?-甲基糠醛、γ-壬內(nèi)酯、2-乙?；量?、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、丁香酚、香蘭素等。只存在于A中的揮發(fā)性成分有13種，分別是吡嗪、苯乙烯、2-乙?；拎?、壬醛、庚酸、異戊稀酸乙酯、喹啉、γ-壬內(nèi)酯、（Z）-β-檀香醇、石竹烯氧化物、十五酸、亞油酸甲酯、油酸。B中獨(dú)有的成分4種，分別是2,6-二甲基吡嗪、γ-己內(nèi)酯、2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、吲哚。兩種發(fā)酵液中主要成分及含量比較見圖3。

由圖3可知，A中相對(duì)含量較高的成分依次為棕櫚酸（21.65%）、糠醛（18.05%）、亞油酸（6.27%）、3-甲基戊酸（4.96%）、2-乙?；秽?.62%）、己酸（4.44%）、2-乙?；量?.38%）；B中相對(duì)含量較高的成分依次為糠醛（20.36%）、棕櫚酸（16.26%）、3-甲基戊酸（5.25%）、2-乙酰基呋喃（5.18%）、2-乙?；量?.96%）、己酸（4.86%）、亞油酸（3.44%）。

圖3 長(zhǎng)孢諾德酵母（A）和短小芽孢桿菌（B）發(fā)酵菊苣根主要揮發(fā)性成分的比較Fig.3 Comparison of main volatile compositions in chicory roots fermented Lodderomyces elongisporus(A)and Bacillus pumilus(A)

棕櫚酸具有調(diào)節(jié)煙草酸堿度，增加煙氣濃度、甜味、蠟味和豐滿度的功效，并間接影響煙草香氣，在煙氣中起到平衡作用[15]，但如果含量過高，會(huì)帶來(lái)粗糙感和刺激性[16]；亞油酸會(huì)增加煙氣的刺激性、粗糙感和蠟質(zhì)感，對(duì)煙質(zhì)不利[15]；棕櫚酸和亞油酸在A和B中的相對(duì)總含量為27.92%和19.70%，二者含量越高，煙氣的粗糙感和刺激性也越大[11]。

糠醛具有似面包、焦糖、谷物烘烤氣息、果香，可賦予卷煙烘烤香、果香、甜香[15]，可使卷煙香氣質(zhì)細(xì)膩飄逸、煙氣透發(fā)性好、煙氣較飽滿，以及帶來(lái)一定的焦甜香和厚實(shí)留長(zhǎng)感[17]；3-甲基戊酸是東方型卷煙中獨(dú)有成分，可賦予卷煙甜感、乳酪、水果香氣[18]；2-乙?；秽哂胁荼镜男料鉡19]，應(yīng)用于卷煙中，可增加焙烤香風(fēng)味，改善煙氣細(xì)味[18]；己酸可增加卷煙的甜味、蠟味，使煙氣豐滿醇和[15]；2-乙?；量┚哂性黾訜煔鉂舛?，賦予煙草甜感，使煙草平和的作用[18]，是對(duì)卷煙香氣有重要作用的吡咯類成分之一。以上幾種成分的含量皆是B＞A，由圖可知，7種主要揮發(fā)性成分分別占總量的63.37%、60.31%。這7種成分是構(gòu)成發(fā)酵菊苣根香氣的基礎(chǔ)成分。此外，存在于A和B中的一些化學(xué)成分，雖然含量不高，但對(duì)卷煙煙氣和吃味有重要作用，其中，有14種成分在A、B中含量無(wú)明顯變化，分別是2-甲基四氫呋喃-3-酮、糠醇、2-環(huán)戊烯-1，4-二酮、5-甲基糠醛、三甲基吡嗪、2-吡咯甲醛、苯甲醇、苯乙醛、鄰甲氧基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、丁香酚、十五酸、硬脂酸、棕櫚酸甲酯。有3種成分在B中明顯大于A，分別是二甲基丁酸（0.62%）、苯乙醇（0.46%）、香蘭素（0.24%）。2-甲基丁酸可以增進(jìn)水果、酒香和乳脂香味，使煙氣柔和滋潤(rùn)，改善辛辣刺激；苯乙醇通常用于增加卷煙香味的圓潤(rùn)和醇吸味[18]；香蘭素則是一種與煙香味非常協(xié)調(diào)，賦予煙氣豐滿柔和的煙香風(fēng)味，也可以用來(lái)修飾可可、堅(jiān)果、脂香等香韻[15]。同時(shí)僅存在于B中的4種成分也是重要的致香物質(zhì)：2,6-二甲基吡嗪具有明顯的焦香或烤堅(jiān)果香味，風(fēng)味閾值極低[20]，可賦予煙草濃郁的烤香，對(duì)增強(qiáng)和改進(jìn)煙草香味有明顯作用[15]；γ-己內(nèi)酯賦予煙草果香、豆香、奶香和糖蜜香，與煙香協(xié)調(diào)；2-乙基-3,5-二甲基吡嗪有濃郁的可可香味，可賦予煙草烤香，豐富煙草香氣；吲哚微量時(shí)有茉莉香，持久，用于煙用香精中，與煙香協(xié)調(diào)[18]。

綜上，B中的揮發(fā)性成分雖然種類較少，但是構(gòu)成發(fā)酵菊苣根中的基礎(chǔ)性成分中主要致香成分含量較高，且對(duì)煙草吸味呈副作用的成分含量較少。

2.2 卷煙加香實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

不同添加量的兩種菌種菊苣根發(fā)酵提取物添加到卷煙中后的感官評(píng)價(jià)及定性描述[21]，結(jié)果見表2和表3。

表2 卷煙感官質(zhì)量評(píng)吸結(jié)果Table 2 Results of smoking sensory quality of cigarette

表3 卷煙感官評(píng)吸結(jié)果描述Table 3 Description of smoking sensory quality of cigarette

感官評(píng)吸結(jié)果表明，兩種菌種發(fā)酵菊苣根提取物添加到卷煙中后抽吸品質(zhì)均有所改善，具有掩蓋雜氣，純凈余味的作用，并使香氣豐富飽滿，烤甜香明顯，煙氣柔和透發(fā)，總體表現(xiàn)B＞A，添加比例以0.05%最佳。

3 結(jié)論

采用SDE/GC-MS法對(duì)菊苣根長(zhǎng)孢諾德酵母菌發(fā)酵提取物（A）和菊苣根短小芽孢桿菌發(fā)酵提取物（B）的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，并使用峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對(duì)百分含量，結(jié)果表明，兩種菌種發(fā)酵菊苣根中共分析鑒定出41種揮發(fā)性成分，其中A提取物的揮發(fā)性成分40種，B提取物的揮發(fā)性成分31種，二者相同成分27種，分別是糠醛、糠醇、2-乙?；秽?-甲基糠醛、γ-壬內(nèi)酯等。A中獨(dú)有的成分為13種，B中獨(dú)有的成分為4種。

研究結(jié)果表明，兩種菌種發(fā)酵菊苣根提取物中均含有大量的棕櫚酸、糠醛、亞油酸、3-甲基戊酸、2-乙?；秽⒓核?、2-乙?；量┑葥]發(fā)性成分，這7種成分既是構(gòu)成發(fā)酵菊苣根香氣的基礎(chǔ)成分，也是卷煙中重要的香氣成分，其有機(jī)結(jié)合形成了發(fā)酵菊苣根的特征烤香、焦甜香味。卷煙加香試驗(yàn)結(jié)果表明，菊苣根發(fā)酵提取物添加到卷煙中，具有掩蓋雜氣，純凈余味的作用，并使卷煙香氣豐富飽滿，烤甜香明顯，煙氣柔和，總體表現(xiàn)B優(yōu)于A，添加比例以0.05%最佳。