茶白星病不同病情等級(jí)下葉際細(xì)菌群落多樣性與功能預(yù)測(cè)

周凌云，向 芬，劉紅艷，李 維，周 琳，銀 霞，曾澤萱，王振中

（1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

茶白星病屬于高海拔茶區(qū)常發(fā)葉部病害之一。該病一般在春茶萌芽初始發(fā)生，最初在茶園的嫩芽及嫩葉上出現(xiàn)針頭大褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大成直徑0.3～2.0 mm的圓形病斑。整個(gè)茶園葉片上布滿紅褐色圓形斑點(diǎn)，病斑后期直徑最大至2.0 mm、病緣紫黑色、中央灰白色形似鳥眼狀。茶白星病發(fā)病高峰期與春茶采摘期基本一致，而且春季相對(duì)降雨量較大，不利于茶白星病的化學(xué)防控[1]。病害發(fā)生與環(huán)境、寄主關(guān)系密切，高海拔茶區(qū)的葉際微生物環(huán)境是病害發(fā)生的重要影響因素，茶白星病的發(fā)生程度與環(huán)境各項(xiàng)因子均有相關(guān)性[2-3]。在微觀茶葉表面往往有茶葉自身分泌的兒茶酚等對(duì)多種病原菌有抑制作用的物質(zhì)，抑制真菌孢子萌發(fā)，甚至導(dǎo)致孢子破裂[4]。

葉際作為茶樹主要微生物棲息地，葉際微生物之間的互作影響植株的健康與生長(zhǎng)，以及農(nóng)作物的產(chǎn)量[5-6]。目前葉際群落的研究主要集中在可培養(yǎng)的物種或者病原菌以及與植物寄主互作相關(guān)的有益微生物上[7-8]。然而，目前自然環(huán)境中只有少數(shù)微生物可以被人工培養(yǎng)。由于高通量測(cè)序技術(shù)不再局限于可培養(yǎng)微生物的研究，因此近年來高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展促進(jìn)了擬南芥[9]、水稻[10]和菠菜[11-12]等作物葉際微生物組成和結(jié)構(gòu)的深入研究。尤其在環(huán)境[13-15]、基因型[16]、海拔[17]、季節(jié)[18]等生物和非生物因素共同調(diào)控植物葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)。茶葉根際土壤微生物通過16 SrRNA、PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE），明確其最大影響因子為土壤PH值[19]與液體[20]。在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中很少有運(yùn)用高通量測(cè)序技術(shù)研究作物—葉際生物—病原菌相互作用的報(bào)導(dǎo)，目前開始逐漸應(yīng)用這種高通量測(cè)序測(cè)定的微生物群落來分析生物脅迫情況[6]，如測(cè)序顯示南瓜白粉病菌改變了南瓜葉際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，影響細(xì)菌群落多樣性[21]。

本文通過Miseq 2×3006p宏基因組測(cè)序平臺(tái)擴(kuò)增3個(gè)茶白星病病情等級(jí)下細(xì)菌的V3～V4區(qū)，全面評(píng)估茶白星病引致的葉際細(xì)菌群落多樣性及類群組成，篩選出與茶白星病發(fā)生相關(guān)的細(xì)菌，比較分析葉際微生物和病原菌的相互作用，以期為茶白星病的生物防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和采樣地點(diǎn)

供試樣品采自湖南石門縣東山峰茶葉基地的福鼎大白茶，采集時(shí)間為2018年4月25日下午，正值茶白星病田間發(fā)生病情上升期間。試驗(yàn)根據(jù)茶白星病斑面積占整個(gè)葉面積比例設(shè)為3個(gè)處理，每個(gè)處理分別對(duì)應(yīng)一個(gè)病情等級(jí)。BCK：無病斑（空白對(duì)照）；B2：2級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的11%～50%；B4：4級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的80%以上。根據(jù)發(fā)病程度各采集3張葉片。

1.2 DNA提取、擴(kuò)增和測(cè)序

稱取6 g葉片于100 mL的磷酸緩沖溶液（pH7.0，0.1 mol/L）中，再加入100 uL吐溫80。超聲波震蕩8 min后在25℃條件下以200 r/min的轉(zhuǎn)速在搖床中震蕩30 min，接著用超聲波震蕩2 min。使用0.45 μm濾膜收集細(xì)菌，采取液氮研磨的方法將樣品磨成粉末狀，應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根）抽提DNA。以此DNA為模板，并應(yīng)用16SrRNA基因的通用341F引物CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG及805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCAC CCGAGAATTCCA[22]對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μLPCR反應(yīng)體系：5 μL10×PCRbuffer（ 含20 mMMgC12），1.5 μLdNTP（10 mM），1 UTaqDNA聚合酶，1 uLDNA模板，加滅菌ddH2O補(bǔ)至50 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性20 s，56℃退火25 s，72℃延伸40 s；循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用l.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，純化后送公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3 序列數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

首先使用FastQC評(píng)估原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量指標(biāo)，去除未識(shí)別堿基和低質(zhì)量序列。計(jì)算DNA矩陣，調(diào)用UPARSE程序，在最佳的similarity值下對(duì)序列進(jìn)行 OTU （Operational Taxonomic Units）分類單元?jiǎng)澐?。?yīng)用VENN圖可以用來統(tǒng)計(jì)樣本中共有的和獨(dú)有的OTU數(shù)目，再使用非加權(quán)組平均法UPGMA （Unweighted pair group method with arithmetic mean） 算法構(gòu)建樹狀結(jié)構(gòu)，同時(shí)基于各樣本物種豐度通過Bray-Curtis算法構(gòu)建的樣本聚類樹與物種豐度柱狀圖結(jié)合起來，RDP-Classifer軟件分析設(shè)置置信度參數(shù)為50%。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，計(jì)算不同分類等級(jí)上的OTU的數(shù)量和Chaol，繪制稀釋曲線。使用去趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析（Detrended Correspondence Analsis，DCA）以及非參數(shù)檢驗(yàn)方法Adonis來分析不同等級(jí)之間的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。并基于PICRUSt功能二級(jí)分類結(jié)果，比較樣本或組間豐度差異，找出樣本豐度存在差異的功能分類，默認(rèn)篩選條件為P≤0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉葉際細(xì)菌群落基本組成和結(jié)構(gòu)

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過處理后共獲得111335條高質(zhì)量序列片段，平均為37112條，見表1；在97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，見圖1。其中檢測(cè)到1925個(gè)OTUs，隨著病情等級(jí)提高，OTU的相對(duì)豐度與病情等級(jí)呈正相關(guān)。BCK、B2和B4中特異OTU分別占33.75%、53.32%和59.29%，所有的樣品中共檢測(cè)到166個(gè)重合OTUs，占所有樣品OTU總數(shù)的8.62%；BCK、B2和B4中獨(dú)有OTU分別占14.95%、20.20%和27.21%（圖2）。在所有樣品中共鑒定到細(xì)菌36個(gè)門、56個(gè)綱、81個(gè)目和175個(gè)科、438個(gè)屬。在門的水平上，占優(yōu)勢(shì)的門到屬依次為Proteobacteria（變形菌門）、Alphaproteobacteria（變形菌綱）、Sphingomonadales （鞘脂單胞菌目）、Sphingomonadaceae（鞘脂單胞菌科）和Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬），分別占OTUs的 83.09%、53.96%、31.13%、31.62% 和30.62%（圖1）。通過計(jì)算不同分類水平上鑒定出來的種系型，不同發(fā)病程度的細(xì)菌種類主要分布在Proteobacteria （變形菌門），優(yōu)勢(shì)綱則為 Alphaproteobacteria與 Betaproteobacteria（B-變形菌）。在屬的水平上，它們?cè)诓煌牟∏榈燃?jí)上具有不同的相對(duì)豐度，表生細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌為Sphingomonas（鞘脂單胞菌屬）與Ralstonia（雷氏菌屬）。

2.2 發(fā)病程度對(duì)葉片細(xì)菌的影響

本研究對(duì)比了3種不同病情等級(jí)下細(xì)菌群落組成的差異。運(yùn)用Beta多樣性指標(biāo)來比較多組樣品之間的差異，結(jié)果表明，細(xì)菌群落在3個(gè)不同病情等級(jí)上具有差異。雖然隨著發(fā)病病情指數(shù)增加而增加，葉際細(xì)菌豐度逐漸增加，說明病情越重，獨(dú)特的OTU含量最高，群落結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，健康葉片的OTU特異性最低，群落結(jié)構(gòu)相對(duì)單一。圖4分析顯示相對(duì)含量最多的三個(gè)屬Sphingomonas、Ralstonia與Stenotrophomonas，在B2與B4中菌類逐漸減少，而增幅明顯的兩種菌則為Methylobacterium與Hymenobacter，B4菌類最多，其中獨(dú)有的分別有 Ethanoligenens、Taibaiella、Rubinisphaera、Microbacter與Phaselicystis，此結(jié)果與VENN圖2結(jié)果保持一致。

表1 不同病情指數(shù)樣品OTU統(tǒng)計(jì)表Table 1 OTU statistics samples from samples with different severities

表2 樣品OTU基本情況統(tǒng)計(jì)表Table 2 Basic OTU Statistics of Samples

圖1 OTU數(shù)目與聚類similarity值關(guān)系圖Fig.1 Relation between OTU Number and Cluster Similarity Value

圖2 不同病情指數(shù)樣品OTU韋恩圖Fig.2 Venn diagram illustrating the number of OTUs from samples with different severities

圖3 genus水平上所有樣本聚類樹Fig.3 Cluster Tree of All Samples at Genus Level

圖4 genus水平所有樣本群落結(jié)構(gòu)分布Fig.4 Distribution of community structure in all samples at genus level

Alpha 多樣性（Alpha Diversity）所指的是單個(gè)樣品中菌群多樣性的分析，是由樣品中的物種組成的豐富度（Richness）和均勻度（Evenness）這兩個(gè)因素組成，一般以Chao1和Shannon 等指數(shù)來評(píng)估某個(gè)樣本的菌群多樣性，指數(shù)越高，說明樣本的多樣性越復(fù)雜。不同樣本的alpha多樣性分析指數(shù)統(tǒng)計(jì)（表3）結(jié)果顯示細(xì)菌多樣性B4＞BCK＞B2。表明發(fā)病程度的不同能夠影響細(xì)菌的群落組成和結(jié)構(gòu)。

應(yīng)用多樣性距離矩陣歸類分析發(fā)現(xiàn)，茶白星病顯癥的B2、B4的OTU在豐度上聚為一類，而CK單獨(dú)一類（圖3）。在門的水平上研究，Proteobacteria與Firmicutes一直下降，而Bacteroidetes與Acidobacteria則上升；而在屬水平上，Ralstonia與Stenotrophomonas下降，Methylobacterium與Hymenobacter則隨著病情等級(jí)提高而逐漸升高，Methylobacterium在Bck、B2、B4中相對(duì)豐度分別為0.58%、11.40%和15.05%，而Hymenobacter相對(duì)豐度分別為0.54%、6.60%和9.63%（表4）。

2.3 不同病情等級(jí)下細(xì)菌功能預(yù)測(cè)

從16 s測(cè)序獲得的物種構(gòu)成推測(cè)樣本中的功能基因構(gòu)成，通過Bray-Curtis算法構(gòu)建的樣本聚類樹與功能豐度柱狀圖結(jié)合起來，發(fā)現(xiàn)B4與B2相似性較大，其中菌類組成相比對(duì)照依次增加（圖5）。P值檢驗(yàn)的兩兩差異統(tǒng)計(jì)功能預(yù)測(cè)如表5，表明隨著茶白星病病情嚴(yán)重，其中較大功能變化的編碼功能主要為細(xì)胞壁生物發(fā)生、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝、輔酶運(yùn)輸和代謝、碳水化合物的運(yùn)輸和代謝等。但其中在B4功能預(yù)測(cè)中增幅較大的為細(xì)胞活力與次生代謝物的生物合成。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換及細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等 RNA加工和修飾、胞外細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸、防御機(jī)制、運(yùn)輸、分解代謝、翻譯后修飾、輔酶運(yùn)輸、代謝與翻譯及核糖體結(jié)構(gòu)和生物發(fā)生的功能被預(yù)測(cè)，則隨著茶白星病發(fā)病嚴(yán)重而減少。

表3 不同病情等級(jí)樣品的alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)表Table 3 Alpha diversity index statistics from samples with different disease severties

表4 不同病情等級(jí)樣品在門與屬中的相對(duì)豐度表（%）Table 4 Relative abundance tables of samples of different disease grades in phylum and genus（%）

圖5 基于COG的所有樣品聚類樹與柱狀圖組合分析圖Fig.5 Combination analysis of clustering tree and histogram for all samples based on COG

表5 差異比較結(jié)果功能預(yù)測(cè)表Table 5 Functional prediction of difference comparison results

3 結(jié)論與討論

細(xì)菌是地球上豐富且多樣化的物種，目前人們對(duì)茶園根際微生物區(qū)系已有基本的了解。雖然葉際作為植物上主要的細(xì)菌棲息地，為細(xì)菌的定殖提供了良好的生活環(huán)境，在保護(hù)寄主植物免受病原菌侵染方面也具有至關(guān)重要的作用，葉際細(xì)菌正逐漸被人們所關(guān)注，但對(duì)茶樹地上部分微生物區(qū)系的系統(tǒng)研究尚剛起步，有限的研究表明茶園葉面微生物主要是真菌和細(xì)菌。細(xì)菌主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、短桿菌屬（Curtobacterium）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、黃單桿孢菌屬（Xanthomonas）、紅球菌屬（Rhodococcus）、假單孢桿菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavubacteria）、棒狀桿菌屬（Coryhebacterium）、微球菌屬（Microccocus）和紅螺菌屬（Rhodospirillum）等[23]，

本研究運(yùn)用宏基因組細(xì)菌分類測(cè)序?qū)?個(gè)不同病情等級(jí)下的細(xì)菌檢測(cè)，結(jié)果表明Acidobacteria（酸桿菌門）、Bacteroidetes（擬桿菌門）、Proteobacteria（變形菌門）和Firmicutes（厚壁菌門）在3個(gè)病情等級(jí)下均為優(yōu)勢(shì)門類，且均為優(yōu)勢(shì)低溫纖維素降解菌[24-25]。Proteobacteria（變形菌門）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門，占總數(shù)的73.53%～90.25%，也是其他植物葉際優(yōu)勢(shì)的細(xì)菌門類[26-27]。Acidobacteria（酸桿菌門）與Bacteroidetes（擬桿菌門）相對(duì)豐度與多樣性的變化趨勢(shì)一致，呈正相關(guān)。Methylobacterium（甲醇桿菌屬）與Hymenobacter（膜桿菌屬）的相對(duì)豐度與病情指數(shù)正相關(guān)。其中Methylobacterium以甲醇為唯一碳源的菌類，因而具有降乙酰甲胺磷[28]等功效，并對(duì)部分細(xì)菌與真菌具有抗性[29]。而主要來自山地[16]和凍土[17]的Hymenobacter菌類，適應(yīng)相對(duì)低溫環(huán)境，它們可能與致病菌存在協(xié)同作用。而Ralstonia（雷氏菌屬）與Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌）豐度出現(xiàn)下降，Ralstonia與Stenotrophomonas是引起植物青枯與腐爛的病原菌屬[30-31]。茶白星病病情升高，葉際環(huán)境中致病菌的豐度下降的測(cè)定結(jié)果與高海拔茶區(qū)茶白星病嚴(yán)重發(fā)生并抑制其它病害的特點(diǎn)相符。

細(xì)菌中致病菌不僅影響植物健康，也影響植物相關(guān)細(xì)菌的組成和結(jié)構(gòu)。OTU差異分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)不同病情等級(jí)下細(xì)菌群落組成存在差異，表明茶白星病致病菌不僅影響植物健康，也影響茶葉葉際中細(xì)菌的組成和結(jié)構(gòu)。細(xì)菌群落多樣性隨著病情的提高逐漸升高，細(xì)菌之間的互作高度復(fù)雜，單個(gè)病原體或有益細(xì)菌的豐度變化都可能導(dǎo)致整個(gè)細(xì)菌組成的改變，推測(cè)可能因?yàn)椴璋仔遣∈且环N真菌病害，主要抑制真菌群落。通過對(duì)宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)功能比較分析發(fā)現(xiàn)防御機(jī)制著提升，表明細(xì)菌群落在茶白星病發(fā)病進(jìn)程中起一定的效應(yīng)，但具體的反應(yīng)模式還有待進(jìn)一步研究。