基于高通量測(cè)序的不同年齡恒河猴腸道菌群結(jié)構(gòu)差異分析

朱華，肖沖，尚海泉，郭亞茜，杜曉鵬，秦川

(衛(wèi)健委人類(lèi)疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所;北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物(non-human primate，NHP)具有與人接近的基因背景和表型特征，在腦功能、認(rèn)知、神經(jīng)-精神疾病、干細(xì)胞研究和傳染性疾病機(jī)制研究與疫苗研發(fā)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1]。恒河猴(rhesus macaques)是實(shí)驗(yàn)常用的非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，在分類(lèi)上屬于靈長(zhǎng)目，猴科，獼猴屬，主要分布地包括印度、孟加拉、尼泊爾、越南和我國(guó)的西南、華南等地[2-3]。用于構(gòu)建動(dòng)物模型的恒河猴需要有清晰的微生物背景。腸道中大多數(shù)細(xì)菌不能用傳統(tǒng)的選擇性培養(yǎng)方法進(jìn)行分離、鑒定，限制了對(duì)恒河猴腸道微生物變化規(guī)律的研究。高通量測(cè)序技術(shù)一次可以對(duì)幾十萬(wàn)、上百萬(wàn)條DNA分子序列進(jìn)行測(cè)定，使研究者可以對(duì)一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組、基因組、代謝組等進(jìn)行細(xì)致全面的分析，目前已發(fā)展到第三代。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同年齡恒河猴腸道菌群結(jié)構(gòu)和豐度進(jìn)行分析，為醫(yī)學(xué)研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品的收集與處理

50只恒河猴由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所北方資源中心繁殖【SCXK(京)2014-11】，飼養(yǎng)在大群中【SYXY(京)2017-0027】。50只恒河猴隨機(jī)分為兩組，其中，成年組33只(5-10歲)、老年組17只(10歲以上)。每只動(dòng)物的糞便樣品在排泄后20 min內(nèi)完成收集，所有動(dòng)物的樣品采集在1周內(nèi)完成。冰盒保存帶回實(shí)驗(yàn)室后，-80℃冰箱冷凍保存。實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(ZH17004)。

1.2 PCR擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及生物信息學(xué)分析

按參考文獻(xiàn)[4]的方法進(jìn)行基因組DNA提取和PCR擴(kuò)增文庫(kù)構(gòu)建、測(cè)序及生物信息學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果評(píng)估

對(duì)收集到的50個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序共得到4 125 768條原始下機(jī)reads，其中4 011 000條可用于OTU的劃分。比較成年組、老年組原始下機(jī)reads數(shù)、過(guò)濾后得到的高質(zhì)量reads數(shù)、過(guò)濾后得到的高質(zhì)量序列占raw reads比例(effective%)、Clean reads中測(cè)序質(zhì)量值大于20(錯(cuò)誤率小于1%)的堿基數(shù)占總堿基(clean reads)數(shù)的比例，各組間差異無(wú)顯著性(表1)。

2.2 腸道菌群多樣性分析

根據(jù)OTUs代表序列與數(shù)據(jù)庫(kù)注釋文件對(duì)比，在 97%(種)水平上進(jìn)行OTUs 劃分，老年組所獲得的OTUs數(shù)減少，與成年組比較差異有顯著性(P=0.0238)。ACE或Chao1指數(shù)數(shù)值越大表示菌群豐度越高，老年組這兩個(gè)指數(shù)的數(shù)值均降低，與成年組比較差異有顯著性(P=0.0121，P=0.0174)，說(shuō)明隨年齡增長(zhǎng)，恒河猴腸道菌群豐度降低。Shannon指數(shù)越大、Simpson指數(shù)越小表示腸道菌群的多樣性越強(qiáng)，老年組的Shannon指數(shù)數(shù)值升高(P=0.0132)，Simpson指數(shù)數(shù)值降低(P=0.0258)，與成年組比較差異有顯著性。提示恒河猴腸道菌群多樣性隨年齡增長(zhǎng)而增高(表2)。

表1 數(shù)據(jù)過(guò)濾統(tǒng)計(jì)分析表Table 1 Data filtering statistical analysis

表2 成年與老年恒河猴腸道菌群α-多樣性分析指數(shù)比較Table 2 Comparison of the results of α-diversity analysis of intestinal flora of the adult and old groups

注：與成年組比較，*P< 0.05(下表同)。

Note. Compared with the adult group,*P< 0.05.(The same in the following tables)

2.3 腸道菌群構(gòu)成

測(cè)序結(jié)果顯示：恒河猴2個(gè)年齡組的絕大多數(shù)reads主要分屬以下10個(gè)門(mén)：厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)、軟壁體門(mén)(Tenericutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、unidentified_Bacteria、Kiritimatiellaeota、粘膠球形菌門(mén)(Lentisphaerae)、纖維桿菌門(mén)。老年組與成年組比較，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度升高(P=0.0013)，厚壁菌門(mén)、螺旋體門(mén)、疣微菌門(mén)、粘膠球形菌門(mén)相對(duì)豐度降低(P=0.0283，P=0.0002，P=0.0482，P=0.0242)，差異有顯著性(見(jiàn)表3)。

在科水平，老年組與成年組比較，Prevotellaceae相對(duì)豐度升高(P=0.0001)，Ruminococcaceae、Clostridiales、Spirochaetaceae、Christensenellaceae(P=0.0039，P=0.0080，P=0.0002，P=0.0021)相對(duì)豐度降低，差異有顯著性(見(jiàn)表4)。

在屬水平，老年組unidentified_Prevotellaceae相對(duì)豐度升高(P=0.0001)，乳桿菌屬(Lactobacillus)，八迭球菌(Sarcina)，unidentified_Spirochaetaceae相對(duì)豐度降低(P=0.0114，P=0.0227，P=0.0028)，差異有顯著性(見(jiàn)表5)。

表3 腸道菌群在門(mén)水平上的構(gòu)成Table 3 Relative abundance of the intestinal flora at the phylum level

表4 腸道菌群在科水平上的構(gòu)成Table 4 Relative abundance of the intestinal flora at the family level

表5 腸道菌群在屬水平上的構(gòu)成Table 5 Gut microbiota distribution at the genus level

2.4 腸道菌群 LEfSe 分析

LEfSe(LDA effect size)分析的意義是在組間尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)記物，并強(qiáng)調(diào)其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與生物物種的相關(guān)性，用來(lái)識(shí)別組間不同物種豐度的特征及其關(guān)聯(lián)的類(lèi)別。 在成年組，鏈球菌屬(Streptococcus)、布赫納氏菌屬(buchnera)、乳桿菌屬(lactobacillus)是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)記物(圖1)。

圖1 不同年齡組動(dòng)物L(fēng)DA 值分布圖Figure 1 Cladogram of the linear discriminant analysis (LDA) scores of the adult (a) and old groups (b)

2.5 β-多樣性分析

β-多樣性研究是使用 Weighted Unifrac 距離來(lái)衡量組間相異系數(shù)，這個(gè)系數(shù)越小，表示這兩組間在物種多樣性方面存在的差異越小。與成年組比較，老年組的 Weighted Unifrac 距離顯著升高(P=0.003)，表明成年組與老年組在物種多樣性方面存在顯著性差異，差異有顯著性(圖2A)。β-多樣性分析結(jié)果顯示，老年組恒河猴腸道菌群與成年組分布在不同區(qū)域(圖2B)。

2.6 菌群功能預(yù)測(cè)分析

通過(guò)KEGG基因功能富集分析，結(jié)果顯示青年組與老年組優(yōu)勢(shì)基因分區(qū)明顯(圖3A)，青年組優(yōu)勢(shì)基因集中在與代謝相關(guān)的酵解酶、轉(zhuǎn)運(yùn)體、外泌體等(圖3B)。

圖2 成年組(a)與老年組(b)β-多樣性分析Figure 2 β-diversity of the adult (a) and old groups (b)

圖3 成年組(a)與老年組(b)功能基因預(yù)測(cè)Figure 3 Gene function prediction of the adult (a) and old groups(b)

3 討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是醫(yī)學(xué)研究的必要工具，美國(guó)、歐盟和中國(guó)的食品藥品監(jiān)督管理機(jī)構(gòu)都規(guī)定新藥研發(fā)臨床前必須經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其安全性和有效性。高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用以來(lái)，更多的證據(jù)顯示腸道菌群可通過(guò)很多方式影響人體的健康[5-6]。但如何影響？怎樣通過(guò)合理利用動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究？研究者只有在充分了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體腸道菌群的差異后，才有可能進(jìn)行更深入的探討。高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛應(yīng)用以來(lái)，對(duì)于人體菌群的研究計(jì)劃很多：如由美國(guó)NIH發(fā)起的“人類(lèi)微生物組計(jì)劃”，歐盟發(fā)起的“人類(lèi)腸道宏基因組計(jì)劃”等。這些研究投入巨大，成果顯著。相比之下，關(guān)于常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特別是非人靈長(zhǎng)類(lèi)腸道菌群的研究報(bào)道卻很少。

由于宿主自身和外界環(huán)境等因素的影響，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物腸道菌群的結(jié)構(gòu)和豐度存在著種間和種內(nèi)的差異。影響因素主要包括以下4點(diǎn)：宿主種類(lèi)及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[7-9]、食性[10-11]、年齡與性別[12-13]、社會(huì)互動(dòng)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象均為恒河猴，飼喂統(tǒng)一的市售顆粒飼料，生活在同樣的社會(huì)自然環(huán)境下，排除了種屬、飲食、環(huán)境等因素的干擾，主要探討年齡因素對(duì)宿主腸道菌群的影響。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，人體腸道菌群在門(mén)水平主要由厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)和變形菌門(mén)構(gòu)成，但其結(jié)構(gòu)與相對(duì)豐度會(huì)隨年齡增長(zhǎng)而改變，老年人腸道菌群多樣性程度比成年人高，未知菌種所占比例也比較高[16]。2006年，Mueller等[17]學(xué)者發(fā)表了一篇代表性研究成果：通過(guò)對(duì)法國(guó)、德國(guó)、意大利、瑞典四個(gè)歐洲國(guó)家230位健康志愿者的糞便樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這四個(gè)國(guó)家所有參與分析的老年人腸道中腸桿菌含量普遍高，最后結(jié)論是這種菌群結(jié)構(gòu)特征與志愿者所處地理位置無(wú)關(guān)，而主要與年齡相關(guān)。我們的測(cè)序結(jié)果顯示，成年組、老年組恒河猴α-多樣性指數(shù)存在顯著性差異，隨年齡增長(zhǎng)，恒河猴腸道菌群豐度降低，多樣性增加。β-多樣性分析，老年組恒河猴腸道菌群與成年組分布在不同區(qū)域，老年組的 Weighted Unifrac 距離顯著升高(P=0.003)，表明成年組與老年組在物種多樣性方面存在顯著性差異。在豐度排名前10位的菌屬中，未知菌屬占一半，與人的結(jié)果一致。但特征性優(yōu)勢(shì)菌屬與人不同。

非人靈長(zhǎng)類(lèi)腸道菌群主要由來(lái)自12個(gè)門(mén)的細(xì)菌組成的包括擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、 疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、軟壁菌門(mén)(Tenericutes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes)、粘膠球形菌門(mén)(Lentisphaerae)、纖維桿菌門(mén)(Fibrobacteres)、 酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)和浮霉菌門(mén)(Planctomycetes)[2]。其中，擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)在所有非人靈長(zhǎng)類(lèi)腸道菌群中所占比例都很高，并且在多數(shù)非人靈長(zhǎng)類(lèi)中是比例最高的兩個(gè)菌門(mén)。在我們的結(jié)果中，成年組、老年組恒河猴腸道菌群這兩個(gè)門(mén)的比例分別為87.09%和91.94%，與報(bào)道相符[18]。

厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值是微生物發(fā)酵的能量產(chǎn)出指標(biāo)之一[19]，成年組、老年組恒河猴的這個(gè)比值分別為3.3654和1.8994(P=0.012)，差異明顯。在成年組的優(yōu)勢(shì)菌群中，值得關(guān)注度是乳桿菌屬。乳桿菌屬于厚壁菌門(mén)，在人體腸道中也普遍存在，是一種厭氧、無(wú)芽孢、革蘭陽(yáng)性菌，其發(fā)酵碳水化合物的終產(chǎn)物主要是乳酸。乳桿菌可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫球蛋白，增強(qiáng)機(jī)體的后天獲得性免疫力，常被用于益生菌菌種[20]。乳桿菌還可以通過(guò)酸化腸道微生態(tài)環(huán)境阻止某些有害菌與腸粘膜上皮細(xì)胞的黏附，阻礙有害菌在腸道內(nèi)定植，減少疾病的發(fā)生[21]。代謝產(chǎn)物乳酸是可以幫助機(jī)體消化吸收的短鏈脂肪酸。厚壁菌門(mén)/擬桿菌門(mén)比值、優(yōu)勢(shì)菌屬的結(jié)果都與恒河猴成年個(gè)體比老年個(gè)體有更高的營(yíng)養(yǎng)和能量需求的生理特點(diǎn)相符。功能基因的預(yù)測(cè)結(jié)果也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)利用高通量測(cè)序技術(shù)，從比較微生態(tài)學(xué)角度，對(duì)不同年齡恒河猴腸道菌群的結(jié)構(gòu)與豐度進(jìn)行分析，期望能夠?yàn)槟c道微生態(tài)與疾病關(guān)系研究用模型動(dòng)物的選擇與應(yīng)用提供參考。

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