藥物涂層球囊微粒兔腎栓塞風險的探討

宋精忠，龍漢，劉艷芬，王閣奇，江巍，王剛

(先健科技(深圳)有限公司，深圳 518063)

近年來血管腔內介入治療的發(fā)展非常迅速，血管內植介入醫(yī)療器械使用期間微粒脫落引起了科研人員、臨床醫(yī)師和監(jiān)管機構的高度重視，特別是藥物涂層球囊導管這一類產品，對其微粒脫落的風險評估格外重要。微粒的體外研究主要包括理化特性，如尺寸、形態(tài)、溶解性、強度、數量、分布等[1]。一般來說，微粒尺寸越大，風險越高，然而也有文獻介紹大量的小微粒所產生的風險和少量的大微粒的風險一樣[2]?？梢姡w外模擬測試無法直接評估微粒的栓塞風險，微粒在體內的行為結果是一個復雜的過程，必須設計體內方法評估。

Kolodgie等[3]在健康豬體內分別植入IN.PACT與Lutonix 035藥物涂層球囊，解剖靶部位下游遠端肌肉，病理切片觀察是否有缺血導致的組織壞死，比較二者栓塞風險。Babcock等[4]通過介入手術對照不同涂層的球囊導管和裸球囊導管，對目標組織(心肌和下游肌肉)和主要臟器進行組織病理學觀察，未發(fā)現有可見微粒。類似的研究很多，結果大多未發(fā)現有明顯的微粒栓塞。而在臨床實驗和真實病例中，仍然有遠端肌體的梗死或壞疽，這些臨床表現可能與器械微粒有一定的關系。分析原因可能是設計的臨床前動物試驗評估微粒風險的分辨力不足，得到了假陰性的結果。

腎由腎動脈供血，腎動脈是腹主動脈的分支，腎動脈二級支之間不吻合，腎遠端血管無代償，獨立供應一定區(qū)域的腎實質。腎是高灌注器官，對缺血性栓塞較敏感[5]。從腎血管解剖結構分析，如果腎動脈發(fā)生栓塞，則會影響到遠端供血，從而導致整個腎組織壞死；如果腎動脈遠端的側枝(如葉間動脈)發(fā)生閉塞，則會導致腎局部區(qū)域的壞死，因此選擇腎作為本次試驗的主要觀察對象。

本研究通過股動脈入路，將藥物球囊導管輸送至兔腹主動脈，在近心端擴張，將微粒盡可能的引導進入雙腎，在設定的時間點觀察雙腎是否有堵塞、壞死等異常現象。以此評估藥物球囊在動物體內是否有產生栓塞的風險，并探索建立兔腎壞死程度的度量標準，以及閉塞的血管直徑與微粒粒徑的對應關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

21只普通級新西蘭兔，10周齡，體重2.0 ～ 2.5 kg，雌雄不拘，購于南方醫(yī)科大學實驗動物中心【SCXK(粵)2011-0015】。實驗地點為先健科技(深圳)有限公司動物實驗室【SYXK(粵)2016-0153】。實驗方案經先健科技(深圳)有限公司實驗動物管理和使用委員會IACUC的倫理審查及審批【TP082-002】。

1.1.2 實驗試劑

戊巴比妥鈉(美國Sigma)；甲基丙基酸甲酯(天津大茂)；過氧化苯甲酰(天津大茂)；甲醛(西隴化工)；二甲苯(天津大茂)；伊紅(碧云天)；蘇木素(碧云天)；氨芐西林鈉(哈藥集團獸藥廠)；無水乙醇(安徽安特)。

1.1.3 實驗儀器

自動組織處理脫水機(Leica ASP200S，德國)；自動染色機(Leica ST5020，德國)；包埋機(Leica EG1150C德國)；攤片機(Leica HI1210，德國)；石蠟切片機(Leica RM2235，德國)；顯微測量系統(Leica DM2500，德國)；數字病理切片掃描儀(Pannoramic SCAN，匈牙利)。

1.1.4 實驗樣品及分組

試驗樣品為自制冠脈藥物球囊及冠脈裸球囊，規(guī)格分別為3.0 mm × 40 mm及3.0 mm × 20 mm。實驗動物隨機分組，分組信息如下表1。

表1 實驗分組及動物編號Table 1 Grouping and number of animals in this experiment

1.2 方法

1.2.1 手術方法

實驗動物固定，經兔耳緣靜脈推注3%戊巴比妥鈉(1 mL/kg)麻醉，腹股溝區(qū)域備皮消毒，切開皮膚逐層分離，分別暴露雙側股動脈，穿刺后置入導絲。沿一側導絲輸送裸球囊(封堵用球囊)至腹主動脈雙腎的遠心端，沿另一側導絲輸送藥物球囊(試驗用球囊)至腹主動脈雙腎的近心端，確保腎動脈通暢。

實驗時，先充盈裸球囊，維持充盈壓力，堵住腹主動脈的遠端，然后擴張藥物球囊。藥物球囊反復充盈/泄壓2次，依靠血壓的作用，使過程中產生的微粒盡可能的流入腎。擴張完畢，裸球囊卸壓并撤出體外，藥物球囊隨后撤出。B組三倍劑量實驗，在藥物球囊擴張完成以后，裸球囊泄壓但不撤出，藥物球囊撤出后再植入下一個藥物球囊，直到三個藥物球囊全部植入完畢，裸球囊最后才撤出。D組裸球囊對照試驗，近心端腹主動脈的試驗球囊也使用裸球囊，并反復充盈/泄壓2次。E組空白對照試驗，對兔不做任何處理，正常飼養(yǎng)。

所有器械撤出體外后，結扎穿刺點近端和遠端，縫合創(chuàng)口，待實驗動物自然蘇醒后送回飼養(yǎng)間，每天喂食抗凝藥。實驗動物飼養(yǎng)至表1中預定時間時，靜脈注射肝素抗凝，空氣栓塞法處死，切開腹部，暴露腎，肉眼觀察腎是否有異常，隨后取出腎，用10%甲醛溶液固定。

1.2.2 組織切片

將4%甲醛固定后的組織標本修整好，流水充分沖洗后，再依次用70%、80%、90%、95%(每個濃度下20 min)及100%(共兩次，每次10 min)酒精梯度脫水，石蠟包埋切片，切片厚度5 μm，進行常規(guī)蘇木精-伊紅染色(H&E染色)。將切片在光學顯微鏡下或用數字病理掃描儀掃描后進行觀察。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況

實驗組和裸球囊對照組手術成功率100%，造模成功，模型可操作性強。所有實驗動物均存活至預定觀察終點，精神尚好，飲食正常，活動正常。

2.2 腎大體觀察

A組7 d時腎表面可見散在白色梗死灶，大小不一。28 d時，腎表面粗糙，遍布大量的小凹坑(圖1A)。切開后可見梗死灶腎皮質與髓質界限不清或已累及到近髓質，腎小盞、腎大盞、腎盂及輸尿管等其他部位均未見明顯異常。

B組7 d 時腎表面有多個較大面積的梗死灶，呈灰白色、凹陷，觸感質硬[6]。切開壞死部位，發(fā)現壞死部位呈楔形，壞死深度已經接近皮質與髓質的交界處。28 d時，腎體積明顯萎縮、不等大，大范圍出現較大白色梗死灶，約2 mm × 5 mm(圖1B)，凹陷較深，已呈現瘢痕化[7]。切開發(fā)現壞死部分已延伸到髓質部位。

圖1 隨訪時28 d腎大體觀察圖Figure 1 Gross observation of the 28 d rabbit kidneys at follow-up

C組7 d及28 d各三只兔中，均有一只兔雙側腎未見有明顯異?，F象。其他病變腎現象是表面散布有極少量白色梗死灶或微小凹點，但數量和整體嚴重程度要小于A組及B組。D組(裸球囊對照組)和E組(空白對照組)的腎形態(tài)、大小、色澤均正常。

2.3 腎病理學檢查

對A組(3.0 mm × 40 mm，單倍劑量)7 d異常腎制作H&E染色病理切片，未見炎癥，皮髓質界限清晰，在皮質部位可見部分壞死區(qū)域，壞死點部位腎小球囊腔內充滿紅細胞，腎小管上皮細胞死亡，細胞核溶解，細胞結構消失，胞質崩解融合成為一片淡紅色均質，疑為皮質層小葉間動脈堵塞，造成腎小管和腎小球缺血缺氧，繼而發(fā)生壞死[8]。在正常組織與壞死組織交界處可見腎小球充血，其周圍小血管也發(fā)生充血。交界處腎小管上皮細胞核濃縮，立方上皮細胞萎縮變扁，呈壞死趨勢?？梢娪辛闵⒌某什灰?guī)則形狀的黑色物質分布，在高倍鏡下可見黑色物質不具細胞形態(tài)(圖2A、2B)，形貌不規(guī)則，疑為藥物球囊擴張后掉下來的藥物涂層微粒。28 d時，未見黑色物質，在兩條皮質迷路之間的髓放線處局部有炎性細胞聚集(圖2C、2D)。呈纖維化趨勢，炎性灶周圍腎小管上皮細胞變性。

圖2 A組腎病理圖片(3.0 × 40 mm，單倍劑量)Figure 2 Histological changes in the rabbit kidneys of the group A (3.0 mm× 40 mm, single dose)

對B組(3.0 mm × 40 mm，三倍劑量)試驗后7 d異常腎進行病理分析可見在腎皮質部位有部分壞死區(qū)域，在正常組織與壞死區(qū)域交界處腎小球充血(圖3A)。腎小管上皮細胞死亡，細胞核溶解，細胞結構消失，胞質崩解融合成為一片淡紅色均質，在皮質外層近表面處有黑色物質分布(圖3B)。28 d時，未見黑色物質，H&E染色可見梗死灶縱向病變已累及近髓質部分，在皮質近表面凹陷，部分組織已完全壞死呈現纖維化，在未完全壞死部位可見細胞核發(fā)生溶解，同時有少量炎性細胞聚集[9]，在個別區(qū)域發(fā)現有腎小球萎縮、結構消失現象(圖3C、3D)。

對C組(3.0 mm × 20 mm，單倍劑量，28 d)異常部位進行病理分析，皮質部分未見異常，在皮質和髓質交界處出現少量纖維化，靠近纖維灶邊緣腎小管上皮細胞出現脂肪變性，在纖維化組織附近有少量炎性細胞(圖4A、4B)。對D組(裸球囊對照組)和E組(空白對照組)的腎病理切片分析，皮髓質分界清晰，腎小球結構正常，無充血，腎小管上皮細胞未見異常，無變性壞死，均正常(圖4C、4D)。

此外，通過測量組織發(fā)生病變處附近的血管，大致判斷栓塞位置的血管尺寸。將切片中有關血管尺寸匯總，阻塞動脈血管位于腎皮質與髓質的交界處，推測為弓形動脈，血管直徑大小約為50 μm ～ 200 μm。阻塞動脈血管位于腎皮質內，推測為小葉間動脈，血管直徑大小約為20 ～ 50 μm。

3 討論

腎組織壞死呈現區(qū)域性，并非完全壞死，腎動脈通暢，腎門附近正常，說明堵塞并不在腎動脈位置。切開腎壞死部位、并對壞死區(qū)域組織做病理切片，發(fā)現壞死深度多位于腎皮質內，較少有累積擴散到腎髓質，說明堵塞的位置極有可能位于腎皮質內的血管中，如弓形動脈和小葉間動脈[10]。

針對異常部位制作H&E染色病理切片，7 d時在梗塞部位有呈不規(guī)則形狀的黑色物質分布，常位于腎小球內，在高倍鏡下可見黑色物質不具細胞形態(tài)，疑為藥物球囊擴張后掉下來的藥物涂層微粒。28 d時目視可見遍布大量的凹坑，體積明顯收縮，H&E染色可見縱向病變已累及近髓質部分，在皮質近表面處部分組織已完全壞死，呈現纖維化。說明在試驗后28 d，栓塞于腎組織中的藥物已被吸收或吞噬，而局部組織壞死，導致炎性反應發(fā)生，繼而發(fā)生纖維性修復。在正常組織與壞死組織交界處可見腎小球充血，其周圍小血管也發(fā)生充血。在未完全壞死部位可見組織細胞核發(fā)生溶解，在個別區(qū)域發(fā)現有腎小球無核現象，同時有少量炎性細胞聚集。

A組和B組腎存在不同程度的梗死灶，B組的壞死區(qū)域面積及程度明顯比A組的嚴重，C組壞死的程度明顯比A組及B組輕，D組(裸球囊對照組)和E組(空白對照組)的腎均正常。這是由于劑量增加導致產生的微粒數目增加引起的病理學改變。說明兔腎壞死的嚴重程度與球囊規(guī)格及藥物劑量有關，大規(guī)格球囊及大藥物劑量更容易導致腎壞死。

組內比較發(fā)現，7 d時多呈現局部的梗死灶，壞死部位僅限于皮質內，未延伸到髓質；隨時間的推移，28 d時主要呈現二種現象，一是大范圍的小凹坑，二是梗死灶部位內陷形成大凹坑，壞死部位延伸到髓質。說明腎壞死的病理歷程是從皮質到髓質，由外及里。兔腎藥物微粒栓塞之后，隨時間的推移，未見有自愈好轉[11]。

通過實驗現象歸納，判斷微粒栓塞生物學效應的幾個觀察指標，包括a)病變動物數占比，單腎異常還是雙腎異常；b)腎體積是否萎縮；c)表面是否整體粗糙，或出現大量的凹坑；d)出現梗死灶的大小，數量；e)病理切片是否有炎癥、細胞壞死，病變延伸程度，腎結構異常等[12]。

鄒強等[13]通過介入手術，經導管注入海藻酸鈉微球與碘海醇的混合液，對腎動脈進行栓塞，隨訪造影觀察腎動脈栓塞情況，并對腎進行組織病理學觀察，用以評價海藻酸鈉微球的栓塞性能、降解性和生物相容性。通過腎動脈向腎注射栓塞劑的方式，作為評價栓塞劑性能的模型已經比較成熟，而通過模擬器械使用過程，評價器械使用過程中脫落的微粒在體內的栓塞風險的研究，筆者尚未見有報道。本研究通過設計對照試驗發(fā)現，實驗組腎有不同程度的壞死，異常腎病理都呈現出典型的血管梗塞組織壞死征象，而裸球囊對照組和空白對照組腎均正常。說明設計的動物模型可以用來評估藥物球囊在體內的栓塞風險，特別是用于比較產品之間或產品改進前后的微粒栓塞風險。不過，對于微粒栓塞的眾多生物學效應指標，本研究尚未確定半定量和定量指標，綜合判斷微粒栓塞的風險仍需要一定的專業(yè)知識和經驗。

參考文獻

[1] AAMI TIR42: 2010 Evaluation of Particulates Associated with Vascular Medical Devices [S]. AAMI Technical Information Report, 2010.

[2] Bukofzer S, Ayres J, Chavez A, et al. Industry perspective on the medical risk of visible particles in injectable drug products [J]. PDA J Pharm Sci Technol, 2015, 69(1): 123-139.

[3] Kolodgie FD, Pacheco E, Yahagi K, et al. Comparison of particulate embolization after femoral artery treatment with IN.PACT Admiral versus Lutonix 035 paclitaxel-coated balloons in healthy swine [J]. J Vasc Interv Radiol, 2016, 27(11): 1676-1685.

[4] Babcock DE, Hergenrother RW, Craig DA, et al. In vivo distribution of particulate matter from coated angioplasty balloon catheters [J]. Biomaterials, 2013, 34(13): 3196-3205.

[5] Wen X, Murugan R, Peng Z, et al. Pathophysiology of acute kidney injury: a new perspective [J]. Contrib Nephrol, 2009, 165(165): 39-45.

[6] 程新寶，袁曙光. 四氧化三鐵微粒栓塞兔腎動脈價值研究 [J]. 實用放射學雜志, 2003, 19(9): 774-776.

Cheng XB, Yuan SG. Research value of embolic rabbit renal arteries by using microspheres of Fe3O4[J]. J Pract Radiol, 2003, 19(9): 774-776.

[7] 朱國慶，虞希祥，肖池金，等.三丙烯微球栓塞腎動脈的實驗研究 [J]. 介入放射學雜志, 2013, 22(7): 578-581.

Zhu GQ, Yu XX, Xiao CJ, et al. Tris-acryl gelatin microspheres used as an embolic agent for renal artery embolization: an experimental study in rabbits [J]. J Intervent Radiol, 2013, 22(7): 578-581.

[8] 宋松林.白及微球栓塞兔腎動脈的實驗研究 [D]. 華中科技大學，2012.

Song SL. Experimental research of embolization of rabbit renal artery with Bletilla Striata microspheres [D]. Huazhong University of Science &Technology, 2012.

[9] 肖程程，張杰.腎纖維化的細胞和分子基礎 [J]. 中國醫(yī)藥導報, 2017, 14(7): 45-48.

Xiao CC, Zhang J. The cellular and molecular basis of renal fibrosis [J]. Chin Med Herald, 2017, 14(7): 45-48.

[10] 朱海云，劉振堂，李興華. 土貝母皂甙微囊的特性及其用于腎動脈栓塞的實驗研究 [J]. 中華放射學雜志, 2001, 35(2): 107-109.

Zhu HY, Liu ZT, Li XH. Characteristics of ethylcellulose microcapsules containing tubeimoside and its usage in the experimental study of renal arterial chemoembolization [J]. Chin J Radiol, 2001, 35(2): 107-109.

[11] 馬園園，劉成海，陶艷艷.腎纖維化動物模型特點與研究進展 [J]. 中國實驗動物學報, 2018, 26(3): 398-403.

Ma YY, Liu CH, Tao YY. Research progress of animal models of renal fibrosis and their characteristics [J]. Acta Lab Anim Sci Sin, 2018, 26(3): 398-403.

[12] 馬艷苗，王永輝，周然. 腎病理損傷評價在實驗和臨床研究中的應用前景[J]. 世界中西醫(yī)結合雜志, 2010, 5(3):266-268.

Ma YM, Wang YH, Zhou R, et al. Application prospect of renal pathological injury evaluation in experimental and clinical research [J]. World J Integr Tradit Western Med, 2010, 5(3): 266-268.

[13] 鄒強，佟小強，王健，等.海藻酸鈉微球腎動脈栓塞的動物實驗研究 [J]. 中國醫(yī)學影像技術, 2008, 24(4): 479-482.

Zou Q, Tong XQ, Wang J, et al. Experimental study of renal artery embolization with alginate microspheres [J]. Chin J Med Imaging Technol, 2008, 24(4): 479-482.