木豆素對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)溫和應(yīng)激小鼠的抗抑郁作用

張夢(mèng)荻，王麗莎，李晨晨，陶雪，周云豐，劉新民,2，潘瑞樂(lè)，常琪*

(1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193； 2. 中國(guó)航天員科研訓(xùn)練中心人因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100094)

抑郁癥是一種情緒、睡眠、食欲、體育、動(dòng)機(jī)、興趣、思考力普遍紊亂的情感性精神疾病，嚴(yán)重影響人體的健康。當(dāng)今社會(huì)快節(jié)奏的生活和高強(qiáng)度的壓力下，抑郁癥的發(fā)病率逐年上升，給病人自身和家庭甚至整個(gè)社會(huì)帶來(lái)巨大的影響，已經(jīng)逐漸成為全球性的健康難題[1]。目前運(yùn)用于臨床的抗抑郁藥物在治療時(shí)仍存在許多不足，如起效緩慢、不良反應(yīng)大、抗抑郁譜窄等，所以仍然需要我們進(jìn)一步研究可以防治抑郁癥的藥物。

木豆(Cajanuscajan(Linn.) Millsp.)是一種分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)的豆科植物，為世界第六大食用豆類，也是唯一的木本食用豆類[2]。木豆作為傳統(tǒng)民族藥物被廣泛使用，具有清熱解毒消腫、利濕止血、止痛、殺蟲等作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，木豆葉的水或乙醇提取物具有抗骨質(zhì)疏松、降血脂、抗腦缺血缺氧損傷的作用。木豆素(cajaninstilbene acid，CSA)是木豆葉中含量較高且活性較強(qiáng)的一芪類化合物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗皰疹病毒及降血糖的藥理活性[3]。我們的前期研究表明，木豆素對(duì)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的損傷具有明顯的保護(hù)作用，認(rèn)為木豆素能夠通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑保護(hù)神經(jīng)元。根據(jù)木豆素的神經(jīng)保護(hù)作用，我們首次利用動(dòng)物模型對(duì)木豆素進(jìn)行了抗抑郁活性的相關(guān)研究，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性BALB/c 小鼠72只，體重 20 ～ 22 g，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司【SCXK(京)2016-0011】。飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)【SYXK(京)2014-0023】。自由供給標(biāo)準(zhǔn)飼料和清潔水，維持 12 h光照：12 h黑暗晝夜節(jié)律，室溫(24 ± 1)℃，相對(duì)濕度為(55 ± 10)%。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)：SLXD-2018053017)。

1.1.2 藥品與試劑

木豆素為本實(shí)驗(yàn)室自制[4]，其純度經(jīng)HPLC法測(cè)定為98%；5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT，BCBM9925 V)、多巴胺(dopamine，DA，BCBR4608 V)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA，A2129)、4-對(duì)乙酰氨基酚(4-acetamidophenol，05615EEV)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；鹽酸帕羅西汀(paroxetine hydrochloride，Par，100357-201102)、谷氨酸(glutamate，Glu，140690-200401)、去甲腎上腺素(norepinephrine，NE，100169-201404)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA，3099812)購(gòu)自美國(guó)Dikma公司；乙酰膽堿(acetylcholine，Ach)購(gòu)自中國(guó)Biotopped公司；質(zhì)譜級(jí)乙腈和甲酸購(gòu)自美國(guó)Fisher公司；小鼠皮質(zhì)酮酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所，20180307)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

Prominence UFLC 液相色譜系統(tǒng)(日本 島津)；Q-Trap5500 型質(zhì)譜分析儀(美國(guó)AB SCIEX)；Vibra-Cell 型超聲波破碎儀(美國(guó) Sonics 公司)；M1000型多功能連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan)。

1.2 方法

1.2.1 CUMS模型建立及給藥

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)造模前進(jìn)行的糖水偏愛(ài)基線測(cè)試結(jié)果將小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只，即正常組、CUMS模型組、陽(yáng)性藥帕羅西汀組(10 mg/kg)、CSA低劑量組(7.5 mg/kg)、CSA中劑量組(15 mg/kg)、CSA高劑量組(30 mg/kg)。除正常組外，其余各組動(dòng)物單籠飼養(yǎng)且在6周內(nèi)接受CUMS造模[5]，應(yīng)激因素包括：禁水(12 h)、禁食(12 h)、晝夜顛倒(24 h)、夾尾(2 ～ 3 min)、4℃冰水游泳(5 min)、動(dòng)物叫聲(30 min)、束縛(4 h)、濕籠(300 mL水/籠，12 h)、45℃傾籠(7 h)、配對(duì)飼養(yǎng)(12 h)等。每日應(yīng)激刺激2～3種，并盡量使應(yīng)激過(guò)程符合不可預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性。造模同時(shí)開始給藥，每日1次，直到檢測(cè)結(jié)束。各組均按10 mL/kg灌胃給藥。各組藥物均以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液為溶劑，正常組和模型組給予溶劑。

1.2.2 糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)報(bào)道[6]， 糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)分為訓(xùn)練期和測(cè)試期。首先進(jìn)入訓(xùn)練期，給予動(dòng)物一瓶2%蔗糖水和一瓶純水48 h，中間交換水瓶位置，讓小鼠適應(yīng)飲用糖水。隨后進(jìn)入測(cè)試期，動(dòng)物禁食8 h(9：00-17：00)后進(jìn)行16 h(17：00-第2天9：00)的糖水偏愛(ài)測(cè)試，給予動(dòng)物一瓶2%蔗糖水和一瓶純水，中間交換水瓶位置，測(cè)試前后分別稱量每個(gè)水瓶的重量，并計(jì)算糖水偏愛(ài)指數(shù)(糖水偏愛(ài)指數(shù)=糖水消耗量/總液體消耗量×100%)。造模結(jié)束后第2天進(jìn)行糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)快感缺失的癥狀。

1.2.3 生物樣品采集

行為學(xué)檢測(cè)后的第2天下午，小鼠給藥1 h后從每組隨機(jī)選取8只眼球取血并脫頸處死，迅速分離出海馬和皮層組織并精密稱重。血樣在4℃離心(3500 r/min，10 min),取上層血清，并于-80℃保存待測(cè)。

1.2.4 皮質(zhì)酮和神經(jīng)遞質(zhì)的含量檢測(cè)

血清皮質(zhì)酮的含量測(cè)定依據(jù)試劑盒所提供的說(shuō)明書進(jìn)行；皮層和海馬中的神經(jīng)遞質(zhì)水平測(cè)定按如下方法進(jìn)行。

取小鼠全部皮層和海馬組織，分別精密加入100 μL和50 μL超純水，冰浴中超聲勻漿。經(jīng)預(yù)先測(cè)得1 g腦組織勻漿后體積為1 mL，故腦組織勻漿液的體積應(yīng)計(jì)算為所加入的勻漿液體積與腦組織重量之和。精密吸取50 μL組織勻漿液，加入20 μL內(nèi)標(biāo)液4-對(duì)乙酰氨基酚80%甲醇溶液(500 ng/mL)，渦旋混勻后加入10 μL TFA以沉淀蛋白，渦旋，于4℃低溫離心(20 000 g，15 min)，吸取上清液于進(jìn)樣瓶中，取3 μL注入液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)儀進(jìn)行分析。

色譜柱為Restek Ultra AQ C18(100 mm ×2.1 mm，3 μm)，柱溫35℃，流動(dòng)相為乙腈(A)- 0.1%甲酸水溶液，流速0.4 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)椋?- 0.5 min，5% A；0.5- 5 min，5- 80% A；5- 6 min，80% A；6- 6.1 min，80-5% A；6.1- 8 min，5% A。采用ESI電離方式進(jìn)行離子化，以正離子模式下的多反應(yīng)檢測(cè)(MRM)對(duì)流出液體進(jìn)行分析。離子源參數(shù)優(yōu)化為：噴霧電壓4500 V；加熱溫度500 ℃；氣簾氣30 psi；霧化氣60 psi和輔助氣40 psi。檢測(cè)離子對(duì)分別為177.0/160.0(5-HT)、170.0/152.0(NE)、148.2/84.0(Glu)、104.1/87.0(GABA)、154.0/136.6(DA)、146.0/87.4(Ach)和152.0/109.9(IS)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用one-way ANOVA 進(jìn)行多組間比較， 兩兩比較采用 Fisher’s LSD post hoc 多重比較方法或者曼-惠特尼U檢驗(yàn)。P< 0.05認(rèn)為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 CSA對(duì)CUMS模型小鼠糖水偏愛(ài)指數(shù)的影響

如圖 1所示，對(duì)小鼠CUMS刺激6周造模后，與正常組相比，模型組動(dòng)物糖水偏愛(ài)指數(shù)顯著性降低(P< 0.05)，給藥各組較模型組糖水偏愛(ài)指數(shù)均上升，且CSA中、高劑量組與模型組比較有顯著性差異(P< 0.05)。

2.2 CSA對(duì)CUMS模型小鼠血清皮質(zhì)酮的影響

如圖2所示，對(duì)小鼠CUMS刺激6周造模后，與正常組相比，模型組動(dòng)物血清皮質(zhì)酮含量顯著性升高(P< 0.05)，給藥各組較模型組血清皮質(zhì)酮含量均有所下降，且帕羅西汀組和CSA 15 mg/kg劑量組與模型組比較有顯著性差異(P< 0.05)。

2.3 CSA對(duì)CUMS模型小鼠皮層和海馬中神經(jīng)遞質(zhì)含量的影響

如表 1所示，與正常組相比，模型組皮層中GABA、NE、DA和Glu含量顯著減少(P< 0.05)。與模型組相比，帕羅西汀組動(dòng)物皮層內(nèi)NE和DA含量顯著性升高(P< 0.05)。 CSA低劑量組動(dòng)物皮層內(nèi)NE、GABA和Glu含量與模型組相比顯著性升高(P< 0.05)。CSA中劑量組動(dòng)物皮層 DA、NE和Glu含量顯著高于模型組(P< 0.05)，木豆素高劑量組皮層5-HT含量較模型組顯著升高(P< 0.05)。

如表2所示，與正常組相比，模型組海馬中Ach含量顯著減少(P< 0.05)。帕羅西汀組及CSA低、中劑量組動(dòng)物海馬內(nèi)Ach含量與模型組相比顯著性升高(P< 0.05)。

表1 CSA對(duì)CUMS小鼠皮層內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度的影響Table 1 Effect of CSA on concentration of neurotransmitters in cerebral cortex of the CUMS mice s，n=6～8)

注：與對(duì)照組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05，##P< 0.01,vs. the control group.*P< 0.05，**P< 0.01,vs. the CUMS group.

表2 CSA對(duì)CUMS小鼠海馬內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)濃度的影響Table 2 Effect of CSA on concentration of neurotransmitters in hippocampus of the CUMS mice s，n=6～8)

注：與對(duì)照組比較，#P< 0.05，##P< 0.01；與模型組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note.#P< 0.05，##P< 0.01,vs. the control group.*P< 0.05，**P< 0.01,vs. the CUMS group.

3 討論

目前，我們可以將抑郁癥模型分為環(huán)境刺激模型、社會(huì)刺激模型、藥物誘導(dǎo)模型、轉(zhuǎn)基因模型、手術(shù)制備模型和產(chǎn)后抑郁模型六大類。本研究所選取的CUMS模型就屬于環(huán)境刺激模型，是抑郁癥的經(jīng)典慢性模型之一，利用長(zhǎng)期的相對(duì)溫和的不可預(yù)測(cè)的人為刺激使得動(dòng)物產(chǎn)生抑郁樣行為，其病因和病理機(jī)制接近于人類抑郁癥，目前已經(jīng)被廣泛接受并運(yùn)用于抑郁動(dòng)物模型的建立。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)CUMS造模后，動(dòng)物產(chǎn)生快感缺失現(xiàn)象，表現(xiàn)在CUMS小鼠其糖水偏愛(ài)指數(shù)顯著下降，而給予帕羅西汀和CSA后指數(shù)均有所上升，其中CSA 15 mg/kg 和30 mg/kg與模型組比較具有顯著性差異，這說(shuō)明CSA可能具有抗抑郁作用。

抑郁癥的發(fā)病與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)十分相關(guān)，研究表明長(zhǎng)期的應(yīng)激狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素水平持續(xù)升高，對(duì)神經(jīng)元造成損傷，破壞HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，從而導(dǎo)致HPA軸功能的持續(xù)亢進(jìn)，進(jìn)一步損傷神經(jīng)可塑性。本實(shí)驗(yàn)中CUMS造模引起了小鼠血清皮質(zhì)酮水平的顯著升高，反映了HPA軸功能的亢進(jìn)，而給予CSA后可以減少CUMS小鼠血清皮質(zhì)酮的水平，且CSA 15 mg/kg劑量組與模型組比較具有顯著性差異，說(shuō)明CSA可能通過(guò)抑制HPA軸功能而產(chǎn)生抗抑郁作用。

除此之外，神經(jīng)遞質(zhì)在抑郁癥的發(fā)病中也起著重要作用。研究表明，抑郁患者體內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì)水平發(fā)生了明顯的改變[7-8]，其中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的減少是抑郁癥發(fā)病機(jī)制的假說(shuō)之一。本研究發(fā)現(xiàn)CUMS小鼠皮層中NE和DA含量顯著減少且CSA可以顯著逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)。與正常組比較，模型組海馬中未見(jiàn)有單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的顯著性改變。這說(shuō)明CSA可能通過(guò)提高小鼠皮層中NE和DA的含量來(lái)產(chǎn)生抗抑郁作用。

GABA是腦內(nèi)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，研究表明，在抑郁患者血漿及腦脊液中GABA水平下降[9-10]，并且用于合成GABA的谷氨酸脫羧酶(GAD)表達(dá)也減少[11-12]，說(shuō)明GABA功能的缺陷可能參與了抑郁癥的發(fā)生。本研究中，CUMS小鼠皮層中GABA含量顯著減少且CSA可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)，但在海馬中未發(fā)現(xiàn)這一顯著趨勢(shì)。這表明CSA可能通過(guò)提高小鼠皮層中GABA的含量來(lái)產(chǎn)生抗抑郁作用。

谷氨酸是腦內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，它既能觸發(fā)短期的興奮性突觸后電位，也能誘導(dǎo)長(zhǎng)期的突觸傳遞強(qiáng)度和神經(jīng)可塑性的變化，對(duì)于信息加工、記憶等十分重要。谷氨酸濃度的變化與抑郁的產(chǎn)生有一定關(guān)系。大部分研究認(rèn)為抑郁與谷氨酸水平大量升高有關(guān)。有研究表明谷氨酸過(guò)度釋放會(huì)導(dǎo)致興奮性毒性，造成神經(jīng)元的損傷和死亡，其堆積可能是引起抑郁的原因之一[13-14]。但是針對(duì)抑郁癥患者體內(nèi)谷氨酸水平變化的研究仍有不同的發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)抑郁病人血液、腦脊液及腦內(nèi)谷氨酸水平不變或升高[15-17]，還有研究發(fā)現(xiàn)抑郁病人腦脊液和抑郁模型動(dòng)物皮層中谷氨酸水平降低[11,18]，并且谷氨酸能神經(jīng)元代謝活動(dòng)和其神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞都減少。除此之外，有研究通過(guò)定量腦內(nèi)的神經(jīng)相關(guān)代謝物發(fā)現(xiàn)，重度抑郁癥患者前額葉皮層內(nèi)Glx(谷氨酸和谷氨酰胺的總信號(hào)強(qiáng)度)水平下降[19]。在本研究中發(fā)現(xiàn)CUMS小鼠皮層中Glu含量顯著減少且CSA可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)；而海馬中CUMS小鼠Glu含量有所上升，木豆素給藥后有所下降，但其中的差異未見(jiàn)顯著性。Glu在抑郁模型小鼠皮層組織中的顯著下降與部分文獻(xiàn)的報(bào)道相一致[11]，表示出現(xiàn)了谷氨酸能系統(tǒng)的異常。并且，木豆素的抗抑郁作用可能與提高皮層內(nèi)Glu的含量有關(guān)。

認(rèn)知功能障礙常常會(huì)伴隨著抑郁產(chǎn)生，影響注意力、記憶力及執(zhí)行力等各個(gè)方面。研究表明膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶功能密切相關(guān)，認(rèn)知功能障礙患者海馬等部位的膽堿能神經(jīng)元數(shù)量和乙酰膽堿水平顯著減少[20-21]，本研究中，CUMS小鼠海馬中ACh含量顯著減少且CSA可以逆轉(zhuǎn)這一趨勢(shì)，說(shuō)明CSA具有改善抑郁模型動(dòng)物認(rèn)知功能損傷的可能性。

另外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CUMS模型動(dòng)物血清中的5-HT水平是顯著下降的(未在文中顯示)，但是皮層和海馬部位沒(méi)有顯著性差異，我們認(rèn)為CUMS對(duì)于腦組織中5-HT的影響可能有限。雖然很多研究結(jié)果顯示CUMS小鼠腦內(nèi)5-HT水平下降，但是也有部分文獻(xiàn)報(bào)道，CUMS造模后，皮層或者多個(gè)腦區(qū)(包括海馬和扣帶皮層)內(nèi)5-HT含量沒(méi)有顯著改變[22-23]。除此之外我們可以看出帕羅西汀給藥后相比正常組5-HT的含量顯著下降，這與預(yù)期的結(jié)果不一致，但有研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激小鼠只有在良好的外界環(huán)境下給予氟西汀會(huì)產(chǎn)生良好的抗抑郁效果，而在應(yīng)激條件下給予氟西汀并不能改善抑郁癥狀，甚至?xí)兴鶒夯痆24]，帕羅西汀同樣作為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑可能也會(huì)有類似的情況，從而導(dǎo)致5-HT水平異常下降，但這仍需進(jìn)一步探究。

實(shí)驗(yàn)中木豆素各劑量組的藥效作用未見(jiàn)明顯的量效關(guān)系，這可能與其作用于神經(jīng)系統(tǒng)的特性有關(guān)。作用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥物其作用通常具有兩面性，即神經(jīng)的興奮作用和抑制作用。例如，氯胺酮作為一種新型的抗抑郁藥其在高劑量下具有麻醉作用，然而在低劑量下卻具有明顯的抗抑郁的作用。不同劑量下產(chǎn)生這兩種不同的作用說(shuō)明神經(jīng)藥物的量效關(guān)系其實(shí)更為復(fù)雜，其作用并不一定會(huì)隨著劑量的升高而持續(xù)升高。并且有時(shí)高劑量、高頻率或者長(zhǎng)時(shí)間的給藥也可能導(dǎo)致神經(jīng)毒性的產(chǎn)生，從而無(wú)法產(chǎn)生良好的藥效[25]。所以木豆素對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的作用也許也存在這樣的特性，在不同的劑量下對(duì)于一些生化指標(biāo)的影響也不同，但這需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

值得注意的是模型組皮層和海馬中各神經(jīng)遞質(zhì)的變化有一定差別，并且CSA對(duì)于兩個(gè)部位代謝物的影響也不相同，說(shuō)明不同部位在CUMS的影響下可能會(huì)有不一樣的反應(yīng)，且相對(duì)于海馬，CUMS對(duì)于小鼠皮層中神經(jīng)遞質(zhì)的影響更大。

綜上，我們認(rèn)為CSA可能具有抗抑郁作用，并且是通過(guò)調(diào)節(jié)HPA軸功能及皮層神經(jīng)遞質(zhì)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的，除此之外CSA還具有改善抑郁模型動(dòng)物認(rèn)知功能損傷的可能性，但是其作用的深層機(jī)制未能被深刻闡明, 仍需要我們進(jìn)一步的研究和探索。

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