黃芪對高血壓大鼠血管重構(gòu)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激反應的影響

顧靜，郭超，車敏，吳紅彥，李海龍

(甘肅中醫(yī)藥大學, 蘭州 730000)

高血壓病因機制復雜交錯，血管重構(gòu)參與其發(fā)生發(fā)展。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，對細胞具有雙向調(diào)節(jié)作用，早期適度的 ERS 可誘導 ER 分子伴侶如鈣網(wǎng)蛋白(calreticulin，CRT)等的表達上調(diào),促進ER功能的恢復[1]，具有細胞保護作用。隨著時間的延長，過強的ERS通過誘導凋亡相關分子caspase-12等的活化而導致細胞凋亡[2-3]。已有的報道指出，ERS參與了動脈粥樣硬化性心臟病、收縮性心力衰竭、糖尿病以及阿爾茨海默癥等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[4]，但在高血壓的發(fā)展中ERS對血管重構(gòu)的影響鮮有報道。黃芪具有強心、抗氧化[5]、抗炎、雙向調(diào)節(jié)血壓、減弱損傷引起的ERS反應[6]等作用，但調(diào)節(jié)血壓保護高血壓血管的分子機制還不清楚。本研究擬構(gòu)建高血壓模型，檢測 ERS分子在血壓發(fā)展的不同時期的表達情況，并以中藥黃芪干預，探討高血壓血管組織中ERS及黃芪調(diào)節(jié)血壓、改善血管損害的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級雄性Wistar大鼠140只，體重(200 ± 10)g，來源于甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心【SCXK(甘)2011-0001】。實驗在甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗動物中心進行【SYXK(甘)2013-0001】。

1.1.2 試劑與儀器

黃芪注射液(AST)購自正大青春寶藥業(yè)有限公司(批號：1405232)；大鼠GAPDH、CRT和caspase-12等抗體購自于Santa Cruz公司；TUNEL 熒光檢測凋亡試劑盒、RIPA裂解液等購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 腹主動脈狹窄術(shù)建立高血壓大鼠模型[4,7]

肋弓下緣 0.5 cm、腹正中線旁左側(cè) 0.5 cm 處行 2.0 ～ 2.5 cm 縱行切口，分離組織入腹腔，在腹主動脈與左側(cè)腎動脈交匯處的上方，用0 號手術(shù)線將腹主動脈和七號針頭一起結(jié)扎[4], 緩慢抽離針頭縫合傷口并消毒。假手術(shù)組僅分離出腹主動脈。術(shù)后肌注頭孢預防感染。

1.2.2 動物分組及給藥

實驗動物分為空白對照組、高血壓模型組、干預組(手術(shù)聯(lián)合黃芪組)，按術(shù)后時間分為 1、2、4、6周四個亞組。術(shù)后第2天開始，干預組大鼠腹腔注射AST 8 g/(kg·d)，換算成體積為0.8 mL/d，對照組與模型組等體積生理鹽水腹腔注射，連續(xù)42 d。

1.2.3 鼠尾動脈測壓法[8]測量大鼠血壓及動脈血管標本的采集

術(shù)前1 d和術(shù)后1、2、4、6周對大鼠進行尾動脈血壓測定，測3次，取平均值[4]。然后麻醉大鼠，開胸沿心臟分離出主動脈備用。

1.2.4 病理切片及免疫組化

HE染色，顯微鏡(×400)觀察血管壁中層平滑肌層的結(jié)構(gòu)變化。免疫組化染色，圖像分析系統(tǒng)分析并計算平均光密度。

1.2.5 血管肌層厚度的測量

從每個亞組隨機選取8張切片，在每張切片顯微鏡下隨機選3個視野，利用圖像分析系統(tǒng)對選取的視野進行分析測量，對測得的主動脈血管壁肌層厚度值取平均值[4]。

1.2.6 血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)凋亡檢測

TUNEL 法檢測細胞凋亡。

1.2.7 Western blot

裂解液提取總蛋白，變性、定量，凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一、二抗孵育；曝光顯色及圖像分析。由凝膠成像系統(tǒng)采集信號并利用圖像分析軟件分析目標蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

圖2 大鼠腹主動脈形態(tài)變化(HE)Figure 2 Morphological changes of abdominal aorta in the rats(HE staining. Scale bar=20 μm)

2 結(jié)果

2.1 大鼠血壓變化

模型組術(shù)前與對照組無差異，但術(shù)后1、2、4、6周對比對照組血壓分別升高12.7%、17.4%、30.8%和34.3%(均P< 0.05)，且有遞增趨勢(見圖1)。

術(shù)后1、2、4、6周干預組對比相應的模型組血壓分別降低了8.4%、2.4%、8.7%和18.9%(均P< 0.05)(見圖1)。6周時干預組降壓幅度最大。

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P<0.01；與模型組比較，+P< 0.05，++P< 0.01。圖1 大鼠血壓的變化Note.*P< 0.05， vs. the control group.**P<0.01， vs. the control group. +P< 0.05, vs. the model group.++P< 0.01, vs. the model group.Figure 1 Changes of blood pressure in the rats

2.2 大鼠腹主動脈形態(tài)學變化

空白對照組中膜肌層VSMC扁平、胞質(zhì)豐富、層次清楚、內(nèi)膜較完整(圖2A)；模型組中早期(2周)中膜肌層VSMC肥大、細胞排列紊亂，細胞較疏松，彈性膜彎曲、紊亂(圖2B)，后期(6周)VSMC核淡染、排列紊亂、結(jié)構(gòu)不清，血管壁表現(xiàn)為形態(tài)學重構(gòu)(圖2C)；而AST干預組(6周) VSMC核增多、深染，此外平滑肌束增寬、層次清楚，血管壁的重構(gòu)程度減輕(圖2D)。

2.3 大鼠主動脈血管壁肌層厚度變化

模型組術(shù)后1、2、4、6周對比對照組血管壁肌層厚度分別升高了2.7%、6.6%、20.0%和24.3%(均P< 0.05)；對比模型組干預組分別降低了0.8%、2.8%、10.2%和13.5%(均P< 0.05)(見圖3)。給藥6周時干預組降低幅度最大。

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與相應模型組比較，+P< 0.05，++P< 0.01.圖3 大鼠主動脈血管壁肌層厚度變化Note.*P< 0.05, vs. the control group.**P<0.01, vs. the control group. +P< 0.05, vs. the model group.++P< 0.01, vs. the model group.Figure 3 Changes of the thickness of muscular layer of the rat aortic wall

2.4 大鼠腹主動脈CRT和caspase-12免疫組化染色

術(shù)后6周CRT和caspase-12免疫組化觀察：胞質(zhì)染成棕色，核被染成藍色，模型組腹主動脈中膜肌層CRT和caspase-12表達較對照組增多(均P< 0.05)；干預組CRT和caspase-12表達對比對照組有增多但無統(tǒng)計學差異，對比模型組兩者均減少(P< 0.05)(表1，圖4)。

2.5 大鼠動脈血管組織中ERS分子——CRT、Caspase-12表達變化

Western blot 檢測CRT：術(shù)后1、2周時對比對照組表達分別升高了172.6%、和83.3%(均P< 0.01)，4、6周時下降(見圖5)。術(shù)后1、2周對比模型組，干預組CRT降低了53.3%和37.5%(均P< 0.01)，6周時 CRT表達變化不大(見圖5)。

Western blot 檢測：模型組caspase-12在術(shù)后1周時降低，對比對照組下降了20.2%(P< 0.05)，2、4、6周表達分別升高了30.1%、43.6%和56.8%(均P< 0.05)，(見圖5)。術(shù)后2、4、6周干預組對比模型組caspase-12分別降低了14.2%、39.9%和75.5%(均P< 0.05)(見圖5)。

表1 CRT和caspase-12免疫組化染色Table 1 Changes of CRT and caspase-12 expression in the smooth muscle of tunica media of rat abdominal aortic wall ± s，n=5).Immunohistochemical staining

注：與對照組比，*P< 0.05，**P< 0.01；與模型組比，#P< 0.05，##P< 0.01.

Note：*P< 0.05，vs. the control group.**P<0.01, vs. the control group.#P< 0.05, vs. the model group.##P< 0.01, vs. the model group.

圖4 各組免疫組化染色Figure 4 CRT and caspase-12 expression in the aortic wall of the rats(Immunohistochemical staining)

2.6 大鼠動脈VSMC凋亡檢測

模型組術(shù)前與對照組無差異，但術(shù)后1周、2周、4周和6周對比相應的對照組VSMC的凋亡率分別升高了22.3%、33.8%、69.3%和105.2%(均P< 0.05)，遞增趨勢明顯(見圖6)。上述實驗結(jié)果證明腹主動脈狹窄術(shù)后大鼠主動脈VSMC的凋亡率時間依賴性的增高，提示細胞的凋亡機制參與高血壓發(fā)生時的血管重構(gòu)。

術(shù)后各時間點干預組對比相應的模型組VSMC的凋亡率有所下降， 1周、2周、4周和6周凋亡率分別降低了6.4%、7.5%、18.6%(P< 0.01)和32.5%(P< 0.01)，給藥4周、6周時干預組降幅明顯，有統(tǒng)計學差異(見圖6)。表明AST可在一定程度內(nèi)改善高血壓引起的VSMC凋亡，減輕血管重構(gòu)。

注：與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01；與相應模型組比較，+P< 0.05，++P< 0.01。圖6 大鼠主動脈VSMC凋亡率的變化Note.*P< 0.05, vs. control group.**P<0.01, vs. the control group. +P< 0.05, vs. the model group.++P< 0.01, vs. the model group.Figure 6 Changes of apoptosis rate of VSMCs in the rats

3 討論

3.1 腹主動脈狹窄術(shù)建立高血壓大鼠模型

血壓的形成、穩(wěn)定和變化都與血管本身的結(jié)構(gòu)有密切的關系，高血壓發(fā)病的諸多因素引起血管結(jié)構(gòu)、功能改變是引起心臟和其他靶器官損傷的基本原因，本研究結(jié)果表明：腹主動脈狹窄術(shù)后大鼠血壓在6周內(nèi)明顯升高，高血壓大鼠模型構(gòu)建成功，同時大鼠血管壁肌層隨時間推移有增厚趨勢，證明高血壓發(fā)生發(fā)展的中早期即伴有大動脈血管形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變，這種血管壁肌層增厚的重構(gòu)效應必然引起血管收縮舒張功能改變，進而影響動脈血壓的周期性變化。以上結(jié)果和推論表明血管重構(gòu)機制參與腹主動脈狹窄術(shù)構(gòu)建的大鼠高血壓模型的形成。

3.2 ERS參與壓力性負荷高血壓大鼠的血管重構(gòu)

早期適度的ERS可促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的恢復，具有細胞保護作用，而后期過強的ERS可啟動ER途徑的細胞凋亡機制，具有破壞清除受損細胞的作用[2-3,9]。本實驗特別關注了高血壓發(fā)生發(fā)展過程中的 ERS，分別選取造模術(shù)后1、2、4、6周等不同時間點動態(tài)觀察ERS的保護性因子CRT和凋亡損傷性因子caspase-12的表達情況，以探討這種ERS雙向調(diào)節(jié)機制在高血壓發(fā)生發(fā)展不同階段的作用。

在ERS時CRT和GRP78等分子表達上調(diào)，二者能啟動細胞的自我保護機制[10]。CRT有分子伴侶活性，未折疊蛋白反應，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子水平，維持ER的功能相對穩(wěn)態(tài)[10]。本研究結(jié)果顯示1、2周模型組大鼠CRT表達高于對照組CRT作為保護性分子能對ER內(nèi)環(huán)境進行調(diào)節(jié)，其分子伴侶活性有助于維持恢復ER蛋白質(zhì)加工促進細胞功能恢復，增強耐受刺激的能力。但是隨著傷害性刺激持續(xù)作用，應激時間的延長其表達反而有降低趨勢，提示ERS對VSMC的保護作用減弱。相應的，VSMC凋亡率在 1、2周時對比對照組有一定程度的升高(早期細胞凋亡率輕度增加可能與造模方法本身的創(chuàng)傷有一定關系)，但隨后4、6周時凋亡率升高程度顯著增加，這可能說明在高血壓發(fā)生的早期，ERS分子CRT通過調(diào)節(jié)ER穩(wěn)態(tài)起到的一定的保護作用，降低了應激性刺激的損傷，保護VSMC抑制其凋亡，而隨后高血壓誘發(fā)因素的長時間傷害性刺激對細胞的損傷累積加重，細胞已經(jīng)不能通過ERS的自我保護作用修復自身，啟動了細胞的自我死亡程序，凋亡率顯著提高。Rizzoni等[11]研究也認為，雖然VSMC凋亡率在早期沒有大幅度顯著增加，但是血管壁肌層厚度仍然明顯增加，這可能與VSMC的增殖和與之相平衡的凋亡活動調(diào)節(jié)異常有關。

持續(xù)和嚴重的ERS時，ER功能不能恢復，凋亡通路就被啟動了[12]，而ERS介導的凋亡途徑中，caspase-12 起著至關重要的作用[13]。本研究結(jié)果顯示模型組caspase-12升高，且這種高表達出現(xiàn)的時間晚于CRT，隨著時間推遲這種高表達越顯著，這也驗證了李煒等人的研究：隨著時間的延長，ER伴侶分子的保護作用減弱，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑開始起主導作用[4]，相應的VSMC凋亡率在4、6周時顯著增加。2012年槐勇報道了鈣通道阻滯劑可改善ERS抑制壓力過負荷高血壓大鼠的心肌重構(gòu)[14]，而本研究證明ERS還參與了壓力性負荷高血壓大鼠的血管重構(gòu)，可見心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能的改變與ERS 有密切關系，而這種血管重構(gòu)是高血壓發(fā)生發(fā)展中的必然結(jié)果。

3.3 黃芪通過調(diào)節(jié)ERS改善高血壓血管重構(gòu)

AST[15]及黃芪甲苷[16]具有降壓效應，與其調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮收縮舒張功能，調(diào)節(jié)血漿NO[16]、內(nèi)皮素-1含量[15]，也與其影響降壓過程中對壓力反射敏感性有關[15]。而本研究結(jié)果表明AST可在一定程度內(nèi)控制血壓升高，改善高血壓引起的血管壁肌層增厚，且隨干預時間延長降壓效應和血管重構(gòu)的保護效應越明顯。石海蓮等人報道黃芪甲苷長期給藥能降低血壓,逆轉(zhuǎn)壓力過載引起的血管肥厚[16]，證實了本研究結(jié)論的可靠性。

此外，本研究還表明AST可通過對ERS保護性因子和促凋亡因子的調(diào)節(jié)，改善模型大鼠血管壁增厚、VSMC凋亡，減輕血管重構(gòu)，改善血壓。文獻復習顯示黃芪多糖能調(diào)節(jié)糖尿病大鼠肝臟組織CHOP(另一ERS的促凋亡因子)表達[6]。結(jié)合本研究進一步證明AST可通過調(diào)節(jié)ERS改善血管重構(gòu)調(diào)節(jié)血壓。

綜上，AST可在一定程度內(nèi)控制血壓的升高，改善高血壓引起的血管壁肌層增厚，緩解血管重構(gòu)，黃芪的這種調(diào)節(jié)血壓、保護血管的作用可能與其調(diào)節(jié)ERS有一定關系。

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