甜酒曲中一株高產淀粉酶根霉的篩選與鑒定

周金虎，陳茂彬，毛志海，方尚玲

（1.發(fā)酵工程教育部重點實驗室（湖北工業(yè)大學），工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點實驗室，湖北武漢430068； 2.湖北華信制藥有限公司，湖北通城437400）

糯米酒，又稱江米酒、甜酒、酒釀、醪糟，主要原料是糯米，釀制工藝簡單，口味香甜醇美，乙醇含量極少，主要含有糖、蛋白質、氨基酸、維生素、礦物質等營養(yǎng)成分，適宜各類人群食用，因此深受人們喜愛。不同的甜酒曲釀制的米酒口感風格迥異[1]。

目前市場上銷售的甜酒曲共分為傳統(tǒng)土曲、現(xiàn)代工業(yè)化生產的甜酒曲、純種的根霉曲3類，質量參差不齊[2]?，F(xiàn)代工業(yè)化生產的甜酒曲主要含有酵母菌和根霉，而純種的根霉曲中就只有單一的根霉，傳統(tǒng)土曲是由根霉、毛菌、細菌、酵母菌等多種微生物及米粉、辣蓼草等中草藥制作而成，釀制的米酒芳香獨特，口感香醇，但甜度不夠，主要是因為土曲在培養(yǎng)的過程中有多種微生物共同生長，但卻沒有糖化力較強的菌株，而根霉菌的特性之一就是有較強的糖化酶活力[3]。由此可見，甜酒曲都需要有較強糖化力的根霉菌。甜酒曲的質量直接影響米酒的品質及產量，因此研究甜酒曲中的根霉菌具有十分重要的現(xiàn)實意義。鑒于此，本研究著重從4種不同的甜酒曲中篩選出糖化力較強的根霉菌，并通過18S rDNA分子生物學進行鑒定，以期與同行共同探討學習。

1 材料與方法

1.1 材料

四川大竹東柳酒曲（網購），孝感蜂窩酒曲（孝感市王齊庵酵母有限公司），安琪甜酒曲（安琪酵母股份有限公司），蘇州蜜蜂甜酒曲（江蘇微康生物科技有限公司）。

1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g去皮，切塊加熱煮沸30 min，用紗布過濾得過濾液，再加葡萄糖20 g和瓊脂粉20 g，用純水定容至1000 mL。

平板透明圈培養(yǎng)基[4]：可溶性淀粉0.4 g，氯化鈉1.0 g，牛肉膏1.0 g，蛋白胨2.0 g，脫氧膽酸鈉0.4 g，瓊脂粉4.0 g，加純水定容至200 mL。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮10.0 g，自來水8.0 mL，磷酸二氫鉀0.02 g，硫酸鎂0.02 g，硝酸鈉0.3 g。

1.3 儀器設備

恒溫培養(yǎng)箱、721型紫外分光光度計、電磁爐、高溫高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫水浴鍋、超凈工作臺、電泳儀、純水儀、離心機等。

1.4 試驗方法

1.4.1 霉菌的分離與純化

1.4.1.1 分離方法

稀釋涂布平板法：分別稱取5 g不同的甜酒曲于50 mL帶玻璃珠的無菌生理鹽水中，在搖床中振蕩30 min，靜置10 min。再用移液槍分別吸取1 mL上清液于9 mL無菌生理鹽水中，充分振蕩后得到10-2的稀釋液，以此類推，分別稀釋至10-3、10-4、10-5。接種梯度為10-3、10-4、10-5，以上梯度分別吸取0.2 mL稀釋液于PDA培養(yǎng)基的平板上進行均勻涂布，做好標記，每個稀釋度做3個平行。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)1～2 d。

1.4.1.2 純化方法

平板劃線法：將分離出的不同菌落形態(tài)的霉菌進行編號，描述菌落形態(tài)并計數，然后在超凈工作臺中挑取各個編號的單菌落在相應的平板上進行劃線，做好標記，每株菌做兩個平行。劃線后置于相應溫度恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。菌種培養(yǎng)條件參照1.4.1.1。

1.4.2 平板透明圈初篩

將試管斜面上生長良好的霉菌孢子點接到平板透明圈培養(yǎng)基上，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)36～48 h，然后分別測定HC值。

1.4.3 比色法測定霉菌糖化酶活力[5]

1.4.3.1 固體發(fā)酵培養(yǎng)

稱取相當于絕干重10 g的麩皮，按比例依次稱取試劑，潤料2 h，然后于121℃下滅菌30 min，趁熱打散，冷卻至30℃左右，加入1 mL孢子懸液，混勻后于30℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h（18～24 h時扣瓶）左右。

1.4.3.2 粗酶液的提取

于發(fā)酵完畢的三角瓶中，加入35℃的水至加緩沖溶液后的總體積為200 mL[加水量=(200-20-試樣中的水量)mL]。然后加入20 mL pH4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分攪勻，35℃保溫浸泡l h。保溫期間每隔15 min攪拌1次。用脫脂棉過濾，棄去數毫升初濾液，得澄清濾液供測定用。

1.4.3.3 葡萄糖標準曲線的繪制

準確稱取1.00 g葡萄糖，定容至1000 mL，得到l mg/mL的葡萄糖儲存液，分別吸取0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL的葡萄糖溶液，分別加入蒸餾水10 mL、9 mL、8 mL、7 mL、6 mL、5 mL，制成系列不同濃度的標準液，取l mL標準液，加入1.5 mL的DNS試劑，在沸水浴中加熱5 min，立即用水冷卻，然后用蒸餾水定容至25 mL，混勻，在波長520 nm處測定吸光度值。繪制反應液中的葡萄糖含量與吸光度值的關系曲線。以不加葡萄糖的反應液作為對照。

1.4.3.4 酶活測定

取5 mL 2%可溶性淀粉溶液于試管中，然后加入5 mL稀釋10倍的粗酶液，40℃保溫反應10 min，立即在沸水浴中煮沸，停止反應。取反應液l mL，加入l mL蒸餾水，然后加入1.5 mL的DNS顯色劑，在沸水浴中加熱5 min，立即用水冷卻，定容至25 mL，混勻，在波長520 nm處測定其吸光度值。以蒸餾水作對照。

1.4.3.5 酶活定義

1 g絕干曲在40℃、pH4.6條件下1 h生成l mg葡萄糖為1個酶活單位，U/g干曲。

計算公式：X=N×60/10×V÷M×A÷k

式中：X，為酶活力單位，U/g；N，為干曲稀釋倍數；60/10，為定義時間與實際反應時間之比；V，為粗酶液定容體積；M，為所取用于反應的酶液體積；A，為實際所測樣品的吸光度值；k，為標準曲線的斜率。

1.4.4 目標菌株的分子生物學鑒定

以目標菌株的基因組DNA為模板，經PCR擴增后電泳。將擴增出的18S rDNA序列與GenBank數據中的序列進行對比，應用MEGA 6軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，找出和該菌株相近的種、屬[6-8]。

2 結果與分析

2.1 分離與純化

根據稀釋涂布平板上單菌落的形態(tài)特征初步選定7株霉菌進行初篩。圖1為部分菌落平板圖片。

圖1 部分霉菌純化圖

2.2 菌株的初篩

將分離純化的霉菌孢子分別點接到平板透明圈培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)36～48 h，然后分別測定HC值，結果見表1。

表1 7株霉菌的HC值

通過透明圈法對分離出的7株霉菌進行初步篩選。淀粉透明圈培養(yǎng)基中的淀粉被根霉分泌出的淀粉酶分解后，菌落周圍會產生透明圈，淀粉酶活力越強，透明圈越大，反之越小[9]。由表1可以看出，HC值＞2的有3株，3#霉菌HC值最大為2.32，其次是7#霉菌，為2.16，6#霉菌為2.08，HC值＜2的有5株。選擇HC值＞2的菌株，即3#、6#、7#霉菌進行復篩。

2.3 酶活測定

2.3.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線如圖2，結果表明，曲線的線性相關性很好，對曲線作回歸分析得相關系數R2=0.9901，回歸方程式為y=0.9480x-0.0250，式中：y表示測定的吸光度(OD值)；x表示還原糖的濃度，mg/mL；0.0250表示補償參數。

圖2 葡萄糖標準曲線

2.3.2 比色法測定糖化酶活力（表2）

表2 糖化酶活力的測定

由表2可知，3#霉菌糖化酶活力最高，為1972.2 U/g，這與平板透明圈初篩結果一致，所以選擇3#霉菌作為目標菌株進行分子生物學鑒定[9-10]。

2.4 目標菌株的分子生物學鑒定

將3#霉菌擴增得到的18S rDNA序列與Gen-Bank數據庫中的序列進行比較，從GenBank中獲得和該菌株序列相近種、屬的18S rDNA序列，應用MEGA5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。

由圖3可看出，菌株3#與米根霉的同源性最高，相似度達99%，可確定3#為Rhizopus oryzae。

圖3 3#菌株18S rDNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹

以3#霉菌的基因組DNA為模板，經PCR擴增18S rDNA序列，大小為603 bp，其電泳檢測結果見圖4。

圖4 3#菌株PCR產物電泳圖

3 結論

本試驗從4種不同的甜酒曲中共分離出7株霉菌。分別采用平板透明圈法、比色法測定所有菌株的糖化酶活力，篩選到1株高產淀粉酶的3#霉菌，糖化酶活力達1972.2 U/g。將3#霉菌擴增得到的18S rDNA序列與GenBank數據庫中的序列進行比較，從GenBank中獲得和該株序列相近種、屬的18S rDNA序列，應用MEGA5軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，得出菌株3#與米根霉的同源性最高，相似度達99%，可確定3#霉菌為米根霉（Rhizopus oryzae）。