小鼠免疫細(xì)胞流式染色過程中細(xì)胞丟失量的影響因素

郜珊珊，伍 俊，周 娟，袁祖貽，王麗君

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西省分子心臟病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境與疾病相關(guān)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710061；2. 西安高新醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西西安 716000)

多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展都與系統(tǒng)性慢性炎癥有關(guān)，如動脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和過敏性哮喘等[1]。巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞和炎性因子參與其發(fā)病[2-4]，CD4+T細(xì)胞各亞群在其中發(fā)揮著十分重要的作用[4]。對不同CD4+T細(xì)胞亞群的檢測和計(jì)數(shù)是研究此類疾病發(fā)生發(fā)展的重要方法之一。流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry, FCM)是一種可以對細(xì)胞的多種特性進(jìn)行快速分析和定量的技術(shù)，而多色流式細(xì)胞術(shù)可以通過細(xì)胞內(nèi)成分檢測技術(shù)與多色免疫熒光標(biāo)記方法相結(jié)合來鑒定和分析目的細(xì)胞亞群，從而快速分析數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞及其亞群[5-6]，因而成為了CD4+T細(xì)胞亞群檢測分析的最常用方法之一。但在CD4+T細(xì)胞亞群的染色和標(biāo)記過程中包括了胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和破膜，這種多色標(biāo)記方法步驟較多[6]，每一步都會造成一定量的細(xì)胞損傷和丟失，在此過程中，如何盡量減少細(xì)胞數(shù)量丟失是一個值的注意的問題。本研究對小鼠免疫細(xì)胞流式染色過程中細(xì)胞丟失量的影響因素進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料 C57BL/6J鼠購于于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司，商品化流式細(xì)胞染色緩沖液(Flow Cytometry Staining Buffer, FCSB)購自eBioscience公司，紅細(xì)胞裂解液購自天根生化科技有限公司，配置緩沖液的各種化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀來自深圳博大博聚科技有限公司，200目鋼濾網(wǎng)和研磨器購自陜西先鋒生物科技有限公司，微量移液器購自Eppendorf公司，Olympus倒置相差顯微鏡、Heraeus臺式高速低溫離心機(jī)、MP220-PH計(jì)等來自西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室。

1.2 脾臟淋巴細(xì)胞懸液制備 ①無菌條件下剪開小鼠左上腹皮膚并分離肌肉，充分暴露脾臟后小心剝?nèi)?；②用預(yù)熱到37 ℃的無血清RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗脾臟，小心剔除筋膜和脂肪組織；③然后將脾臟轉(zhuǎn)移到200目的鋼濾網(wǎng)上進(jìn)行充分研磨，用4 mL RPMI 1640培養(yǎng)液沖洗并將細(xì)胞全部沖出；④收集細(xì)胞懸液到15 mL離心管中，并加入紅細(xì)胞裂解液至10 mL；⑤混勻后靜置5 min，使紅細(xì)胞被充分裂解，1 500 r/min離心5 min；⑥棄去上清，4 mL RPMI 1640培養(yǎng)液重懸洗滌細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min(若紅細(xì)胞裂解不完全，可再重復(fù)裂解1～2次)；⑦棄去上清，2 mL含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；⑧全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至10×106/mL待用；

1.3 細(xì)胞洗滌和計(jì)數(shù) ① 取10×106細(xì)胞量分別加入離心管，1 500 r/min離心5 min；②棄去上清，加入1 mL緩沖液(PBS配方見表1)，輕柔吹打重懸細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min；③重復(fù)上述洗滌步驟，1 500 r/min離心5 min；④棄去上清，加入500 μL緩沖液重懸細(xì)胞；⑤全自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)量，每個樣本重復(fù)計(jì)數(shù)3次取平均值。

表1 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)配方表

2 結(jié) 果

2.1 緩沖液種類對細(xì)胞丟失量的影響 以FCSB為對照，結(jié)果表明，在其他條件相同的情況下，不同種類的緩沖液洗滌對細(xì)胞丟失量有顯著影響(F=45.32，P<0.05)，其中RPMI 1640洗滌后細(xì)胞量并無明顯丟失，而PBS洗滌后的細(xì)胞則丟失明顯(P<0.05，圖1)。

圖1 不同種類緩沖液洗滌對細(xì)胞丟失量的影響

Fig.1The effect of different washing buffers on cell loss

Error bar=s，*P<0.05vs. FCSB。

2.2 PBS緩沖液成分對細(xì)胞丟失量的影響 以FCSB為對照，在其他條件相同的情況下，不同配方的PBS緩沖液洗滌對細(xì)胞丟失量有明顯影響(F=74.39，P<0.05)，PBS 1和PBS 2洗滌2次后，細(xì)胞量顯著減少(P<0.05，圖2)，而PBS 3洗滌后則幾乎沒有細(xì)胞丟失，與FCSB洗滌后相比無明顯差異。

圖2 不同配方PBS緩沖液洗滌對細(xì)胞丟失量的影響

Error bar =s，*P<0.05vs. FCSB。

2.3 緩沖液pH值對細(xì)胞丟失量的影響 前述結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)PBS 3洗滌2次后幾乎沒有細(xì)胞丟失，效果與FCSB相仿。為了觀察不同pH值緩沖液洗滌對細(xì)胞丟失的影響，我們將PBS 3緩沖液的pH值分別設(shè)定為不同值，結(jié)果顯示pH值改變(7.2～7.5)對細(xì)胞丟失量并無明顯影響(F=0.278，P>0.05，圖3)。

圖3 不同pH值緩沖液洗滌對細(xì)胞丟失量的影響

Error bar =s

2.4 緩沖液中加入FBS或BSA對細(xì)胞丟失量的影響 為了確認(rèn)緩沖液中加入FBS或BSA對細(xì)胞是否有較好的保護(hù)作用，能夠有效減少細(xì)胞丟失，我們在PBS 2緩沖液中分別加入的FBS或BSA，觀察其對細(xì)胞丟失的影響。結(jié)果顯示PBS緩沖液中加入FBS或BSA并不能顯著減少細(xì)胞丟失(F=0.95，P>0.05，圖4)。

圖4 緩沖液中含有FBS或BSA對細(xì)胞丟失量的影響

2.5 離心機(jī)轉(zhuǎn)速對細(xì)胞丟失量的影響 在其他條件相同的情況下，以商品化流式抗體公司推薦的離心機(jī)轉(zhuǎn)速1 500 r/min為對照，觀察了不同離心機(jī)轉(zhuǎn)速對細(xì)胞丟失量的影響。結(jié)果顯示，離心機(jī)的不同轉(zhuǎn)速對細(xì)胞丟失量有顯著影響(F=151.05，P<0.05)，轉(zhuǎn)速過高或過低均會導(dǎo)致細(xì)胞丟失(P<0.05，圖5)。

圖5 離心機(jī)轉(zhuǎn)速對細(xì)胞丟失量的影響

Error bar =s,*P<0.05vs. 1 500 r/min。

3 討 論

多色流式細(xì)胞術(shù)是目前在免疫學(xué)細(xì)胞表型研究中使用非常廣泛的研究技術(shù)，其能夠允許在單個細(xì)胞的基礎(chǔ)上同時檢測多個參數(shù)[7]，使用多色標(biāo)記的抗體可以進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色，從而快速分析數(shù)以萬計(jì)的細(xì)胞及其亞群[5-6]，因而成為了CD4+T細(xì)胞亞群檢測分析的最常用方法之一。胞內(nèi)細(xì)胞因子的多色染色標(biāo)記步驟繁多且影響因素較多[6,8]，有些步驟還需要使用破膜劑，每一步都會造成一定量的細(xì)胞損傷和丟失，在此過程中，如何盡量減少細(xì)胞損失是一個值得關(guān)注的問題。

在本研究中，對小鼠免疫細(xì)胞流式染色過程中細(xì)胞丟失量的影響因素進(jìn)行了探討。以商品化的流式細(xì)胞緩沖液FCSB為對照，觀察到在其他條件相同的情況下，不同配方的PBS緩沖液洗滌對細(xì)胞丟失量有明顯的影響，PBS 1和PBS 2洗滌2次后，細(xì)胞量顯著減少，而PBS 3洗滌后則幾乎沒有細(xì)胞丟失，與FCSB相比無明顯差異。分析3種PBS緩沖液的成分，我們發(fā)現(xiàn)其主要區(qū)別在于PBS 3不含鉀離子(K+)，而含K+的最多的PBS 2洗滌細(xì)胞丟失量最多，提示我們PBS緩沖液中的K+含量可能是影響細(xì)胞丟失的一個重要因素。我們推測，可能是由于緩沖液中過高的K+損傷細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞破碎，從而造成細(xì)胞丟失，因此在流式細(xì)胞染色過程中推薦使用不含K+的PBS緩沖液。

本研究還觀察了不同pH值的PBS緩沖液洗滌對細(xì)胞丟失量的影響，結(jié)果顯示，無論是偏酸性的pH=7.2 PBS緩沖液還是偏堿性的pH=7.5 PBS緩沖液洗滌，均未見對細(xì)胞丟失量有明顯的影響，說明在小鼠免疫細(xì)胞的流式細(xì)胞染色過程中，對緩沖液的pH值要求并不需要過于精確，一定范圍內(nèi)微量偏移對細(xì)胞丟失來說并無顯著影響。而RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌后盡管細(xì)胞幾乎沒有丟失，與FCSB相仿，說明其對細(xì)胞的保護(hù)作用良好，但由于RPMI 1640培養(yǎng)基含有酚紅指示劑，在pH=7.4的中性條件下屬于有色液體，并且其成分過于復(fù)雜，不利于后續(xù)的染色標(biāo)記和最終上機(jī)檢測效果，因此并不推薦用作流式細(xì)胞緩沖液替代品。

除此之外，為了確認(rèn)緩沖液中加入FBS或BSA后是否能夠?qū)?xì)胞有較好的保護(hù)作用，進(jìn)而有效減少細(xì)胞丟失，本研究還在PBS 2緩沖液中分別加入FBS或BSA，結(jié)果顯示，PBS緩沖液中加入FBS或BSA并不能顯著減少細(xì)胞丟失，因此小鼠免疫細(xì)胞的流式染色過程中并不推薦常規(guī)加入FBS或BSA。在其他條件相同的情況下，本研究還分析了不同離心機(jī)轉(zhuǎn)速對細(xì)胞丟失量的影響，結(jié)果顯示離心機(jī)轉(zhuǎn)速過高或者過低均會導(dǎo)致顯著的細(xì)胞丟失，這可能是由于過低的轉(zhuǎn)速下細(xì)胞沉淀不充分，因此在棄去上清液的時候會導(dǎo)致細(xì)胞丟失，而過高的轉(zhuǎn)速則會導(dǎo)致活細(xì)胞破碎，從而造成細(xì)胞丟失，因此，建議離心轉(zhuǎn)速保持在1 500～3 000 r/min之間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好。

綜上所述，在小鼠免疫細(xì)胞的流式染色標(biāo)記過程中，建議使用不含K+的PBS緩沖液，同時保持離心轉(zhuǎn)速適中，否則容易造成細(xì)胞數(shù)量的顯著丟失，從而影響后期的檢測結(jié)果。而緩沖液pH值的微量偏移或加入FBS/BSA對細(xì)胞數(shù)量的丟失并無明顯影響。