肉桂多酚對鏈脲佐菌素致糖尿病小鼠的保護作用

廖作莊，徐靈源，王金妮，譚宏棣，韋麗美

(1. 廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，廣西南寧 530007；2. 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西百色 533000)

1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM)是由于胰腺組織的β細胞自身免疫損傷導致胰島素分泌不足或機體對胰島素反應性降低所致的一種慢性代謝性疾病，青春期少年屬于易發(fā)人群。T1DM若治療不當或不及時，將會產(chǎn)生嚴重的并發(fā)癥，進而影響患者的生活質(zhì)量，甚至導致死亡。因此，保護胰島β細胞、促進胰島素分泌、控制血糖對治療和預防糖尿病具有極其重要的意義[1]。在臨床實踐中，化學藥物和胰島素注射是常見的抗T1DM治療方案，但因產(chǎn)生的耐藥性和難以控制的副作用限制了其長期使用。因此，長效低毒的替代藥品亟待開發(fā)。傳統(tǒng)中藥是以中醫(yī)藥理論為指導，應用于防治相關(guān)疾病的天然藥物及其制品，因其具有獨特的療效和低副作用而得到應用與開發(fā)[2]。

肉桂又稱陰香、天竺桂、細葉香桂等，是樟科植物肉桂的干燥樹皮，具有補火助陽、散熱止痛、溫通經(jīng)脈的功效，是廣西的地道藥材，也是一種常用的食品香料或烹飪調(diào)料。肉桂中含有肉桂醛、肉桂酸、多酚類、黃酮類和香豆素等活性成分，具有降糖、調(diào)脂、改善胰島素抵抗、擴血管及抗血小板聚集等作用。肉桂多酚是肉桂的活性成分之一，包括多種兒茶素、表兒茶素類單體化合物及其糖苷[3]。藥物化學分析和藥理學研究發(fā)現(xiàn)，肉桂中含有的黃烷醇等活性多酚類抗氧化物質(zhì)，具有穩(wěn)定血糖、降低胰島素抵抗及增強胰島素的活性[4]。本課題組前期研究表明，肉桂多酚通過修復糖尿病小鼠胰腺β細胞數(shù)量而發(fā)揮降血糖作用[5]。然而，肉桂多酚促進胰島素分泌的分子機制尚未明了。研究表明，活化的AKT通過磷酸化多種酶、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等下游因子，進而調(diào)節(jié)細胞的功能和葡萄糖的代謝[6]。本實驗通過建立鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病小鼠模型，觀察肉桂多酚對STZ致糖尿病小鼠胰島細胞的保護作用并探討其分子機制，為尋找治療和預防T1DM的新靶點和新藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性SPF級昆明小鼠，6～7周齡，體質(zhì)量(25±2)g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物許可證號：SCXK桂2009-0002。適應性飼養(yǎng)1周后，開展相關(guān)動物實驗。

1.2 藥物與試劑 STZ(美國Sigma-Aldrich公司，批號9008201612)，鹽酸二甲雙胍片(鄭州泰豐制藥有限公司，批號20174087)，血糖測試條(艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司，批號 2016047)，C反應蛋白和胰淀粉酶試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號 2017023、2017068)，小鼠胰島素和胰高血糖素ELISA試劑盒(艾萊薩生物科技(上海)有限公司，批號 2017013、2017018)，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，碧云天生物技術(shù)有限公司，批號WB1208)，AKT多克隆抗體(美國Santa Cruz Biotechnology，批號SC-1259)，山羊抗兔IgG-HRP抗體(碧云天生物技術(shù)有限公司，批號20170436)，預染蛋白Marker(北京索萊寶科技有限公司，批號1204762)。

1.3 儀器 5810R高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，722S紫外分光光度計(北京精密科學儀器有限責任公司)，F(xiàn)ZG-15型多用途烘箱(貴陽新奇微波工業(yè)有限責任公司)，Mini-PROTEAN垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜及顯影設(shè)備(美國BIO-RAD公司)，iMark酶免分析儀(美國BIO-RAD公司)，CX41正置光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.4 方法

1.4.1 制備肉桂多酚[5]肉桂經(jīng)右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院劉春榮副主任中藥師考證為樟科植物肉桂的干燥樹皮。500 g粉末用4 500 mL 700 mL/L乙醇(1∶10；m/V)萃取3次，并加熱回流(80 ℃)2 h。將粗提物濃縮，懸浮于蒸餾水中并分離，依次為氯仿(1∶8；V/V)和正丁醇(1∶4；V/V)。對正丁醇中的萃取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中在60 ℃下蒸發(fā)，合并萃取液。經(jīng)過Folin-Ciocaheu驗證方法，鑒定肉桂多酚提取物的終產(chǎn)物為45.96 g(9.215%，W/W)。

1.4.2 建立STZ糖尿病小鼠模型 經(jīng)血檢排除自發(fā)高血糖小鼠，并在造模前禁食12 h，經(jīng)腹腔注射新鮮配制的STZ溶液(240 mg/kg)。待48 h后，尾靜脈采血測空腹血糖(FBG)值，并選取FBG≥11.1 mol/L的小鼠認定為T1DM小鼠[5]。

1.4.3 給藥方案 對選取的STZ糖尿病小鼠進行隨機分組(n=10)：糖尿病對照組、二甲雙胍陽性組(0.3 g/kg)及肉桂多酚低、中、高劑量組(0.3、0.6、1.2 g/kg)。同時，設(shè)置正常對照組(n=10)。使用劑量參照有關(guān)文獻制定[5]，每天灌胃給予肉桂多酚，正常對照組和模型對照組給予等量雙蒸水，持續(xù)灌胃至14 d。

1.4.4 生化指標檢測 末次給藥后，血糖試紙測定FBG值，生化法測定血清中胰淀粉酶含量，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定血清中胰島素和胰高血糖素濃度。所有實驗步驟均按照廠家附件說明書嚴格操作。

1.4.5 免疫組化法檢測胰島素陽性細胞 石蠟包埋的胰腺組織制備成5 μm切片，經(jīng)二甲苯脫蠟梯度乙醇脫水后，50 g/L牛血清白蛋白(BSA)封閉1 h后，用稀釋的兔抗胰島素(1∶200，博士德生物，批號P35568)4 ℃過夜孵育。切片經(jīng)清洗后，經(jīng)即用型SABC-POD(小鼠/兔IgG)(博士德生物，批號SA1020)試劑盒進行二抗孵育和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色，蘇木素核復染。選取5個不重復的視野計算胰島素陽性細胞數(shù)量，進行數(shù)據(jù)分析。

1.4.6 蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測AKT及其磷酸化水平 取新鮮胰腺組織分離蛋白，經(jīng)BCA法測定蛋白濃度。每組40 μg蛋白上樣，經(jīng)100 g/L聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜。50 g/L脫脂奶粉封閉1 h，用稀釋的兔抗AKT、AKTser473、GAPDH(1∶1 000，博士德生物，批號A00024、BM4838、A00227)4 ℃過夜孵育。洗滌后，使用HRP標記的二抗對膜進行顯色。條帶成像和數(shù)據(jù)分析使用伯樂公司的凝膠成像系統(tǒng)SYSTEM GelDoc XR+完成。

2 結(jié) 果

2.1 肉桂多酚對STZ糖尿病小鼠血糖和胰淀粉酶濃度的影響 實驗結(jié)果顯示，與正常對照小鼠比較，STZ致糖尿病小鼠血糖(FBG)顯著上升(P<0.05)，同時血清胰淀粉酶含量明顯增加(P<0.05)。經(jīng)二甲雙胍和肉桂多酚干預14 d后，小鼠FBG水平與STZ致糖尿病小鼠比較有了明顯的降低(P<0.05)，同時血清中胰淀粉酶濃度降低(P<0.05)，且表現(xiàn)出一定的劑量關(guān)系(表1)。

表1 肉桂多酚對STZ糖尿病小鼠血糖和胰淀粉酶濃度的影響

與正常對照組比較，*P<0.05；與STZ模型組比較，#P<0.05。

2.2 肉桂多酚對STZ糖尿病小鼠血清胰島素和胰高血糖素濃度的影響 ELISA實驗結(jié)果顯示，與正常對照小鼠比較，STZ致糖尿病小鼠血清中胰島素顯著降低(P<0.05)，同時血清中胰高血糖素濃度明顯增加(P<0.05)。經(jīng)二甲雙胍和肉桂多酚干預14 d后，與STZ致糖尿病小鼠比較，小鼠血清中胰島素水平有了明顯增加(P<0.05)，同時血清中胰高血糖素濃度降低(P<0.05)，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性(圖1)。

圖1 肉桂多酚對STZ糖尿病小鼠血清胰島素和胰高血糖素濃度的影響

與正常對照組比較，*P<0.05；與STZ模型組比較，#P<0.05。

2.3 肉桂多酚對STZ糖尿病小鼠胰島細胞中胰島素陽性細胞數(shù)量的影響 免疫組化分析表明，與正常對照組比較，STZ糖尿病小鼠胰島組織中胰島素陽性細胞數(shù)量顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)二甲雙胍和肉桂多酚干預14 d后，胰島組織中胰島素陽性細胞數(shù)量顯著增加，與STZ組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 肉桂多酚對STZ胰島細胞中胰島素陽性細胞計數(shù)的影響

與正常對照組比較，*P<0.05；與STZ模型組比較，#P<0.05。

2.4 肉桂多酚對STZ糖尿病小鼠胰腺細胞中AKT蛋白及其磷酸化水平的影響 Western blot分析表明，與正常對照組比較，STZ糖尿病小鼠胰腺組織中AKT蛋白及其磷酸化水平明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。經(jīng)二甲雙胍和肉桂多酚干預14 d后，胰腺組織中AKT蛋白及其磷酸化水平明顯上調(diào)，與STZ組比較，差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)。

圖3 肉桂多酚對STZ胰腺細胞中AKT蛋白及其磷酸化水平的影響

與正常對照組比較，*P<0.05 ；與STZ模型組比較，#P<0.05。

3 討 論

糖尿病是一種長期存在高血糖水平的代謝性疾病，如果得不到及時治療，可引起許多并發(fā)癥，如酮癥酸中毒、慢性腎衰竭、足部潰瘍和眼睛失明等[7-8]。其中T1DM導致胰腺衰竭，產(chǎn)生病理性胰島素分泌不足[9]。臨床上，最常用的是胰島素注射或化學藥物治療，但都因其具有較大的副作用而限制了長期用藥。中藥降糖作用具有多靶點、多向性、多途徑，且作用溫和持久，并能延緩并發(fā)癥發(fā)生等優(yōu)點。因此，開發(fā)中藥活性成分的抗糖尿病作用是當前的潛在干預策略之一。

基礎(chǔ)數(shù)據(jù)分析表明，STZ糖尿病小鼠空腹血糖和胰淀粉酶水平均明顯增加，提示STZ對胰腺細胞具有靶向毒性作用。二甲雙胍組和肉桂多酚組干預14 d后，小鼠血糖(FBG)水平與STZ致糖尿病小鼠比較有了明顯的降低，同時血清中胰淀粉酶濃度降低，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，表明肉桂多酚具有明顯的降血糖效應。

胰島素是由胰島β細胞產(chǎn)生的肽激素，調(diào)節(jié)碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)的代謝，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵的調(diào)控作用[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)二甲雙胍和肉桂多酚干預后的STZ糖尿病小鼠血清胰島素水平逐漸升高，且表現(xiàn)為一定的劑量依賴性。此外，胰島組織中的胰島素陽性細胞數(shù)量在肉桂多酚干預下也逐漸增加，提示促進胰島細胞分泌胰島素是肉桂多酚抗糖尿病活性的直接藥理活性之一。

蛋白激酶B(AKT)是絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，其在多種細胞的生理過程如葡萄糖代謝、凋亡、細胞增殖、轉(zhuǎn)錄和細胞遷移中起關(guān)鍵作用。AKT是胰島素誘導的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4(GLUT4)向質(zhì)膜易位所必需的。 此外，糖原合成酶激酶3(GSK-3)可被AKT磷酸化抑制，導致糖原合成增加[11]。因此，激活胰腺細胞中AKT信號通路有助于調(diào)節(jié)機體糖代謝穩(wěn)態(tài)和胰島細胞生長。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)二甲雙胍和肉桂多酚干預后的STZ糖尿病小鼠胰島組織中的AKT及其磷酸化水平明顯上調(diào)，且表現(xiàn)出一定的劑量依賴性，提示誘導胰島細胞AKT調(diào)控因子表達是肉桂多酚抗糖尿病的分子作用機制之一。

綜上所述，我們推測肉桂多酚的降血糖藥理活性與激活胰島細胞中的AKT通路有關(guān)，從而刺激胰島素分泌發(fā)揮具抗糖尿病生物活性。