• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    3種碳源條件下香蕉枯萎病菌次生代謝物合成基因的表達譜分析

    2019-01-09 07:09:43趙艷娟趙亞娟劉駿麒金天程卯黃立鈺王振中秦世雯
    熱帶作物學報 2019年12期
    關(guān)鍵詞:基因表達

    趙艷娟 趙亞娟 劉駿麒 金天 程卯 黃立鈺 王振中 秦世雯

    摘? 要? 在前期獲得的香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,本研究利用antiSMASH、PHI-base數(shù)據(jù)庫對3種碳源條件下香蕉枯萎病1號小種(Foc 1)和4號小種(Foc 4)表達的次生代謝物合成基因進行了預(yù)測和表達譜分析。結(jié)果表明:3種碳源條件下,F(xiàn)oc共有486個候選的次生代謝物合成基因表達,并分類到32個次生代謝產(chǎn)物合成基因簇,其中13個基因可能與Foc的致病性相關(guān)。此外,F(xiàn)oc在3種碳源條件下次生代謝物合成基因的表達模式存在明顯差異,特別是在寄主細胞壁條件下Foc差異表達的次生代謝物合成基因最多;而且Foc 4相較于Foc 1在侵染寄主細胞壁時有更多的次生代謝物合成基因特異表達或高表達。以上研究結(jié)果將為進一步明確次生代謝產(chǎn)物在Foc致病過程中的作用機理提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞? 香蕉枯萎病;尖孢鐮刀菌古巴?;?次生代謝物;基因表達

    中圖分類號? S432.1; S668.1? ? ? ?文獻標識碼? A

    Expression Analysis of Genes Involved in Biosynthesis of Secondary Metabolites for Fusarium oxysporum f. sp. cubense in Response to Three Carbon Sources

    ZHAO Yanjuan1, ZHAO Yajuan2, LIU Junqi1, JIN Tian1, CHENG Mao3, HUANG Liyu1, WANG Zhenzhong2*, QIN Shiwen1*

    1. School of Agriculture, Yunnan University / Research Center of Perennial Rice Engineering and Technology in Yunnan, Kunming, Yunnan 650500, China; 2. College of Agriculture, South China Agricultural University / Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Signals and Disease Control, Guangzhou, Guangdong 510642, China; 3. Jinghong Center of Agricultural Technology Extension, Jinghong, Yunnan 666101, China

    Abstract? To understand the pathogenesis mechanism of secondary metabolites for Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc) during infection in banana, genes involved in the biosynthesis of secondary metabolites were predicted based on the transcriptome of Foc 1 and Foc 4 in response to different carbon sources, using antiSMASH and PHI-base database. 486 genes involved in the biosynthesis of secondary metabolites in the transcriptome were identified and sorted to 32 gene clusters, including 13 virulence-associated genes. Additionally, the gene expression pro?les involved in the biosynthesis of secondary metabolites of Foc 1 and Foc 4 in response to different carbon sources appeared remarkably different. A great majority of genes were differentially expressed in Foc when induced by host cell wall. Besides, more specific differentially expressed genes with high transcription level were identified in Foc 4 as comparison with Foc 1 during the degradation of banana cell wall. The results would provide a theoretical basis for understanding and studying the molecular pathogenesis mechanism of Foc.

    Keywords? Fusarium wilt; Fusarium oxysporum f. sp. cubense; secondary metabolites; gene expression

    DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.018

    香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?;停‵usarium oxysporum f. sp. cubense, Foc)引起的香蕉維管束病害,給全世界香蕉產(chǎn)業(yè)帶來了嚴重的危害[1]。該病菌1號小種(Foc 1)曾導致香蕉主栽品種‘大蜜哈的毀滅,直到抗1號小種的Cavendish香蕉品種應(yīng)用,世界香蕉生產(chǎn)才得以峰回路轉(zhuǎn)。但是,近半個世紀來,侵染Cavendish香蕉的4號小種(Foc 4)出現(xiàn)迅速蔓延,使香蕉產(chǎn)業(yè)重新面臨嚴重的困境[2]。因此,研究Foc的致病機理及其2個小種的致病性分化機制,將為香蕉枯萎病防治技術(shù)研發(fā)提供新的途徑。

    毒素是香蕉枯萎病菌的主要致病因子之一[3-5]。Foc分泌細胞壁降解酶突破寄主細胞壁,隨后在寄主根部維管束組織內(nèi)大量增殖,并沿著維管束向根莖和假莖部分蔓延,堵塞木質(zhì)部導管,阻礙水分和營養(yǎng)的運輸,同時產(chǎn)生真菌毒素(如鐮刀菌酸和脫氫鐮刀菌酸等)造成維管束壞死和葉片黃化,最終導致植株枯萎死亡[6]。

    大部分真菌毒素屬于次生代謝產(chǎn)物(secondary metabolites, SMs),如白僵菌素(beauvericin, BEA)和鐮刀菌酸(fusaric acid, FA)[7-8]。真菌毒素能夠破壞寄主細胞膜,影響寄主正常的代謝過程,導致寄主生理失調(diào)和細胞死亡,在死體營養(yǎng)型真菌的致病過程中起著決定性作用[9]。毒素的生物合成是由一系列基因簇(secondary metabolite gene clusters, SMC)控制,包括非核糖體多肽合成酶(nonribosomal peptide synthetase, NRPS)和聚酮合成酶(polyketide synthase, PKS)基因,其他酶類(如氫化酶、氧化酶和轉(zhuǎn)運蛋白等)基因以及相關(guān)調(diào)控基因[10]。例如,白僵菌素主要是由BEA合成酶(NRPS)催化合成,并且鐮刀菌屬真菌BEA生物合成還需要一系列不同功能的SMC參與催化代謝[11];鐮刀菌酸的生物合成主要由FA基因簇中的聚酮合成酶Fub 1控制,敲除Fub1能夠使F. oxysporum f. sp. lycopersici不產(chǎn)生FA,并且顯著降低其對番茄的致病力[12]。

    本研究前期通過RNA-seq測序分析,成功獲得了3種碳源(寄主細胞壁、果膠和葡萄糖)條件下Foc 1和Foc 4的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),并發(fā)現(xiàn)在寄主細胞壁多糖條件下能有效模擬Foc侵染寄主的基因表達情況[13]。本研究將利用antiSMASH數(shù)據(jù)庫對該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行次生代謝物合成(secondary metabolism biosynthesis, SMB)基因的預(yù)測和表達分析,挖掘Foc致病相關(guān)的SMB基因,分析SMB基因在2個小種致病過程中的表達差異,為Foc致病基因的篩選和致病性分化的分子機理研究提供參考。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    本研究所用3種碳源條件下Foc 1和Foc 4轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由華南農(nóng)業(yè)大學植物病理生理研究室提供。該轉(zhuǎn)錄組測序所用菌株為香蕉枯萎病菌1號生理小種菌株C2和4號生理小種菌株DZ1。3種碳源分別為寄主細胞壁多糖的主要成分:寄主細胞壁(粉蕉細胞壁用于Foc 1菌株的培養(yǎng),以FCW表示;巴西蕉細胞壁用于Foc 4菌株的培養(yǎng),以BCW表示)、果膠(以P表示)和葡萄糖(以G表示)。該轉(zhuǎn)錄組raw reads序列已提交至NCBI,登錄號為SRA486974。

    1.2? 方法

    1.2.1? 次生代謝物合成基因的預(yù)測? 本研究利用antiSMASH數(shù)據(jù)庫對轉(zhuǎn)錄組23 147個unigene序列進行SMB基因預(yù)測,比對參數(shù)為默認值。

    1.2.2? 次生代謝物合成基因的致病相關(guān)性分析 本研究利用病原物與寄主互作數(shù)據(jù)庫PHI-base(http://www.phi-base.org/)對發(fā)掘的SMB基因的致病功能進行預(yù)測,比對閾值(e-value)為1e-5。

    1.2.3? 不同寄主細胞壁多糖條件下次生代謝物合成基因的表達分析? 對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行參考序列比對,基因表達水平進行FPKM(fragments per kilobase of exon model per million reads mapped)換算,隨后將基因差異表達數(shù)據(jù)進行標準化處理,最后進行基因差異表達水平DEGseq分析,差異表達基因(differentially expressed gene, DEG)的篩選閾值為q-value<0.005且|log2 (Fold Change)| >1。

    差異基因維恩圖的制作使用Draw Venn Diagrum軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ web t ools/Venn/);差異基因表達水平熱圖制作使用OmicShare Tools Heat map軟件(https://www.o micshare.com/ tools)。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 次生代謝物合成基因的預(yù)測

    本研究以不同的寄主細胞壁多糖條件下Foc 1和Foc 4的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行SMB基因分析,通過antiSMASH數(shù)據(jù)庫的注釋,共預(yù)測到486個unigene。其中,83個unigene被預(yù)測為SMC的主要合成基因,并分類到32個SMC中(表1)。32個SMC包括3個T1pks基因簇,1個T3pks基因簇,9個Nrps基因簇,1個Nrps-T1pks基因簇,10個Terpene基因簇,3個Indole基因簇和5個其他基因簇。根據(jù)上述SMB基因分析推測,3種碳源條件下Foc主要次生代謝物類型為I型聚酮、III型聚酮、T1pks-nrps聚酮、萜類和吲哚類。

    通過antiSMASH數(shù)據(jù)庫的預(yù)測,3個SMC(Cluster 4、Cluster 6和Cluster 21)預(yù)測到合成的次生代謝物核心結(jié)構(gòu),同時還發(fā)現(xiàn)Cluster 6和Cluster 21雖同為Nrps基因簇,但合成的次生代謝物組成單位存在明顯差異(圖1)。

    2.2? 次生代謝物合成基因的致病相關(guān)性分析

    通過PHI-base對486個SMB基因的致病功能進行分析預(yù)測(e-value≤105),結(jié)果發(fā)現(xiàn)有37個基因可能與Foc和寄主的互作相關(guān)(即PHI基因),其中13個SMB基因缺失后可能導致Foc致病性喪失或致病力減弱。結(jié)果還顯示,83個SMC主要合成基因在PHI-base中并無致病相關(guān)功能注釋。

    2.3? 3種碳源條件下次生代謝物合成基因的差異表達分析

    為了解次生代謝物在2個小種致病性分化中的作用,本研究對3種碳源條件下Foc 1和Foc 4的SMB基因表達情況進行分析,總共獲得6個比較組(FCW_Foc1 vs. G_Foc1、BCW_Foc4 vs. G_Foc4、BCW_Foc4 vs. FCW_Foc1、P_Foc4 vs. G_Foc4、P_Foc1 vs. G_Foc1和P_Foc4 vs. P_Foc1)的差異表達基因。結(jié)果表明,在3種碳源條件下Foc 1或Foc 4表達的SMB基因均存在明顯差異(圖2)。同時,相較于Foc 1,F(xiàn)oc 4在降解寄主細胞壁多糖時SMB基因的差異表達數(shù)量較多(表2)。而在同種碳源條件下,2個小種SMB基因的表達模式也存在明顯差異(圖2),具體表現(xiàn)在:Foc 4特異表達的SMB基因數(shù)量相較于Foc 1更多(圖2A、圖2B、圖2C和圖2D);在Foc 4中高表達的SMB基因在Foc 1中基本都低表達(圖2E)。

    上述結(jié)果表明,這些在Foc 4中特異表達或高表達的SMB基因可能參與Foc 4對Cavendish香蕉的侵染過程。

    A:寄主細胞壁條件下上調(diào)差異表達的次生代謝物合成基因;B:下調(diào)差異表達的次生代謝物合成基因;C:果膠條件下上調(diào)差異表達的次生代謝物合成基因;D:下調(diào)差異表達的次生代謝物合成基因。維恩圖非重疊部分為2個小種特異表達的次生代謝物合成基因(紅色數(shù)字)。E:3種碳源條件下香蕉枯萎病菌2個小種次生代謝物合成基因的差異表達熱圖以FPKM繪制。G:葡萄糖;P:果膠;FCW:粉蕉細胞壁;BCW:巴西蕉細胞壁。

    wall or pectin and Expression profiles of backbone genes from secondary metabolites synthesis gene clusters Heatmap

    A: Up-regulated differentially expressed secondary metabolite synthesis genes under host cell wall conditions; B: Down-regulated differentially expressed secondary metabolite synthesis genes under host cell wall conditions; C: Up-regulated differentially expressed secondary metabolite synthesis genes under pectin condition; D: Down-regulated differentially expressed secondary metabolite synthesis genes under pectin condition. The non-overlapping parts of the Venn diagram were the secondary metabolite synthesis genes (red number) specifically expressed by two Foc races. E: The differential expression heat map of the major secondary metabolite synthesis genes in two Foc races under three carbon sources was drawn by FPKM. G: Glucose; P: Pectin; FCW: Cell wall of Fenjiao cultivar; BCW: Cell wall of Brazil cultivar.

    3? 討論

    antiSMASH數(shù)據(jù)庫是預(yù)測微生物次生代謝物合成基因簇的綜合性數(shù)據(jù)庫,可實現(xiàn)基因組與基因組之間的相關(guān)天然產(chǎn)物合成基因簇的查詢[14]。PHI-base數(shù)據(jù)庫整合了大量病原真菌和卵菌在侵染寄主時具有互作功能的基因研究數(shù)據(jù)[15]。目前,這2種數(shù)據(jù)庫已廣泛利用于植物病原菌基因組和轉(zhuǎn)錄組的致病基因預(yù)測。通過antiSMASH和PHI-base數(shù)據(jù)庫對引起多種植物土傳病害的菜豆殼球孢(Macrophmina phaseolina)基因組分析發(fā)現(xiàn),該病原菌相對于F. oxysporum和F. graminearum擁有更多的致病酶類和毒素摧毀寄主防御,其中包括75個主要SMB基因和537個致病基因[16]。在小麥赤霉病菌(F. graminearum)與非致病型鐮刀菌(F. venenatum)的比較基因組研究中,利用antiSMASH、PHI-base等數(shù)據(jù)庫揭示了F. graminearum中5個特有的致病相關(guān)SMC參與了該菌侵染小麥的病程,另外2個PHI轉(zhuǎn)錄因子敲除后使其對小麥的致病力顯著降低[17-18]。

    本研究利用antiSMASH和PHI-base數(shù)據(jù)庫對3種碳源條件下Foc 1和Foc 4表達的次生代謝物合成基因進行了預(yù)測分析,發(fā)現(xiàn)了32個SMC,總共獲得486個候選的SMB基因(包含83個主要合成基因),但大部分SMB基因的功能未知。該結(jié)果與Foc 1和Foc 4基因組的SMC注釋結(jié)果基本相符[5]。Foc基因組中存在4個合成二甲基丙烯基色氨酸(DAMT)的基因簇,但在本研究中未發(fā)現(xiàn)合成DAMT的基因簇,可能是在突破寄主細胞壁防御時,DAMT合成途徑并不參與Foc與寄主互作過程。

    本研究發(fā)現(xiàn)3種碳源條件下Foc 1和Foc 4表達的13個SMB基因可能與其致病性相關(guān),但83個主要合成基因致病功能未獲得預(yù)測信息。這可能是由于SMB基因的功能在植物病原真菌中研究還較少,利用同源比對分析,從PHI-base收錄的致病基因中不能找到Foc主要SMB基因的同源基因。因此,進一步開展SMB基因功能驗證,將有助于深入了解次生代謝物在Foc致病過程中的作用。

    本研究發(fā)現(xiàn)在3種碳源條件下,F(xiàn)oc的SMB基因具有不同的表達模式,說明不同營養(yǎng)條件能夠影響Foc次生代謝物的合成。已有研究證明,F(xiàn)oc在PDA培養(yǎng)條件(in vitro)和侵染巴西蕉(in vivo)時SMB基因的表達存在明顯差異[5];而在水稻惡苗病菌(F. fujikuroi)中也發(fā)現(xiàn)了相似結(jié)果,該病菌次生代謝物的合成受不同氮源和植物信號的影響[19]。本研究還發(fā)現(xiàn),相較于Foc 1,F(xiàn)oc 4在侵染寄主細胞壁時有更多的次生代謝物合成基因特異表達或表達量升高,說明Foc 4能夠產(chǎn)生更多的次生代謝物來適應(yīng)不同的寄主環(huán)境,并成功侵染大部分香蕉主栽品種,這可能與2個小種寄主?;院椭虏⌒苑只芮邢嚓P(guān)。本研究結(jié)果將為進一步明確次生代謝產(chǎn)物在Foc致病性分化的作用提供參考依據(jù)。

    參考文獻

    Ploetz R C, Churchill A C L. Fusarium wilt: the banana disease that refuses to go away[J]. Acta Horticulturae, 2011, 897: 519-526.

    Ploetz R C. Management of Fusarium wilt of banana: A review with special reference to tropical race 4[J]. Crop Protection, 2015, 73: 7-15.

    [3]王振中. 香蕉枯萎病及其防治研究進展[J]. 植物檢疫, 2006, 20(3): 198-200..

    Bacon C W, Porter J K, Norred W P, et al. Production of fusaric acid by Fusarium species[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1996, 62(11): 4039-4043.

    Guo L, Han L, Yang L, et al. Genome and transcriptome analysis of the fungal pathogen Fusarium oxysporum f. sp. cubense causing banana vascular wilt disease[J]. PLoS One, 2014, 9(4): e95543.

    Ploetz R C. Fusarium wilt of banana[J]. Phytopathology, 2015, 105(12): 1512-1521.

    Friesen T L, Faris J D, Solomon P S, et al. Host-specific toxins: effectors of necrotrophic pathogenicity[J]. Cellular Microbiology, 2008, 10(7): 1421-1428.

    Friesen T L, Stukenbrock E H, Liu Z, et al. Emergence of a new disease as a result of interspecific virulence gene transfer[J]. Nature Genetics, 2006, 38(8): 953-956.

    Desjardins A E, Hohn T M. Mycotoxins in plant pathogenesis[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 1997, 10(2): 147-152.

    Keller N P, Hohn T M. Metabolic pathway gene clusters in filamentous fungi[J]. Fungal Genetics & Biology, 1997, 21(1): 17-29.

    Zhang T, Zhuo Y, Jia X P, et al. Cloning and characterization of the gene cluster required for beauvericin biosynthesis in Fusarium proliferatum[J]. Science China Life Sciences, 2013, 56(7): 628-637.

    López-Díaz C, Rahjoo V, Sulyok M, et al. Fusaric acid contributes to virulence of Fusarium oxysporum on plant and mammalian hosts: Fusaric acid promotes virulence of F. oxysporum[J]. Molecular Plant Pathology, 2018, 19(2): 440-453.

    Qin S, Ji C, Li Y, et al. Comparative Transcriptomic Analysis of Race 1 and Race 4 of Fusarium oxysporum f. sp. cubense Induced with Different Carbon Sources[J]. G3-Genes Genomes Genetics, 2017, 7(7): 2125-2138.

    Weber T, Kai B, Duddela S, et al. antiSMASH 3.0—a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters[J]. Nucleic Acids Research, 2015, 43(W1): W237-W243.

    Urban M, Cuzick A, Rutherford K, et al. PHI-base: a new interface and further additions for the multi-species pathogen–host interactions database[J]. Nucleic Acids Research, 2017, 45(Database issue): D604-D610.

    Islam M S, Haque M S, Islam M M, et al. Tools to kill: Genome of one of the most destructive plant pathogenic fungi Macrophomina phaseolina[J]. BMC Genomics, 2012, 13(1): 493.

    King R, Brown N A, Urban M, et al. Inter-genome comparison of the Quorn fungus Fusarium venenatum and the closely related plant infecting pathogen Fusarium graminearum[J]. BMC Genomics, 2018, 19(1): 269.

    [18]Son H, Seo YS, Min K, et al. A Phenome-based functional analysis of transcription factors in the cereal head blight fungus, Fusarium graminearum[J]. PLoS Pathogens, 2011, 7(10): e1002310.

    Wiemann P, Sieber C M K, Bargen K W V, et al. Deciphering the cryptic genome: genome-wide analyses of the rice pathogen Fusarium fujikuroi reveal complex regulation of secondary metabolism and novel metabolites[J]. PLoS Pathogens, 2013, 9(6): e1003475.

    猜你喜歡
    基因表達
    荷花MADS—box基因的克隆及表達分析
    維生素E和谷氨酰胺對兔精液獲能的影響?yīng)ぜ矮@能相關(guān)基因的表達
    低溫處理對斑馬魚CNSS系統(tǒng)應(yīng)激相關(guān)基因的影響
    低溫處理對斑馬魚CNSS系統(tǒng)應(yīng)激相關(guān)基因的影響
    抗菌肽對細菌作用機制的研究
    基因芯片在胃癌及腫瘤球細胞差異表達基因篩選中的應(yīng)用
    美洲大蠊提取液對大鼠難愈合創(chuàng)面VEGF表達影響的研究
    二甲基砷酸毒理學的研究進展
    非生物脅迫對擬南芥IQM4基因表達的影響
    科技視界(2016年16期)2016-06-29 11:55:38
    雷公山山區(qū)放牧山羊ACCI mRNA的組織分布
    两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲av熟女| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 午夜福利视频1000在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国语自产精品视频在线第100页| 99久久精品国产亚洲精品| 午夜a级毛片| 中文亚洲av片在线观看爽| 一级黄片播放器| 最新中文字幕久久久久| .国产精品久久| 久久99热6这里只有精品| 丰满乱子伦码专区| 精品国产亚洲在线| 别揉我奶头 嗯啊视频| 久久久久久大精品| 成年女人看的毛片在线观看| 怎么达到女性高潮| bbb黄色大片| 久久午夜亚洲精品久久| 在线观看一区二区三区| 国产色爽女视频免费观看| 久久久久九九精品影院| 男女床上黄色一级片免费看| 国产老妇女一区| 男人狂女人下面高潮的视频| 久久人人精品亚洲av| 日本在线视频免费播放| 国产精品久久视频播放| 国产成年人精品一区二区| 又紧又爽又黄一区二区| 在线播放国产精品三级| 十八禁人妻一区二区| www.色视频.com| 日韩欧美在线乱码| bbb黄色大片| 51午夜福利影视在线观看| 好男人电影高清在线观看| 中文在线观看免费www的网站| 午夜亚洲福利在线播放| 欧美又色又爽又黄视频| 99久久精品一区二区三区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 日本熟妇午夜| 精品久久久久久成人av| 男插女下体视频免费在线播放| 久久精品综合一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 欧美日韩黄片免| 窝窝影院91人妻| 亚洲成a人片在线一区二区| 最后的刺客免费高清国语| 一个人免费在线观看的高清视频| 久久亚洲精品不卡| 国产极品精品免费视频能看的| 99久久99久久久精品蜜桃| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 免费观看人在逋| 精品人妻视频免费看| 日本黄大片高清| 99国产精品一区二区三区| 国产大屁股一区二区在线视频| 日韩亚洲欧美综合| 99国产综合亚洲精品| 亚洲片人在线观看| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲午夜理论影院| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲成a人片在线一区二区| 久9热在线精品视频| 欧美成人a在线观看| 九九热线精品视视频播放| 色综合亚洲欧美另类图片| 99国产极品粉嫩在线观看| 国产精品一区二区性色av| 成年版毛片免费区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 中文在线观看免费www的网站| 国产单亲对白刺激| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日韩高清综合在线| 欧美zozozo另类| 中文字幕熟女人妻在线| 欧美精品国产亚洲| 亚洲激情在线av| av在线观看视频网站免费| ponron亚洲| 久久精品91蜜桃| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 亚洲成av人片在线播放无| 怎么达到女性高潮| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 蜜桃久久精品国产亚洲av| xxxwww97欧美| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 99riav亚洲国产免费| 夜夜爽天天搞| 国产伦人伦偷精品视频| or卡值多少钱| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美黄色片欧美黄色片| 麻豆国产97在线/欧美| 久久久久久久久久黄片| 欧美又色又爽又黄视频| 嫩草影视91久久| 亚洲一区二区三区色噜噜| 不卡一级毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区| .国产精品久久| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲 国产 在线| 国产乱人视频| 午夜福利高清视频| 精品人妻视频免费看| 变态另类丝袜制服| 国产私拍福利视频在线观看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 在线观看一区二区三区| av欧美777| 欧美bdsm另类| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日韩免费av在线播放| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产毛片a区久久久久| 级片在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 最近最新中文字幕大全电影3| 可以在线观看的亚洲视频| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲午夜理论影院| 成人欧美大片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 成人毛片a级毛片在线播放| 中文字幕av在线有码专区| 日本在线视频免费播放| 首页视频小说图片口味搜索| x7x7x7水蜜桃| 麻豆国产av国片精品| 1024手机看黄色片| 最近最新免费中文字幕在线| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产黄a三级三级三级人| 久久亚洲精品不卡| 亚洲成人中文字幕在线播放| 亚洲成人精品中文字幕电影| 亚洲精品亚洲一区二区| 一进一出抽搐gif免费好疼| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 精品久久久久久久久久久久久| 亚洲男人的天堂狠狠| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 亚洲欧美激情综合另类| 99在线视频只有这里精品首页| 精品久久久久久久末码| 亚洲五月天丁香| 亚洲七黄色美女视频| 国产黄a三级三级三级人| 黄片小视频在线播放| 久久99热这里只有精品18| 3wmmmm亚洲av在线观看| 婷婷色综合大香蕉| 久久久久亚洲av毛片大全| 嫩草影视91久久| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美午夜高清在线| 亚洲av电影在线进入| 国产精品爽爽va在线观看网站| 床上黄色一级片| 国产欧美日韩精品亚洲av| 长腿黑丝高跟| 亚洲,欧美精品.| www日本黄色视频网| 亚洲美女黄片视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 亚洲精品在线美女| 九九在线视频观看精品| 国产精品98久久久久久宅男小说| 国产精品国产高清国产av| 波野结衣二区三区在线| 日韩中文字幕欧美一区二区| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产美女午夜福利| 一进一出抽搐动态| 可以在线观看的亚洲视频| 99热6这里只有精品| 国产单亲对白刺激| 成人亚洲精品av一区二区| 国产精品不卡视频一区二区 | 午夜福利在线在线| 亚洲自拍偷在线| www日本黄色视频网| 最新中文字幕久久久久| 亚洲综合色惰| 长腿黑丝高跟| 舔av片在线| 69av精品久久久久久| 日韩欧美精品免费久久 | 国产精品98久久久久久宅男小说| 九九在线视频观看精品| 国产免费一级a男人的天堂| 午夜福利在线在线| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 91麻豆av在线| 亚洲久久久久久中文字幕| 国产高清三级在线| 99精品在免费线老司机午夜| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品国产高清国产av| .国产精品久久| 麻豆成人av在线观看| 亚洲电影在线观看av| 成人特级黄色片久久久久久久| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 搡老岳熟女国产| 在线观看一区二区三区| 91久久精品电影网| 日韩欧美精品v在线| 午夜福利欧美成人| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久久久久久久黄片| 欧美一区二区国产精品久久精品| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 久久草成人影院| 高清在线国产一区| 中文在线观看免费www的网站| 波多野结衣巨乳人妻| 激情在线观看视频在线高清| .国产精品久久| 日韩欧美国产一区二区入口| 午夜福利欧美成人| 深夜精品福利| a级毛片a级免费在线| 嫁个100分男人电影在线观看| 无人区码免费观看不卡| 极品教师在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 日韩欧美国产在线观看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲在线观看片| 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲av五月六月丁香网| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国内精品美女久久久久久| 神马国产精品三级电影在线观看| 国产高清激情床上av| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲国产欧美人成| 免费大片18禁| 一区二区三区免费毛片| 成人av在线播放网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 免费黄网站久久成人精品 | 国产男靠女视频免费网站| 美女免费视频网站| 国产91精品成人一区二区三区| 国产一区二区在线av高清观看| 国产精品爽爽va在线观看网站| 岛国在线免费视频观看| 国产精华一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 波多野结衣巨乳人妻| 日韩精品中文字幕看吧| 国产午夜福利久久久久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 亚洲成人中文字幕在线播放| 我的女老师完整版在线观看| 久久精品影院6| 欧美一区二区亚洲| 一边摸一边抽搐一进一小说| 99riav亚洲国产免费| 精品熟女少妇八av免费久了| 成人鲁丝片一二三区免费| 亚洲美女搞黄在线观看 | 国产成年人精品一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 免费av毛片视频| 午夜影院日韩av| 亚洲自拍偷在线| 国产伦精品一区二区三区视频9| 一个人免费在线观看电影| 亚洲最大成人av| 嫩草影院新地址| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产单亲对白刺激| 国产在线精品亚洲第一网站| 观看免费一级毛片| 国产精品人妻久久久久久| 国产精品亚洲一级av第二区| 无遮挡黄片免费观看| 一二三四社区在线视频社区8| 欧美在线一区亚洲| 可以在线观看的亚洲视频| 级片在线观看| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲精品亚洲一区二区| 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品久久国产高清桃花| 精品日产1卡2卡| 国产伦在线观看视频一区| 色哟哟哟哟哟哟| www.色视频.com| 免费观看人在逋| 午夜精品久久久久久毛片777| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美激情国产日韩精品一区| 免费在线观看影片大全网站| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品嫩草影院av在线观看 | eeuss影院久久| av欧美777| 亚洲av电影在线进入| 俺也久久电影网| 欧美成人免费av一区二区三区| 日日夜夜操网爽| 久久国产精品影院| 色在线成人网| 国产欧美日韩一区二区三| 午夜福利免费观看在线| 一本久久中文字幕| 99久国产av精品| 窝窝影院91人妻| 麻豆一二三区av精品| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产乱人视频| 国产黄a三级三级三级人| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久草成人影院| 赤兔流量卡办理| 国产精品久久久久久久电影| 日韩中字成人| 国产精品女同一区二区软件 | 一本久久中文字幕| 国产精品永久免费网站| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲av中文字字幕乱码综合| 99视频精品全部免费 在线| 日韩中字成人| 我要搜黄色片| 性欧美人与动物交配| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 日韩欧美三级三区| 午夜福利在线观看吧| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜视频国产福利| 日本免费一区二区三区高清不卡| АⅤ资源中文在线天堂| 在现免费观看毛片| 九色国产91popny在线| 在线天堂最新版资源| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 五月玫瑰六月丁香| 全区人妻精品视频| 久久精品国产亚洲av天美| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久精品国产自在天天线| 丰满人妻一区二区三区视频av| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线观看午夜福利视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 看十八女毛片水多多多| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 51午夜福利影视在线观看| 99久国产av精品| 成人国产综合亚洲| 久久精品国产自在天天线| 老鸭窝网址在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 欧美最新免费一区二区三区 | 中文字幕熟女人妻在线| bbb黄色大片| 赤兔流量卡办理| 婷婷精品国产亚洲av在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 丰满乱子伦码专区| 嫩草影院精品99| 成人鲁丝片一二三区免费| 特级一级黄色大片| 久久国产乱子伦精品免费另类| 欧美bdsm另类| 男女床上黄色一级片免费看| 中国美女看黄片| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲中文字幕日韩| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美成人一区二区免费高清观看| 久久人妻av系列| 久久热精品热| 有码 亚洲区| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产午夜精品论理片| 老熟妇仑乱视频hdxx| 一个人免费在线观看的高清视频| 成人鲁丝片一二三区免费| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 有码 亚洲区| 很黄的视频免费| 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜福利欧美成人| 91久久精品国产一区二区成人| 久久99热6这里只有精品| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美日韩黄片免| 嫩草影院精品99| 久久久国产成人精品二区| 成人国产综合亚洲| 少妇人妻一区二区三区视频| 丝袜美腿在线中文| av黄色大香蕉| 人妻夜夜爽99麻豆av| 淫秽高清视频在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品一及| 亚洲欧美日韩高清专用| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产野战对白在线观看| 一区二区三区四区激情视频 | 国产美女午夜福利| 国产精品电影一区二区三区| 又粗又爽又猛毛片免费看| 免费看美女性在线毛片视频| 很黄的视频免费| 亚洲欧美日韩东京热| 热99在线观看视频| 午夜亚洲福利在线播放| 99久国产av精品| 91狼人影院| 国产av在哪里看| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品国内亚洲2022精品成人| 88av欧美| 夜夜爽天天搞| 可以在线观看毛片的网站| 丁香欧美五月| 午夜免费激情av| 欧美日本视频| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 久久久国产成人免费| 老司机深夜福利视频在线观看| www.色视频.com| 51国产日韩欧美| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产成人啪精品午夜网站| 不卡一级毛片| 成人特级av手机在线观看| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美区成人在线视频| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美最新免费一区二区三区 | 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 看片在线看免费视频| 亚洲精品一区av在线观看| 久久亚洲真实| 丁香六月欧美| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 51国产日韩欧美| 少妇熟女aⅴ在线视频| www.999成人在线观看| 国产视频内射| 亚洲电影在线观看av| 最近中文字幕高清免费大全6 | 一本久久中文字幕| 免费av观看视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 又紧又爽又黄一区二区| 久久久精品欧美日韩精品| 国产精品永久免费网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 日本 欧美在线| 波多野结衣巨乳人妻| 精品一区二区免费观看| 日韩有码中文字幕| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 久久伊人香网站| 亚洲真实伦在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 特级一级黄色大片| 变态另类丝袜制服| 欧美高清性xxxxhd video| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩欧美精品免费久久 | 淫秽高清视频在线观看| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 亚洲国产精品999在线| 精品一区二区三区视频在线| 网址你懂的国产日韩在线| or卡值多少钱| 亚洲天堂国产精品一区在线| 无遮挡黄片免费观看| 久99久视频精品免费| 日本成人三级电影网站| 一个人免费在线观看电影| 国产av麻豆久久久久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产成人福利小说| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 无遮挡黄片免费观看| 一进一出抽搐动态| 精品国产亚洲在线| 色播亚洲综合网| 午夜日韩欧美国产| 91麻豆精品激情在线观看国产| 男人狂女人下面高潮的视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 一级毛片久久久久久久久女| 日本一本二区三区精品| 男人舔女人下体高潮全视频| 国产美女午夜福利| 女同久久另类99精品国产91| 国产一区二区在线av高清观看| 精品久久久久久成人av| 久久精品人妻少妇| 久久午夜福利片| 中文资源天堂在线| 床上黄色一级片| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久久久久九九精品二区国产| 两个人视频免费观看高清| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 国产精品av视频在线免费观看| 美女 人体艺术 gogo| 99视频精品全部免费 在线| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产成人欧美在线观看| 91久久精品电影网| 久久午夜亚洲精品久久| 精品福利观看| 一个人免费在线观看电影| 免费av观看视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 中文字幕久久专区| 美女黄网站色视频| 高清在线国产一区| 久久久成人免费电影| 国产久久久一区二区三区| 亚洲精品成人久久久久久| 性欧美人与动物交配| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国内精品久久久久久久电影| av在线蜜桃| 亚洲国产色片| 91久久精品电影网| 一本一本综合久久| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品久久视频播放| 看十八女毛片水多多多| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产探花极品一区二区| 极品教师在线免费播放| 国产欧美日韩精品一区二区| 亚洲av成人av| 成人一区二区视频在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 可以在线观看毛片的网站| 十八禁网站免费在线| 国产 一区 欧美 日韩| 国产欧美日韩一区二区三| 国产 一区 欧美 日韩| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲,欧美精品.| 在线播放国产精品三级| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久这里只有精品中国| 日本在线视频免费播放| 国产伦精品一区二区三区视频9| 级片在线观看| 亚州av有码| 可以在线观看毛片的网站| 露出奶头的视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 两个人视频免费观看高清| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一边摸一边抽搐一进一小说| 在线a可以看的网站| 69av精品久久久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 能在线免费观看的黄片| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精华国产精华精| 黄色配什么色好看| 欧美激情在线99| 日本熟妇午夜| 搡老妇女老女人老熟妇| 少妇熟女aⅴ在线视频|