二步發(fā)酵法在西番蓮果皮酵素加工中的應用

張順 黃葦

摘? 要? 以西番蓮果皮為對象，研究釀酒酵母菌、乳酸菌二步發(fā)酵工藝，制備乳酸菌和釀酒酵母菌活菌數(shù)高、多酚保留好、風味醇和的果皮漿。通過單因素和正交優(yōu)化實驗，以釀酒酵母菌和乳酸菌活菌數(shù)、總酚、乙醇生成量為指標，分別優(yōu)選了單一乳酸菌和釀酒酵母菌發(fā)酵的工藝參數(shù)，在此基礎上，通過測定總酸含量、活菌數(shù)、總酚含量等指標的變化，確定二步法發(fā)酵西番蓮果皮漿的工藝參數(shù)為：發(fā)酵總時間40 h，釀酒酵母菌初始接種量1.5%，在29 ℃下發(fā)酵16 h后，再接入2.0%復合乳桿菌（干酪乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1），在37 ℃下繼續(xù)發(fā)酵24 h至終點。制備的西番蓮果皮發(fā)酵液中，復合乳桿菌活菌數(shù)為8.93 lg CFU/mL，釀酒酵母菌活菌數(shù)為7.78 lg CFU/mL，總酚含量為24.00 μg/mL，總酸含量為4.40 mg/mL。二步發(fā)酵法發(fā)揮了釀酒酵母菌產香、產乙醇抑制雜菌，以及乳酸菌提高酸度、保留多酚物質的優(yōu)點。

關鍵詞? 西番蓮;釀酒酵母菌;乳酸菌;二步發(fā)酵

中圖分類號? TS255.4? ? ? 文獻標識碼? A

Two-Step Fermentation Technology of Passionfruit Pericarp

ZHANG Shun， HUANG Wei*

South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510642， China

Abstract? The two-step fermentation process of Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria was studied to prepare passionfruit pericarp pulp with high viability of lactic acid bacteria and Saccharomyces cerevisiae， good retention of polyphenols and mellow flavor. Through single factor and orthogonal experiments， the fermentation process parameters of single lactic acid bacteria and yeast were optimized by taking the number of live S. cerevisiae and lactic acid bacteria， total phenol and ethanol production as the indexes. On this basis， by measuring the changes of total acid content， viable bacteria number and total phenol content， the technological parameters of the two-step fermentation of passionflower pericarp pulp were determined. The total fermentation time was 40 h. The initial inoculation amount of the mother bacteria was 1.5%. After 16 h of fermentation at 29 ℃， 2.0% mixed Lactobacillus （L. casei∶L. plantarum = 1∶1） was added， and the fermentation continued at 37 ℃ for 24 h. In the fermentation broth， the number of live Lactobacillus was 8.9 lg CFU/mL， the number of live S. cerevisiae was 7.78 lg CFU/mL， the total phenol content was 24.0 μg/mL， and the total acid content was 4.4 mg/mL. The two-step fermentation method had the advantages of S. cerevisiae producing aroma， ethanol inhibiting impurities， and lactic acid bacteria improving acidity and retaining polyphenols.

Keywords? passionfruit; Saccharomyces cerevisiae; lactic acid bacteria; two-step fermentation

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.026

西番蓮（Passiflora edulis Sims.）因其果汁酸甜、香味濃郁，在我國已有廣泛種植，主要用于生產果汁，目前果皮尚未得到高值化利用。西番蓮果皮含有豐富的膳食纖維、果膠、多酚類等功能性成分，余東等[1]測定了西番蓮果皮總酚的抗氧化活性，顯示其對自由基清除力與總酚含量呈量效關系，除此之外西番蓮果皮含有的多糖、黃酮[2-3]類物質經(jīng)驗證有較好的降脂、抗炎癥、抗氧化等功效。在西番蓮加工過程中，提高活性成分的利用率、開發(fā)具有明確活性功能性的產品已成為關注點。酵素產品是當前果蔬加工開發(fā)熱點之一，可通過發(fā)酵技術最大限度地保留果蔬中的活性成分，同時產生大量活性益生菌。酵素發(fā)酵中應用最為廣泛的菌種為乳桿菌，具有抑制腸道有害菌群、改進腸道微生態(tài)的益生功能，其可在含有一定濃度的酸和酚類物質的環(huán)境中生長代謝，并且多酚類物質在乳酸菌發(fā)酵的酸性環(huán)境下更易得到保存，這對于提高酵素產品營養(yǎng)價值具有積極意義。已有研究表明干酪乳桿菌因具有降低人體膽固醇、降血壓[4]、防治腹瀉、提高免疫力[5]等作用，被越來越多地應用到酸乳、保健飲品等的生產制備中。但單一的乳酸菌發(fā)酵產品風味不足，甚至有時會產生不愉快的氣味。而酵母發(fā)酵可產生大量芳香酯類物質，除了能增強發(fā)酵制品的風味外，所產生的乙醇還能抑制雜菌生長，并且對人體存在潛在的益生功能[6]。本文以西番蓮果皮為主要原料，擬研究西番蓮果皮酵素的釀酒酵母菌、乳酸菌發(fā)酵工藝，提高西番蓮果皮的利用價值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料? 市售新鮮西番蓮果皮。

1.1.2? 主要試劑? 脫脂乳、蔗糖、葡萄糖等（均為食用級或分析純），上海博奧生物科技有限公司。

1.1.3? 菌種? 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei subsp. casei），均為本實驗室保藏菌種。

1.1.4? 培養(yǎng)基? MRS瓊脂培養(yǎng)基、釀酒酵母用培養(yǎng)基等，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.5? 主要儀器? LRH生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;XK97-A菌落計數(shù)器，邦西儀器科技（上海）有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 西番蓮果皮酵素制備流程? 菌種活化及擴大培養(yǎng)菌種適應性培養(yǎng)西番蓮果皮漿調配釀酒酵母菌發(fā)酵（16 h）乳酸菌接入二次發(fā)酵（24 h）發(fā)酵結束。

1.2.2? 西番蓮果皮漿發(fā)酵原液制備? 滅菌的西番蓮果皮漿按質量比適當補充以下物質：蔗糖5%，脫脂乳粉2%，分別進行釀酒酵母菌和復合乳桿菌的適應性培養(yǎng)，將擴大培養(yǎng)后的釀酒酵母菌按5%比例接入西番蓮果皮漿進行培養(yǎng)，獲得用于發(fā)酵的釀酒酵母菌種子液;將擴大培養(yǎng)后的復合乳桿菌（1∶1）按5%比例接入西番蓮果皮漿進行培養(yǎng)，獲得用于發(fā)酵的復合乳桿菌種子液。

1.2.3? 釀酒酵母菌發(fā)酵單因素實驗? 設定釀酒酵母菌發(fā)酵溫度25～33 ℃，發(fā)酵時間8～48 h，接種量為1%～3%，測定釀酒酵母菌活菌數(shù)及乙醇生成量，確定較適宜的釀酒酵母菌發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及接種量。

1.2.4? 釀酒酵母菌發(fā)酵正交優(yōu)化實驗? 在1.2.3前提下，以發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、釀酒酵母菌接種量3個因素設計L9（34）正交實驗（表1），以釀酒酵母菌數(shù)量和乙醇含量為評價指標，優(yōu)選釀酒酵母菌發(fā)酵工藝參數(shù)。

1.2.5? 復合乳桿菌發(fā)酵單因素實驗? 復合乳桿菌為植物乳桿菌、干酪乳桿菌，根據(jù)前期預實驗確定二者的比例為1∶1，設置發(fā)酵溫度33～41 ℃，發(fā)酵時間為8～48 h，接種量為1%～3%，測定復合乳桿菌活菌數(shù)及總酚含量，確定較適的發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間及接種量。

1.2.6? ?二步發(fā)酵工藝? 參照1.2.4優(yōu)化得到的釀酒酵母菌發(fā)酵工藝參數(shù)，先接種釀酒酵母菌發(fā)酵，發(fā)酵時間分別設定為8、16、24 h，然后再接種復合乳桿菌，按照1.2.2復合乳桿菌的最佳發(fā)酵工藝繼續(xù)發(fā)酵24 h，至終點。測定釀酒酵母菌、乳桿菌活菌數(shù)，總酚含量、糖消耗量、酸生成量等的變化情況，確定復合乳桿菌的最佳接入時間。

1.2.7? 主要指標測定? （1）總酚含量的測定：結合了Martin等[7]和王毓寧等[8]的方法，利用沒食子酸標準曲線法測定總酚含量。

（2）總糖和還原糖含量的測定：分別參照GB/T 15672-2009《食用菌中總糖含量的測定》和GB 5009.7-1985《食品中還原糖的測定方法》。

（3）乙醇含量的測定[8]：在經(jīng)典重鉻酸鉀氧化比色法基礎上，采用DNS氧化比色法測定葡萄糖含量， 修正乙醇含量的測定結果。

（4）乳酸菌、釀酒酵母菌活菌數(shù)的測定：參照GB/T 4789-2010中的相關方法。

（5）總酸的測定：參照GB/T 12456-2008。

（6）西番蓮果皮酵素感官評價：對西番蓮果皮酵素色澤、香氣、口感進行評定，分為3個等級，A級2分，B級1分，C級0分，評價標準見表2，結果取平均值。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

樣品做3次平行實驗，采用Excel軟件處理數(shù)據(jù)并作圖。

2? 結果與分析

2.1? 釀酒酵母菌發(fā)酵

2.1.1? 發(fā)酵溫度對釀酒酵母菌活菌數(shù)和乙醇生成量的影響? 乙醇作為發(fā)酵過程中主要的醇類物質和生成乙酸乙酯等酯類風味物質的中間產物，對風味生成起了很大貢獻，因此乙醇生成量一定程度上代表了發(fā)酵過程中整個風味物質的產生情況，同時乙醇對雜菌的抑制可發(fā)揮重要作用。由圖1可知，發(fā)酵時間設定16 h，釀酒酵母菌活菌數(shù)隨溫度上升呈先增長后下降趨勢，在29 ℃時達到峰值7.28 lg CFU/mL，溫度過高導致釀酒酵母菌繁殖代謝加劇，反而不利于活菌數(shù)的提高。乙醇生成量在溫度上升過程中呈增加趨勢，直到釀酒酵母菌數(shù)下降時，其增加趨勢隨之放緩。在溫度較高時乙醇揮發(fā)較快，不利于香氣保持，故選擇溫度水平為27～31 ℃。

2.1.2? 發(fā)酵時間對釀酒酵母菌活菌數(shù)及乙醇生成量的影響? 由圖2可知，在發(fā)酵初始階段，釀酒酵母菌數(shù)量增長迅速，乙醇生成量也隨之上升，在16 h時活菌數(shù)達峰值8.47 lg CFU/mL，之后開始下降，達24 h后釀酒酵母菌數(shù)量趨于平緩，再繼續(xù)延長發(fā)酵時間，體系內的釀酒酵母菌因為競爭營養(yǎng)成分、產生次生代謝物而進入負生長期;而乙醇生成量直到發(fā)酵后期才出現(xiàn)下降趨勢，處于穩(wěn)定期或衰退期的釀酒酵母菌，代謝活動中會產生大量次生代謝產物，如醛類、酸類等。在釀酒酵母菌分泌的酯類合成酶作用下，乙醇與這些次生代謝物質反應生成酯類等香氣物質，在產香的同時也導致了乙醇含量的下降[1]，因此綜合分析釀酒酵母菌發(fā)酵時間以8～24 h為宜。

2.1.3? 接種量對釀酒酵母菌活菌數(shù)及乙醇生成量的影響? 由圖3可知，隨著接種量的增加，釀酒酵母菌活菌數(shù)和乙醇生成量會出現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在接種量為2%時，活菌數(shù)峰值為8.24 lg CFU/mL，乙醇生成量有最大值0.3%，之后逐步下降。接入的釀酒酵母菌活性較高，若初始菌數(shù)過多則會導致菌體在前期繁殖速度較快，過早、過量地消耗營養(yǎng)成分，后期由于競爭作用導致生長速度減慢，故使得活菌數(shù)開始降低，因此綜合考慮取接種量范圍為1.5%～2.5%。

2.1.4? 釀酒酵母菌發(fā)酵正交優(yōu)化實驗結果分析? 在單因素實驗的基礎上，采用正交實驗進一步優(yōu)化釀酒酵母菌發(fā)酵工藝參數(shù)，正交優(yōu)化結果見表

3。由極差分析得出，各因素對釀酒酵母菌活菌數(shù)和乙醇生成量的影響不同，其中對釀酒酵母菌數(shù)量的影響順序為C>A=B，說明初始接種量對釀酒酵母菌的活菌數(shù)影響最大，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對釀酒酵母菌活菌數(shù)影響程度相同，優(yōu)選水平組合為A1B3C2，即發(fā)酵溫度為27 ℃，發(fā)酵時間24 h，釀酒酵母菌接種量2%;各因素對乙醇生成量的影響順序為B>A>C，即發(fā)酵時間>發(fā)酵溫度>接種量，發(fā)酵時間對乙醇生成量影響為最大，優(yōu)選水平組合為A2B3C1或A2B3C3。

由表4方差分析結果進一步分析各因素影響的顯著性可知，發(fā)酵溫度對乙醇生成量的影響為極顯著，而對活菌數(shù)影響為不顯著，故發(fā)酵溫度選擇為A2;發(fā)酵時間對活菌數(shù)和乙醇生成量的影響均為極顯著，選擇水平為B3;接種量對乙醇含量影響為顯著，對釀酒酵母菌數(shù)影響為不顯著，結合考慮初始酵母接入量不宜太高，故選擇水平為C1，故釀酒酵母菌發(fā)酵西番蓮果皮工藝的最優(yōu)參數(shù)水平為A2B3C1，即發(fā)酵溫度29 ℃，發(fā)酵時間24 h，初始接種量1.5%。

2.2? 復合乳桿菌發(fā)酵

2.2.1? 發(fā)酵溫度對復合乳桿菌活菌數(shù)和總酚含量的影響? 由圖4可知，復合乳桿菌活菌數(shù)在較大溫度范圍內都保持著較高的數(shù)量級，溫度在35～41 ℃時其活菌數(shù)上升0.1%，基本沒有出現(xiàn)顯著變化;而在升溫過程中，總酚含量呈上升趨勢明顯，在溫度從35～41 ℃上升時，總酚含量上升19%。因為溫度升高使乳桿菌分泌的酯酶活性提高，可以水解西番蓮果皮漿中的酯類，產生酚類物質。而另一方面，溫度上升乳桿菌產酸增加，酸性環(huán)境下的酚類不易被分解轉化[9]，因此較高溫度有利于多酚物質的溶出且不被分解或轉化為其他物質。較高溫度對活菌保留和總酚的溶出及生成有利，但考慮高溫條件下菌株之間的營養(yǎng)競爭加強，消耗營養(yǎng)物質速度加劇，且發(fā)酵果皮漿的風味成分散失加快，選擇復合乳桿菌發(fā)酵溫度為37 ℃。

2.2.2? 發(fā)酵時間對復合乳桿菌活菌數(shù)和總酚含量的影響? 由圖5可知，發(fā)酵初始階段基本沒有出現(xiàn)延遲期，復合乳桿菌活菌數(shù)在發(fā)酵24 h左右到達最大值9.42 lg CFU/mL，當發(fā)酵時間超過24 h時，復合乳桿菌數(shù)量出現(xiàn)下降趨勢，說明此時已接近復合乳桿菌生長繁殖的最活躍期。發(fā)酵液中的總酚含量在發(fā)酵前期出現(xiàn)上升趨勢，至24 h時達到最大值28.19 μg/mL。分析原因，復合乳桿菌發(fā)酵產生的乳酸會降低體系pH，體系pH的下降保證了多酚物質不被分解轉化，而在乳桿菌活菌數(shù)最高時酚含量出現(xiàn)了下降，可能原因是乳桿菌在代謝中產生的氨基酸、蛋白類與酚類反應，生成酯類化合物，導致酚類物質減少，但同時乳桿菌會產生一些乳酸脫羧酶，使結合酚分解為分子量較小的酚類[10-11]，因此在發(fā)酵后期總酚含量會出現(xiàn)波動。綜合分析發(fā)酵時間對復合乳桿菌活菌數(shù)和總酚含量的影響，選取最適發(fā)酵時間為24 h。

2.2.3? 接種量對復合乳桿菌活菌數(shù)和總酚含量的影響? 由圖6可知，隨著復合乳桿菌初始接種量增大，復合乳桿菌數(shù)量一直維持在較高數(shù)量級，接種量低于2%時，總酚生成量隨接種量增加逐步升高，在接種量為2%有最大總酚含量25.61 μg/mL，繼續(xù)提高接種量后總酚含量會出現(xiàn)下降趨勢。發(fā)酵過程中總酚的生成與分解是一個動態(tài)過程，影響其含量的因素有很多，發(fā)酵過程中總酚含量的變化既與微生物的種類有關[12]，酚的分解與合成也受到微生物分泌各種酶的調控，另外也與發(fā)酵過程的參數(shù)控制有很大關系[13-15]，初始接種量較大時微生物代謝更加旺盛，但同時酚類物質的分解聚合也更加頻繁，因此為保證較高的活菌數(shù)和總酚含量，取2%作為復合乳桿菌發(fā)酵的最適接種量。

2.2.4? 乳桿菌發(fā)酵結果分析? 綜合分析乳桿菌發(fā)酵最優(yōu)實驗參數(shù)為發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時間24 h，接種量2%，但發(fā)酵結束后雖然果皮總酚較未發(fā)酵時有提升，但西番蓮果皮漿的風味不佳，對后期制備西番蓮果皮酵素粉不利，因此在此基礎上，考慮引入釀酒酵母菌先行發(fā)酵，改善風味，達到既保留多酚同時也提升發(fā)酵西番蓮果皮漿整體風味的目的。

2.3? 二步發(fā)酵法發(fā)酵

乳酸菌單獨發(fā)酵時雖然能較好的保存果皮總酚，但對西番蓮果皮的風味保留不利;若進行混菌發(fā)酵，酵母與乳酸菌發(fā)酵的最適溫度相差10 ℃，難以進行調控，同時無法完全發(fā)揮各自的優(yōu)勢，因此采用先接種酵母發(fā)酵，再接種乳酸菌發(fā)酵的分步發(fā)酵方法。由表5可看出，處理1即釀酒酵母菌發(fā)酵8 h、再接入復合乳桿菌發(fā)酵24 h至終點（發(fā)酵總時長為32 h），復合乳桿菌的活菌數(shù)較高，發(fā)酵液中的總糖含量下降快，總酸含量從0.99 mg/mL上升到4.6 mg/mL，西番蓮果皮發(fā)酵液中的總酚含量上升到24.2 μg/mL;處理2即釀酒酵母菌發(fā)酵16 h、復合乳桿菌發(fā)酵24 h至終點后（發(fā)酵總時長為40 h），復合乳桿菌的活菌數(shù)等各項指標與處理1相比差異不大;處理3各項指標均低于處理1和處理2，產酸量隨著乳桿菌接種時間延長，會出現(xiàn)下降趨勢，分析原因，前期釀酒酵母菌在繁殖時會大量消耗糖類物質，導致接入的復合乳桿菌可利用的糖分減少，而釀酒酵母菌發(fā)酵產生乙醇等物質，乙醇積累到一定量不僅抑制雜菌的生長繁殖，也會抑制乳酸菌生長，酚類物質的積累和進一步生成依賴于酸性環(huán)境，乳酸下降不利于酚類物質的積累[16-17]，因此活菌數(shù)、產酸量、總酚含量等都會出現(xiàn)下降，釀酒酵母菌發(fā)酵時間過長不利于復合乳桿菌的繁殖。與未進行發(fā)酵處理的西番蓮果皮CK組相比，處理1、2在總酸、總酚含量上均有顯著提升，處理3的總酚含量有所下降，雖然處理2的總酚含量略低于處理1，但酵母及乳酸菌活菌數(shù)均略高于處理1;釀酒酵母菌發(fā)酵時間過短不利于香氣的保持，而發(fā)酵時間過長不利于總酚的積累，綜合考慮，選擇處理2，即釀酒酵母菌在29 ℃發(fā)酵16 h后再接種復合乳桿菌在37 ℃溫度下繼續(xù)發(fā)酵24 h。得到的最終發(fā)酵液中，釀酒酵母菌數(shù)量為7.78 lg CFU/mL，乳桿菌數(shù)量為8.93 lg CFU/mL，總酚含量24.01 μg/mL，酸含量4.42 mg/mL。

2.4? 西番蓮果皮漿感官評價結果

比較了單一乳酸菌發(fā)酵和釀酒酵母菌/乳酸菌復合發(fā)酵后的感官評價結果，復合菌種發(fā)酵后在香氣和口感上得分均有提升，在口感上的提升尤為明顯（表6），即釀酒酵母菌在加入后不僅僅在風味上對酵素產生積極的影響，對酵素中乳酸菌活菌數(shù)也起到一定的維持作用。

3? 討論

通過二步發(fā)酵法獲得了富含乳酸菌和釀酒酵母菌活菌、總酚含量高風味醇和的果皮發(fā)酵產品。優(yōu)選的二步發(fā)酵工藝為：釀酒酵母菌接種量為1.5%，在29 ℃發(fā)酵16 h;再按照接種量2%，接種復合乳桿菌（干酪乳桿菌∶植物乳桿菌=1∶1）在37 ℃溫度下繼續(xù)發(fā)酵24 h至終點，獲得的發(fā)酵液中，釀酒酵母菌數(shù)量為7.78 lg CFU/mL，乳桿菌數(shù)量為8.93 lg CFU/mL，總酚含量24.01 μg/mL，酸含量4.42 mg/mL。

對單一乳酸菌發(fā)酵西番蓮果皮研究結果表明，乳酸菌在西番蓮果皮漿中雖然有較好的適應性，且酚類物質的積累和生成較未發(fā)酵果皮有所提高，但整體風味差，且隨發(fā)酵時間延長活菌數(shù)難以維持較高水平;若以釀酒酵母菌/乳酸菌進行混合發(fā)酵，由于二者發(fā)酵條件差異較大，發(fā)酵過程難以控制，且由于競爭作用導致混菌發(fā)酵不能同時充分發(fā)揮各自優(yōu)勢。本研究利用分步發(fā)酵法對西番蓮果皮漿進行發(fā)酵，制備的西番蓮果皮漿香氣自然，且發(fā)酵液中總酚含量相比未發(fā)酵果皮有了一定提升，同時不同種類的益生菌活菌數(shù)也達到了較高水平，保證了產品的益生特性。分步發(fā)酵法能同時發(fā)揮釀酒酵母菌產香、產乙醇抑制雜菌，以及乳酸菌提高酸度、保留多酚物質的優(yōu)點。

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