龍眼ERF家族成員鑒定及其在體胚發(fā)生早期的表達

陳 燕，呂科良，厲 雪，高玉瑩，林玉玲，賴鐘雄

(福建農(nóng)林大學 園藝植物生物工程研究所，福州350002)

乙烯響應因子(ethylene response factors，ERF)家族是植物特異性轉錄因子APETALA2/ethylene responsive factor (AP2/ERF)超家族中的亞家族。在AP2/ERF轉錄因子超家族中，家族成員都具有AP2/ERF保守結構域。根據(jù)AP2/ ERF結構域的數(shù)量,亞家族可分為3類：僅包含1個AP2/ERF結構域的ERF家族；含有2個重復AP2/ERF結構域的AP2家族；含有1個AP2/ERF結構域和B3結構域的RAV家族[1-2]。從1994年在擬南芥中分離的第1個與花發(fā)育相關的AP2基因[3]開始，涌現(xiàn)了大量對AP2/ERF轉錄因子全基因組家族分析，其中包括：玉米[4]、粟[5]、甜橙[6]以及葡萄[7]等。ERF家族作為AP2/ERF轉錄因子超家族中的重要一員，已經(jīng)有大量的深入研究對ERF家族基因功能進行驗證。研究表明，ERF能夠在各種生物脅迫與非生物脅迫下響應，包括病害[8]、干旱[9]、鹽脅迫[10]以及通過乙烯和ABA信號通路介導各種生理過程[11]等發(fā)揮作用。除此之外，ERF在植物體胚發(fā)生過程中的調(diào)控作用也做了相關研究。Mantiri等[12]在蒺藜苜蓿體胚發(fā)生過程中，發(fā)現(xiàn)MtSERF1在球形胚以及心型胚分生組織中高表達；Piyatrakul等[13]首次揭示了AP2/ERF基因在體細胞胚胎發(fā)生過程中具有調(diào)節(jié)作用，為鑒定AP2/ERF功能開辟了道路。而關于龍眼ERF(DlERF)家族的系統(tǒng)分析未見報道。

龍眼(DimocarpuslonganLour.)原產(chǎn)于中國南部和越南南部的亞熱帶區(qū)域，是重要的經(jīng)濟作物。龍眼具有豐富的藥理作用，具有抗氧化作用、降血糖作用以及神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用等[14]功能。研究表明，龍眼胚胎發(fā)育狀態(tài)與其果實的產(chǎn)量和品質(zhì)有著密切關系，因此對龍眼胚胎發(fā)育機理開展深入研究對龍眼產(chǎn)業(yè)的發(fā)展意義重大[15]。賴鐘雄等[16]建立的龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)被認為是木本植物優(yōu)良的模式系統(tǒng)之一，是開展植物胚胎發(fā)育研究良好的替代材料。到目前為止，本實驗室完成了龍眼全基因組測序[17]，為龍眼ERF全基因組分析提供了基礎。根據(jù)前人研究表明，在龍眼體胚發(fā)生過程中乙烯可能起著誘導體胚發(fā)生以及維持生長發(fā)育過程的作用[18]。李惠華等[19]鑒定了2個乙烯受體基因(Dl-ETR1和Dl-ERS1)，發(fā)現(xiàn)Dl-ETR1在胚性愈傷組織階段的表達量最高，心形胚階段的表達量最低，而Dl-ERS1 基因在子葉形胚的表達量最高；陳秋金等[20]分離了龍眼ERF1基因cDNA全長序列，并發(fā)現(xiàn)DlERF1的表達量隨果實的發(fā)育逐漸上升，且施加外源乙烯能夠抑制處于果肉快速生長期ERF1的表達。此外，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥lncRNA(DRIR)能夠通過調(diào)節(jié)參與應激反應的一系列基因的表達來調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的反應[21]；miRNVL5與ERF4共同參與擬南芥對鹽脅迫的反應調(diào)節(jié)[22]；以及在玉米中AP2/ERF轉錄因子被預測為miRNA的靶基因[23]。通過以上研究，推測lncRNA、miRNA能夠與ERF基因共同參與植物體的調(diào)節(jié)作用。

因此，本研究對龍眼DlERF家族成員進行系統(tǒng)分析。首先，對龍眼基因組所有ERF家族成員進行系統(tǒng)命名，分析其基本理化性質(zhì)、保守基序與系統(tǒng)進化樹等基本結構與性質(zhì)，以及所有ERF家族在龍眼體胚發(fā)生早期的RNA測序中的表達量。其次，通過龍眼體胚發(fā)生早期胚性愈傷組織、不完全胚性緊實結構與球形胚3個階段的富集分析，篩選出5個表達差異顯著的ERF基因，驗證其在3個階段的表達譜以及在外源乙烯處理的EC中表達模式。最后，結合本實驗室構建的龍眼體胚發(fā)生早期過程3個階段(EC、ICpEC與GE)的lncRNA庫以及龍眼miRNA文庫[24]，預測DlERF家族基因與lncRNA、miRNA之間的調(diào)控網(wǎng)絡，并利用qRT-PCR技術驗證其在體胚發(fā)生早期過程中的表達模式。以期為后續(xù)DlERF不同成員在龍眼生長發(fā)育過程中的功能鑒定提供信息。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗材料為福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所提供的龍眼胚性愈傷組織[25]。參照賴鐘雄等[16]培養(yǎng)方法，獲得龍眼體胚發(fā)生早期胚性愈傷組織(embryonic callus, EC)、不完全胚性緊實結構(incomplete embryonic compact structure, ICpEC)、球形胚(globular embryo, GE)。參照王亞婷等[26]的處理方法，在MS液體培養(yǎng)基中加入不同濃度的乙烯，處理濃度分別為0、25、50、75、100和125 μg·L-1，再接入0.15 g生長狀態(tài)良好的龍眼EC，3次生物學重復。培養(yǎng)條件為25 ℃、115 r/min搖床上培養(yǎng)24 h，過濾凍存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取。

1.2 方 法

1.2.1龍眼ERF家族成員鑒定與基本理化性質(zhì)分析從GIGADB(http://gigadb.org)中獲取龍眼基因組氨基酸序列以及全長核苷酸序列，并通過Pfam軟件分析其結構域，鑒定出115個DlERF家族候選成員，刪除冗余序列，最終確定108個DlERF家族成員。根據(jù)擬南芥ERF家族成員在龍眼基因組中的查找注釋，參考擬南芥ERF命名方法，對龍眼ERF家族成員進行命名鑒定。利用Expasy(https://web.expasy.org/compute_pi/)分析DlERF家族成員的基本理化性質(zhì)。

1.2.2進化樹分析利用MEGA5.2軟件構建系統(tǒng)進化樹，該軟件基于龍眼中ERF基因編碼的氨基酸序列比對，通過鄰接法和泊松校正等，進行Bootstrap分析，設置參數(shù)為1 000次重復檢驗。使用Interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)識別ERF的AP2結構域的精確位置，DNAMAN對龍眼ERF基因保守結構域核苷酸序列進行比對，區(qū)分ERF家族中的亞家族。

1.2.3實時熒光定量PCR采用Tripure試劑盒提取總RNA，參照SMARTTMRACE cDNA Amplification KitTransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix使用說明書進行cDNA合成。以cDNA 10倍稀釋液為模板進行擴增，于羅氏LightCycler 480儀器中進行qRT-PCR檢測。

采用SYBR premix Ex TaqTMⅡ kit (TaKaRa)進行qRT-PCR,反應體系為20 μL，應用2×SYBR 10 μL，cDNA模版1 μL，上下引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL。程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40次循環(huán)。miRNA qRT-PCR采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix，反應體系為20 μL，應用Tip 10 μL，cDNA模版1 μL，特異與通用引物各0.8 μL，ddH2O 7.4 μL，程序為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，40次循環(huán)。lncRNA與mRNA以ELF-1α為內(nèi)參基因，miRNA以miR172a為體胚發(fā)生早期表達內(nèi)參基因，U6為乙烯處理表達內(nèi)參基因。利用2-ΔΔCT方法來計算基因的相對表達量。每個取樣點設3個技術重復，試驗共設3次生物學重復。

1.2.4龍眼體胚發(fā)生早期lncRNAs、miRNA與DlERF關系預測以及特異性表達為了預測DlERF基因與lncRNA、miRNA之間的關系，將龍眼的ERF基因序列和miRNAs文庫提交到psRNATarget (http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)，期望值≤5，預測出DlERF基因可能作為miRNA靶基因。再通過lncRNA鄰近的mRNA以及計算結合能的方法，篩選作為lncRNA靶基因的DlERF家族成員。最后將預測結果通過Cytoscape軟件繪制調(diào)控網(wǎng)絡圖。

為進一步了解龍眼ERF家族各成員在龍眼體胚發(fā)生早期可能發(fā)揮的功能特點，結合龍眼轉錄組數(shù)據(jù)庫DlERF家族基因在不同體胚發(fā)生早期階段特異表達的FPKM值，分析DlERF家族各成員的表達情況，并對表達差異顯著的5個DlERF基因的FPKM值與qRT-PCR表達量進行對比分析，同時采用 SPSS 24軟件進行不同表達水平之間的差異顯著性分析。利用在線網(wǎng)站Omicshare(http://www.omicshare.com/tools/Home/Soft/ heatmap)繪制熱圖、Graphpad繪制折線圖。

2 結果與分析

2.1 龍眼ERF家族成員鑒定與基本理化性質(zhì)分析

為了鑒定龍眼中ERF家族基因，通過Pfam軟件分析其結構域，篩選出只有1個AP2/ERF結構域的DlERF家族。在‘紅核子’龍眼基因組[17]中分別獲得了115個ERF的全長核苷酸序列以及氨基酸序列，除去CDS相同的冗余序列，最終確定108個ERF基因的全長核苷酸序列以及氨基酸序列。經(jīng)TAIR在線網(wǎng)站Blast比對，與擬南芥ERF家族成員進化分析，對其進行命名(表1)。

為進一步揭示龍眼ERF家族的功能以及結構特點，對DlERF家族氨基酸序列進行基本理化性質(zhì)分析。結果(表1)表明，該家族的蛋白分子量為13.15 kD～63.49 kD，等電點4.53～10.82之間，不穩(wěn)定系數(shù)為31.44～96.1，親水性為-1.120～-0.284之間。龍眼ERF家族大部分氨基酸個數(shù)在300 aa以下，其中Dlo_000585.2AIL6氨基酸個數(shù)最多(575 aa)。96條DlERF基因的氨基酸序列比對到擬南芥的ERF家族成員，其中包括AtDREB26、AtTINY與AtWIND1等。值得注意的是，DlERF家族中9個成員注釋到AtERF38，8個成員注釋到AtERF22，5個成員注釋到AtERF13等。研究表明，AtERF38與脅迫相關[27]，并且被認為是次生代謝壁的候選調(diào)節(jié)劑[28]；AtERF13位于SA、JA、ET和ABA信號通路的交界處，并通過協(xié)調(diào)這些激素增強植物防御反應[29]。以上均可說明，DlERF成員對龍眼的抗脅迫能力以及對病菌的防御能力可能起著重要作用。

續(xù)表1 Continued Table 1

續(xù)表1 Continued Table 1

2.2 DlERF家族的系統(tǒng)進化樹分析

對基因組鑒定出的108個DlERF基因，構建系統(tǒng)進化樹以研究DlERF基因系統(tǒng)親緣關系。如圖1所示，根據(jù)Nakano等[30]對擬南芥的分組方式，將龍眼ERF家族分為2個亞家族：CBF/DREB(A1～A6)和ERF(B1～B6)。CBF/DREB和ERF亞家族主要區(qū)別在于AP2/ERF結構域中2個位置上氨基酸殘基，CBF/DREB亞家族第14位和第19位氨基酸分別是纈氨酸和谷氨酸,而ERF亞家族是丙氨酸和天冬氨酸[31]。其中CBF/DREB亞家族包括55個成員，ERF亞家族包括53個成員。雖然對應于12組的節(jié)點的自展值都不高，但是這種分支聚類可靠性是通過內(nèi)含子的位置以及除AP2/ERF結構域外的保守基序支撐的。

對龍眼轉錄組數(shù)據(jù)庫中的103個DlERF基因進行外顯子分析，結果表明，103個DlERF基因中，81個基因僅包含1個外顯子，13個DlERF基因包含2個外顯子，包含3個外顯子的有3個DlERF基因，其余包含4～9個外顯子的DlERF基因均只有1個。由此可見，大部分(78.6%)龍眼ERF家族成員不含有內(nèi)含子，僅有22個DlERF基因具有內(nèi)含子，且這22個DlERF基因集中在其中4組中(A5、B2、B4與B6)。在A5組存在內(nèi)含子的成員中，除Dlo_013069.1ERF48-1外其余的成員內(nèi)含子數(shù)量均≥2，B6組存在內(nèi)含子的成員中，則除Dlo_012177.1ERF15-3外其余的成員均只包含1個內(nèi)含子。其余的8個組中DlERF基因都不含有內(nèi)含子，這也驗證了DlERF家族的保守性。

A1～A6屬于CBF/DREB亞家族；B1～B6屬于ERF亞家族。圖1 龍眼ERF家族成員氨基酸序列系統(tǒng)進化分析A1-A6 belong to the CBF/DREB subfamily； B1-B6 belong to the ERF subfamilyFig.1 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of longan ERF family members

2.3 DlERF家族基因RNA-Seq表達量分析

為進一步了解龍眼ERF家族在龍眼體胚發(fā)生早期過程中的表達情況，本研究結合龍眼體胚發(fā)生早期過程中3個階段(EC、ICpEC與GE)的轉錄組數(shù)據(jù)庫，對轉錄組數(shù)據(jù)庫中所有注釋為DlERF基因的FPKM值進行分析，并制作熱圖(圖2)。除了在龍眼體胚早期3個階段不表達的13個ERF成員外，其余的95個DlERF成員均檢測到表達。

RNA-Seq分析結果顯示，DlERF家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期過程3個階段表現(xiàn)出不同的表達模式。表達模式總體分為三大類：第一類，31個DlERF基因在EC階段表達量最高，其中Dlo_013069.1ERF48-1、Dlo_025861.1TINY2-2、Dlo_017325.1ERF87、Dlo_004486.1ERF53-4、Dlo_015407.1WIN1、Dlo_022579.1ERF38-7、Dlo_014678.1ERF4-3、Dlo_027111.1ERF96-1、Dlo_030328.1ERF22-3、Dlo_002336.1ERF15-1與Dlo_009842.1ERF110-1在ICpEC至GE階段表達量遞減，Dlo_001352.1ERF95、Dlo_022634.1ERF22-1、Dlo_016788.1ERF22-6、Dlo_022353.1ERF9-1與Dlo_030665.1ERF22-8在ICpEC至GE階段表達量遞增，而其余的成員在ICpEC到GE階段表達量變化不大，說明其余的15個DlERF基因在EC階段高表達，可能對胚性愈傷組織的維持起作用。第二類，11個DlERF在ICpEC階段表達量最高，除Dlo_019371.1ERF2-1、Dlo_018664.1WIND1-2與Dlo_004403.1ERF2-3外，其余的8個在EC與GE階段的表達量無明顯變化，說明了在ICpEC階段的調(diào)控作用最為明顯。第三類，53個DlERF基因在GE階段表達量最高，Dlo_026157.1ERF73-2、Dlo_014299.1ERF13-3、Dlo_022613.1ERF5-1、Dlo_023524.1ERF71-2、Dlo_005616.1CBF3、Dlo_023666.1ERF8、Dlo_022612.1ERF1-2與Dlo_007317.1ERF38-2在EC至ICpEC階段表達量遞減，Dlo_013163.1DREB2、Dlo_010734.1ERF3-2、Dlo_007513.1ERF70-3、Dlo_025226.1ERF70-4、Dlo_017388.1ERF10-2、Dlo_000290.1ERF70-1與Dlo_000247.1ERF4-1在EC至ICpEC階段表達量遞增，其余的在EC與ICpEC階段表達量變化不大。以上結果表明，不同的DlERF基因可能參與龍眼體胚發(fā)生早期不同階段的維持。

EC. 胚性愈傷組織; ICpEC. 不完全胚性緊實結構; GE.球形胚圖2 龍眼ERF家族在龍眼體胚早期3個階段的特異表達分析EC. Embryogenic callus; ICpEC. Incomplete embryonic compact structure; GE. Globular embryoFig.2 Specific expression analysis of longan ERF family in three stages of early longan somatic embryo

總體而言，龍眼ERF家族成員在龍眼體胚發(fā)生早期的形態(tài)建成中發(fā)揮重要作用，大部分成員在GE階段高表達，特別是在個別階段表現(xiàn)出階段特異性的DlERF基因，可能在該階段對形態(tài)功能等的維持起到了一定作用。

2.4 龍眼體胚發(fā)生早期DlERF基因表達的qRT-PCR分析及乙烯處理下的表達

為了更好地了解ERF家族在龍眼體胚發(fā)生早期的可能調(diào)控作用，通過在龍眼體胚發(fā)生早期3個階段(EC、ICpEC與GE)RNA-Seq表達兩兩對比，篩選出在龍眼體胚發(fā)生早期表達差異顯著的5個ERF基因(Dlo_008317.1ERF15-2、Dlo_009070.1ERF106-3、Dlo_022634.1ERF22-1、Dlo_009939.1ERF98與Dlo_022310.1ERF1-1)。qRT-PCR分析5個DlERF的表達趨勢(圖3，A)與RNA-Seq的表達結果(圖3，B)進行對比。由圖3可以看出，除Dlo_022634.1ERF22-1外，其余4個DlERF從EC到GE階段，RNA-Seq與qRT-PCR中的整體表達趨勢一致。Dlo_008317.1ERF15-2、Dlo_022310.1ERF1-1與Dlo_009939.1ERF98在GE階段qRT-PCR中的表達量顯著高于EC與ICpEC階段;Dlo_009070.1ERF106-3則在EC階段qRT-PCR中的表達量最高，顯著高于GE與ICpEC階段;Dlo_022634.1ERF22-1在ICpEC階段表達量顯著高于EC與GE階段。從不同表達趨勢來看，DlERF在龍眼體胚發(fā)生早期過程不同階段都發(fā)揮了作用。

A. 實時熒光定量PCR；B. RNA測序；EC. 胚性愈傷組織; ICpEC. 不完全胚性緊實結構; GE.球形胚；不同小寫字母表示階段間差異顯著(P<0.05)圖3 DlERF在龍眼體胚發(fā)生早期3個階段的表達A. qRT-PCR; B. RNA Seq; EC. Embryogenic callus; ICpEC. Incomplete embryonic compact structure; GE. Globular embryo; The normal letters indicate significant differences among different stages (P <0.05)Fig.3 Expression of DlERF in the early three stages of longan somatic embryogenesis

使用qRT-PCR研究了DlERF在不同濃度乙烯處理下的表達(圖4)。在不同乙烯濃度24 h處理下，5個DlERF基因均表現(xiàn)出差異的表達模式。與對照(CK)相比，不同梯度濃度的乙烯處理使得DlERF基因顯著下調(diào)，雖然Dlo_022310.1ERF1-1、Dlo_009939.1ERF98與Dlo_022634.1ERF22-1在乙烯處理濃度50 μg·L-1以及Dlo_008317.1ERF15-2乙烯處理濃度為125 μg·L-1時表達量顯著上升，但總體仍為負調(diào)控趨勢。

2.5 DlERF家族成員與lncRNA、miRNA之間的關系預測與表達模式分析

通過對lncRNA鄰近的mRNA以及計算結合能的方法對lncRNA靶基因進行預測，本次對108個DlERF進行l(wèi)ncRNA的靶基因預測。5個不同的DlERF基因分別被預測為LTCONS_00052840、LTCONS_00055212、LTCONS_00016255、LTCONS_00013739與LTCONS_00043464的靶基因。5個DlERF基因都屬于lncRNA的順式調(diào)控靶基因，其中除了LTCONS_00043464與對應DlERF基因位置關系為lncRNA位于mRNA上游10 k內(nèi)外，其余的4個均為lncRNA位于mRNA下游20k內(nèi)。

不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)圖4 不同乙烯濃度處理下DlERF的表達模式The normal letters indicate significant differences among treatments (P <0.05)Fig.4 Relative expression pattern of DlERF in different ethylene concentrations

利用psRNATarget 在線預測(期望值≤5)，預測龍眼 miRNA 數(shù)據(jù)庫中靶向調(diào)控DlERF家族成員的miRNA。結合DlERF與相關lncRNA、miRNA的關系預測，構建了龍眼體胚發(fā)生早期差異顯著的ERF-lncRNA-miRNA的調(diào)控網(wǎng)絡(圖5，A)。分析結果表明，Dlo_009070.1ERF106-3、Dlo_009939.1ERF98、Dlo_008317.1ERF15-2與Dlo_022310.1ERF1-1均同時被2個miRNA調(diào)控，且Dlo_008317.1ERF15-2能作為LTCONS_00013739的靶基因。值得注意的是，Dlo_miR413能夠同時調(diào)控Dlo_009070.1ERF106-3與Dlo_008317.1ERF15-2。

使用qRT-PCR分析了5個DlERF以及相關lncRNA、miRNA在EC、ICpEC與GE中的表達模式(圖5，B)。結果表明， LTCONS_00013739對靶基因Dlo_008317.1ERF15-2為正調(diào)控關系，從EC到GE階段表達量顯著升高；在EC至ICpEC階段以及ICpEC至GE階段，Dlo_miR164a通過靶向Dlo_022634.1ERF22-1負調(diào)控其表達；Dlo_miR413與Dlo_miR1510a共同靶向Dlo_009070.1ERF106-3，從EC到GE階段均表現(xiàn)出顯著負調(diào)控關系，而Dlo_miR413與Dlo_008317.1ERF15-2的表達量表現(xiàn)出正相關，推測相比于Dlo_008317.1ERF15-2，Dlo_miR413更傾向于調(diào)控Dlo_009070.1ERF106-3；調(diào)控Dlo_009939.1ERF98相關的Dlo_miR408與Dlo_miR774b，從表達趨勢來看，Dlo_miR774b在龍眼體胚發(fā)生早期過程能負調(diào)控Dlo_009939.1ERF98；Dlo_miR399c與Dlo_022310.1ERF1-1在EC到GE階段可能存在負調(diào)控關系。

使用qRT-PCR研究了DlERF及其相關的miRNA、lncRNA在不同濃度乙烯處理下的表達(圖6)。結果表明，Dlo_miR413在不同濃度乙烯處理均沒有差異。乙烯處理對LTCONS_00013739與其靶基因Dlo_008317.1ERF15-2表現(xiàn)出顯著抑制作用；Dlo_022634.1ERF22-1 及Dlo_miR164a在從75、100至125 μg·L-1乙烯處理下表現(xiàn)為負調(diào)控關系；與對照(CK)相比，Dlo_miR1510a在75 μg·L-1乙烯處理下表達量顯著上升，與其靶基因Dlo_009070.1ERF106-3則表現(xiàn)相反趨勢；除CK外，Dlo_009939.1ERF98在50 μg·L-1乙烯處理下表達量最高，與其相關的Dlo_miR774b則在50 μg·L-1乙烯處理下表達量最低，表現(xiàn)出顯著的抑制作用；與CK相比，Dlo_022310.1ERF1-1在125 μg·L-1乙烯處理下表達量顯著下降，與其相關的Dlo_miR399c則顯著上升。根據(jù)前面對DlERF及其相關的miRNA、lncRNA在體胚發(fā)生早期的表達趨勢分析對比可知，大部分的DlERF及其相關的miRNA、lncRNA在不同濃度乙烯處理下仍然表現(xiàn)出相同的調(diào)控趨勢。

龍眼體胚發(fā)生早期過程中，ERF基因及可能對其起到調(diào)控作用的miRNA、lncRNA的不同作用模式，以及在不同階段、不用濃度乙烯處理中的差異表達，表明了DlERF在龍眼體胚發(fā)生早期過程中可能存在復雜的調(diào)控機制。

EC. 胚性愈傷組織; ICpEC. 不完全胚性緊實結構; GE.球形胚圖5 龍眼體胚發(fā)生早期差異表達的ERF基因與其相關的miRNA、lncRNA的表達趨勢EC. Embryogenic callus; ICpEC. Incomplete embryonic compact structure; GE. Globular embryoFig.5 Trends of expression of ERF genes and their associated miRNAs and lncRNAs in the early stage of longan somatic embryogenesis

圖6 不同乙烯濃度處理下DlERF基因與其相關的miRNA、lncRNA的表達趨勢Fig.6 Trends of expression of DlERF genes and their associated miRNAs and lncRNAs in different ethylene concentrations

3 討 論

3.1 龍眼體胚發(fā)生早期過程中大量的ERF基因在GE階段高表達

AP2/ERF是一個龐大的轉錄因子家族，能夠對植物生長發(fā)育[32-33]、基因表達[34]以及生物[35]與非生物脅迫[36]等方面發(fā)揮重要作用，并且在植物體胚發(fā)生過程中也起著至關重要的調(diào)控作用[13]。然而在龍眼ERF全基因組家族還未進行系統(tǒng)鑒定，大多數(shù)DlERF基因在龍眼中的功能和作用仍然未知。

Nakano等[30]對擬南芥與水稻ERF家族進行全基因組分析，包括基因結構，系統(tǒng)發(fā)育，染色體位置和保守基序等。因此本研究對龍眼ERF家族進行系統(tǒng)地分析，從龍眼數(shù)據(jù)庫中鑒定了108個ERF家族基因，通過系統(tǒng)進化樹的構建以及保守基序分析表明，108個ERF家族基因具有相同的保守基序，AP2/ERF結構域在龍眼中相對最為保守，系統(tǒng)進化樹節(jié)點的自展值相對較低，基于DlERF保守基序分析，推測除AP2/ERF結構域之外，其余部分成員間差距較大。對5個在龍眼體胚發(fā)生過程中富集的ERF基因進一步分析發(fā)現(xiàn)，由于AP2/ERF結構域中2個位置上氨基酸殘基的差距，5個龍眼體胚發(fā)生早期差異表達DlERF基因屬于ERF家族中的2個亞家族。研究表明在擬南芥ERF家族成員中，AtERF1能夠在非生物脅迫下扮演正調(diào)控的角色[37]；AtERF15不僅是ABA響應的正調(diào)節(jié)因子，并且在根與胚胎中高度表達[38]；以及AtERF98能夠調(diào)節(jié)植物重要抗氧化劑生物合成，有助于提高擬南芥的耐鹽性[39]?？梢?，在龍眼體胚發(fā)生早期過程中差異表達的ERF基因可能對提高龍眼抗逆性起到十分重要的作用，并且Dlo_022310.1ERF1-1、Dlo_008317.1ERF15-2與Dlo_009939.1ERF98在龍眼體胚發(fā)生早期過程中表達量均呈現(xiàn)上升趨勢。這也進一步說明， 隨著龍眼體胚發(fā)生早期進行，內(nèi)源激素[40]等方面發(fā)生顯著變化，為了促進胚胎的正常發(fā)育，需要更多的DlERF基因參與。

在本次研究中，為了鑒定龍眼體胚發(fā)生過程中ERF基因的表達模式，對101個在龍眼體胚發(fā)生早期過程檢測到表達的ERF基因進行RNA-Seq表達分析。大部分DlERF基因在GE階段表達量最高，其次是EC階段。Boutilier等[41]與Tsuwamoto等[42]鑒定一些AP2/ERF基因能夠促進胚胎發(fā)育，并推測他們在SE的誘導過程中具有特定的功能。通過對5個在龍眼體胚發(fā)生早期差異顯著表達的DlERF基因進行qRT-PCR與RNA-Seq表達結果對比發(fā)現(xiàn)，大部分在龍眼體胚發(fā)生早期3個階段的表達趨勢一致，且其中3個DlERF基因在龍眼GE階段表達量最高。與蒺藜苜蓿體胚發(fā)生過程中發(fā)現(xiàn)的MtSERF1相同趨勢，在球形胚分生組織中高表達[12]。由此可見，從EC到GE階段需要更多的ERF基因來參與GE階段的維持，也進一步說明在體胚發(fā)生早期過程中，細胞分裂分化、抗性等方面也逐漸增強。

3.2 DlERF基因與乙烯之間存在負調(diào)控關系并且可能與miRNA、lncRNA形成調(diào)控網(wǎng)絡

乙烯在體胚發(fā)生過程中起著重要的作用[43-44]。前人研究發(fā)現(xiàn)，在龍眼體胚發(fā)生發(fā)育的過程中，乙烯含量在不完全胚性緊實結構與心形胚分別出現(xiàn)了峰值，松散型的胚性愈傷組織、球形胚以及子葉形胚的表達量相對較低[18]。同樣也有研究表明，對于依賴 GCC-box 表達的ERF基因來說，既可以是轉錄激活因子，也可以是轉錄抑制子，并且只有一小部分受乙烯調(diào)節(jié)[45]。因此對龍眼EC使用不同濃度乙烯處理時發(fā)現(xiàn)，與CK相比，在不同濃度處理下5個DlERF基因均表現(xiàn)為顯著下調(diào)。結果表明，乙烯與龍眼體胚發(fā)生早期5個差異表達的ERF基因存在負調(diào)控關系。另一方面，5個DlERF基因在外源乙烯處理下的表達趨勢是相似的，這意味著這5個DlERF基因可能在應對外源不同濃度乙烯處理時產(chǎn)生類似的響應，也進一步表明其功能保守性。

除了與基因相互作用外，ERF基因也可能與miRNA、lncRNA相互作用。目前，lncRNA在植物體胚發(fā)生過程調(diào)控作用的研究還未見報道，但是關于植物中l(wèi)ncRNAs的研究已有部分研究，多數(shù)以模式植物[46-47]與水稻[48]等作物為研究對象。但對于miRNA來說，已經(jīng)在龍眼中做了大量的研究，例如：Dlo_miR156家族成員與早期胚胎培養(yǎng)發(fā)育階段相關[49]，Dlo_miR162與多個miRNA共同調(diào)節(jié)體細胞胚胎發(fā)育的特定階段[50]等。分析結果顯示，一個DlERF可能被多個miRNAs靶向，一個miRNA也可能靶向多個DlERF基因。通過對龍眼體胚發(fā)生早期過程中以及不同濃度乙烯處理下差異表達5個ERF基因的調(diào)控網(wǎng)絡進行qRT-PCR驗證，不僅初步驗證了DlERF基因與其相關的miRNA、lncRNA可能存在的調(diào)控關系，同時推測對于2個miRNA同時調(diào)控同一個DlERF基因，并且miRNA對DlERF的調(diào)控作用具有偏好性。因此認為可能由于存在多個調(diào)控網(wǎng)絡，導致其難以從表達量中發(fā)現(xiàn)其調(diào)控趨勢。從復雜的關系網(wǎng)絡中可以看出，作為生物與非生物脅迫相關的基因，在龍眼體胚發(fā)生過程中發(fā)揮著至關重要的作用，以上研究僅僅是DlERF基因與lncRNAs、miRNA調(diào)控網(wǎng)絡中的冰山一角，在龍眼體胚發(fā)生早期過程中，DlERF所發(fā)揮的功能以及調(diào)控作用需要在今后的工作中進行研究驗證。