基于葉綠體16S rRNA的綠色裸藻類系統(tǒng)發(fā)育及性狀進(jìn)化研究

王艷梅，馮 佳，呂俊平，劉 琪，南芳茹，謝樹(shù)蓮

(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006)

裸藻類是真核生物演化過(guò)程中的一個(gè)獨(dú)立支系，起源較早，絕大多數(shù)種類是單細(xì)胞，只有極少數(shù)是由多個(gè)細(xì)胞聚集成的不定群體[1-2]。裸藻類植物兼有動(dòng)植物雙重性狀，多數(shù)種類可以吞噬或胞飲方式吸收營(yíng)養(yǎng)，具有色素體的種類可進(jìn)行光合作用。現(xiàn)已有研究表明，綠色裸藻類是通過(guò)二次內(nèi)共生起源的[3-6]。

綠色裸藻的最早發(fā)現(xiàn)可以追溯到340多年前，然而，作為一個(gè)生物類群進(jìn)行系統(tǒng)的分類研究卻經(jīng)過(guò)了150多年[7]。從19世紀(jì)30年代開(kāi)始，有關(guān)綠色裸藻的研究逐漸發(fā)展起來(lái)，先后報(bào)道了裸藻屬(Euglena)[8]、隱裸藻屬(Cryptoglena)[9]、柄裸藻屬(Colacium)[10]、囊裸藻屬(Trachelomonas)[10]、扁裸藻屬(Phacus)[11]、鱗孔藻屬(Lepocinclis)[12]、雙鞭藻屬(Eutreptia)[13]、旋形藻屬(Monomorphina)[14]、擬雙鞭藻屬(Eutreptiella)[15]和陀螺藻屬(Strombomonas)[16]，特別是隨著分子生物學(xué)手段的引入，有關(guān)綠色裸藻類分類和系統(tǒng)發(fā)育的研究有了進(jìn)一步深入的發(fā)展，相繼建立了盤裸藻屬(Discoplastis)[17]、眼裸藻屬(Euglenaria)[18]和吞噬藻屬(Rapaza)[19]。迄今，綠色裸藻類共報(bào)道上述13屬。

綠色裸藻類有很多共同特征，細(xì)胞大多或多或少呈紡錘形，少數(shù)為圓柱形、橢圓形或卵形，有的細(xì)胞側(cè)扁，無(wú)細(xì)胞壁，但質(zhì)膜內(nèi)有特化的表質(zhì)，也叫周質(zhì)體，有的種類胞外具囊殼，細(xì)胞前端具有胞口、胞咽、伸縮泡、眼點(diǎn)等結(jié)構(gòu)，具1～2條鞭毛，細(xì)胞核較特殊，有絲分裂時(shí)，核膜和核仁不消失，色素體形狀多樣，大小和數(shù)目不一，貯藏物質(zhì)為副淀粉[20]。

長(zhǎng)期以來(lái)，裸藻類的形態(tài)結(jié)構(gòu)是其重要的分類依據(jù)[21]。施之新[22]曾基于形態(tài)性狀對(duì)裸藻類的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行過(guò)研究。然而，單純以形態(tài)特征來(lái)探究裸藻類植物的系統(tǒng)發(fā)育是不完善的，有的種類形態(tài)很相似，但遺傳距離卻很遠(yuǎn)[18]。以形態(tài)特征和分子數(shù)據(jù)相結(jié)合研究綠色裸藻類的系統(tǒng)發(fā)育及性狀進(jìn)化很有必要。

葉綠體16S rRNA基因是所有原核和真核生物共同具有的基因，目前GenBank已收錄了數(shù)萬(wàn)條16S rRNA基因序列，積累了豐富的序列資料。同時(shí)16S rRNA 參與細(xì)胞的肽鏈合成，在進(jìn)化上高度保守，因此是構(gòu)建進(jìn)化譜系的理想基因[23]。植物葉綠體中rRNA基因排列順序與原核生物大腸桿菌和藍(lán)綠藻的rRNA基因排列順序相似，而且這些rRNA基因大多處于反向重復(fù)區(qū)內(nèi)，即有2套方向相反的rRNA基因[24]。由于16S rDNA序列一級(jí)結(jié)構(gòu)比較保守，而二級(jí)結(jié)構(gòu)又表現(xiàn)出螺旋差異性，較適用于種、屬水平的系統(tǒng)學(xué)研究[25-26]。

本研究基于葉綠體16S rRNA基因序列，構(gòu)建了綠色裸藻類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并對(duì)其性狀進(jìn)行了分析和祖先重建，以期探討綠色裸藻類的系統(tǒng)演化關(guān)系，為研究該類植物的起源提供進(jìn)一步的證據(jù)。

1 材料和方法

1.1 分類單位

本研究包含了綠色裸藻類植物12屬88種(表1)。

1.2 方 法

1.2.1基因序列在NCBI基因庫(kù)中搜索綠色裸藻類各屬種所包含的全部16S rRNA基因序列，選取各個(gè)種對(duì)應(yīng)的一條較長(zhǎng)序列用于分析。各序列登錄號(hào)及對(duì)應(yīng)文獻(xiàn)見(jiàn)表1。

1.2.2系統(tǒng)發(fā)育分析用BioEdit 7.0.5.3軟件進(jìn)行拼接及校對(duì)，以確保準(zhǔn)確性，之后運(yùn)用MrBayes3.2軟件構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3性狀的選擇性狀選擇以選取盡可能多的相對(duì)穩(wěn)定的性狀狀態(tài)和有明顯間斷性變異的數(shù)量性狀為原則[27]。性狀狀態(tài)主要根據(jù)文獻(xiàn)的廣泛比較和研究來(lái)確定。用于分支分類的性狀及狀態(tài)編碼見(jiàn)表2。所有的性狀均為無(wú)序、等權(quán)。代表性狀狀態(tài)的數(shù)字沒(méi)有進(jìn)化意義。不詳或未知的狀態(tài)用“?”表示(表1)。

網(wǎng)格無(wú)關(guān)性驗(yàn)證條件為: 噴流Majet=1.0， Tjet=300 K， Pjet=0.96 MPa, 來(lái)流Ma∞=2.52， T∞=754 K， P∞=86 kPa. 圖2給出了使用3種網(wǎng)格得到的計(jì)算模型上壁面壓力系數(shù)分布. 觀察可得: 3種網(wǎng)格所得到的上壁面壓力系數(shù)變化趨勢(shì)一致, 其中中等網(wǎng)格和加密網(wǎng)格在數(shù)值上基本一致, 即對(duì)于本文算例, 中等密度的計(jì)算網(wǎng)格即可滿足計(jì)算要求.

對(duì)綠色裸藻類的形態(tài)特征進(jìn)行全面的比較分析后[21，28-35]，選取8個(gè)性狀用于祖先重建。

1.2.4祖先重建分析基于系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中的MP分析，計(jì)算10 000 000代得出的10 001棵嚴(yán)格一致樹(shù)中選取最后的1 000棵樹(shù)，加入所選取的8個(gè)性狀(表2)，通過(guò)Mesquite3.40[36]軟件進(jìn)行形態(tài)性狀祖先重建。

表1 綠色裸藻類序列登錄號(hào)及形態(tài)數(shù)據(jù)矩陣

續(xù)表1 Continued Table 1

表2 綠色裸藻類形態(tài)性狀編碼表

2 結(jié)果與分析

2.1 綠色裸藻類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

貝葉斯法構(gòu)建的綠色裸藻類系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)顯示，雙鞭藻屬與擬雙鞭藻屬互為姐妹群且得到高度支持(100%)。扁裸藻屬、鱗孔藻屬和盤裸藻屬位于一支，也得到了很高的支持率(100%)。囊裸藻屬和陀螺藻屬也聚為一支，同樣也得到了很高的支持率(100%)。裸藻屬、隱裸藻屬、柄裸藻屬和旋形藻屬親緣關(guān)系較近。裸藻屬不是一個(gè)單系類群，在系統(tǒng)發(fā)育發(fā)面仍需要深入研究。其它個(gè)別屬雖然也有出現(xiàn)嵌套現(xiàn)象，但整體系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較清晰。

2.2 綠色裸藻類祖先重建及各形態(tài)性狀原始性分析

基于形態(tài)性狀對(duì)綠色裸藻類祖先重建的結(jié)果(圖2～3)顯示：(1)表質(zhì)硬化程度 表質(zhì)硬化程度在綠色裸藻類不同屬表現(xiàn)各異，或是柔軟易變形，或是硬化而形狀固定。從該性狀的祖先狀態(tài)重建結(jié)果(圖2)可以看出，表質(zhì)柔軟易變形這一性狀較原始。

(2)表質(zhì)條紋 表質(zhì)條紋作為綠色裸藻類的常見(jiàn)性狀，形態(tài)多樣，如裸藻屬、眼裸藻屬、大部分鱗孔藻屬和一部分扁裸藻屬種類為螺旋形線紋，盤裸藻屬和一部分扁裸藻屬種類表現(xiàn)為縱線紋，陀螺藻屬、旋形藻屬和大多數(shù)囊裸藻屬種類表現(xiàn)為孔紋、點(diǎn)紋、凸紋或肋紋，柄裸藻屬、隱裸藻屬、雙鞭藻屬和擬雙鞭藻屬等少數(shù)種類則表面光滑。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結(jié)果(圖2)可以看出，螺旋形線紋是最早出現(xiàn)的原始性狀。

(3)后端形狀 細(xì)胞后端或多或少漸狹是裸藻類典型特征之一，但變化較多。從該性狀的祖先狀態(tài)重建結(jié)果(圖3)可以看出，細(xì)胞后端漸尖或尖尾刺狀是最為原始的性狀。

(5)鞭毛長(zhǎng)度 在綠色裸藻類中，鞭毛長(zhǎng)度這一性狀特征明顯，便于觀察和測(cè)量，在同一種類中，比較穩(wěn)定，短于體長(zhǎng)，等于體長(zhǎng)，或長(zhǎng)于體長(zhǎng)，可作為典型的分辨性狀。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結(jié)果(圖4)可以看出，在發(fā)展過(guò)程中，3種性狀出現(xiàn)頻率相近，在可能的祖先狀態(tài)中各占一定比例，其中鞭毛等于體長(zhǎng)這一性狀占比較小，鞭毛長(zhǎng)于或短于體長(zhǎng)2種性狀占比相近，原始性不確定。

(6)葉綠體形狀 葉綠體形狀是綠色裸藻類分類的重要性狀，有的為星狀，有的較大，為片狀、盾狀或大盤狀，有的較小，為小盤狀或球形。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結(jié)果(圖4)可以看出，葉綠體為片狀、盾狀或大盤狀這一性狀較原始。

分支節(jié)點(diǎn)處數(shù)字代表16S rRNA基因貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)節(jié)點(diǎn)支持率，低于0.50不顯示；標(biāo)尺數(shù)字代表遺傳距離。圖1 基于16S rRNA序列的綠色裸藻類貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)The figures of the branch node represent the support rates of Bayesian tree based on 16S rRNA gene, and it is not displayed when lower than 0.50; the number of scale represents genetic distanceFig.1 Bayesian tree of green euglenophytes based on 16S rRNA sequence

圖2 基于表質(zhì)硬化程度(Ⅰ)和表質(zhì)條紋(Ⅱ)性狀的綠色裸藻類祖先重建結(jié)果Fig.2 Results of ancestral reconstruction about green euglenophytes based on degree of surface hardening (Ⅰ) and superficial stripe (Ⅱ)

圖3 基于后端形狀(Ⅰ)和囊殼及鞭毛孔結(jié)構(gòu)性狀(Ⅱ)的綠色裸藻類祖先重建結(jié)果Fig.3 Results of ancestral reconstruction about green euglenophytes based on shape of posterior end (Ⅰ) and lorica and flagellar pore (Ⅱ)

圖4 基于鞭毛長(zhǎng)度(Ⅰ)和葉綠體形狀(Ⅱ)的綠色裸藻類祖先重建結(jié)果Fig.4 Results of ancestral reconstruction about green euglenophytes based on length of flagella (Ⅰ) and shape of chloroplast (Ⅱ)

圖5 基于葉綠體蛋白核(Ⅰ)和副淀粉粒形狀及數(shù)量(Ⅱ)性狀的綠色裸藻類祖先重建結(jié)果Fig.5 Results of ancestral reconstruction about green euglenophytes based on pyrenoid of chloroplast (Ⅰ) and shape and quantity of paramylon grains (Ⅱ)

(7)葉綠體蛋白核 蛋白核是綠色裸藻類色素體中的重要結(jié)構(gòu)，有的種類缺乏，有的種類存在，有蛋白核的種類，有的具副淀粉鞘，有的無(wú)。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結(jié)果(圖5)可以看出，無(wú)蛋白核這一性狀較穩(wěn)定而經(jīng)歷了長(zhǎng)的發(fā)展時(shí)期，蛋白核具鞘這一性狀也在祖先狀態(tài)中以一定頻率出現(xiàn)，但最原始的性狀可能是蛋白核無(wú)鞘這一性狀。

(8)副淀粉粒形狀及數(shù)量 副淀粉粒形狀及數(shù)量這一性狀表現(xiàn)穩(wěn)定，是綠色裸藻類種類鑒定的重要特征，表現(xiàn)為小顆粒狀且數(shù)量不定、具定形但不定數(shù)不定位的大顆?；蚓叨ㄐ味〝?shù)定位的大顆粒。由該性狀的祖先狀態(tài)重建結(jié)果(圖5)可以看出，副淀粉粒為小顆粒狀且數(shù)量不定這一性狀相對(duì)原始。

2.3 基于祖先重建的綠色裸藻類植物原始性分析

李效宇等[42]研究表明，綠色裸藻不同種類的體表線紋在排列方向、形狀、粗細(xì)及疏密程度不同，而且這一性狀在同一定種內(nèi)是相對(duì)穩(wěn)定的，因此可以作為分類的一個(gè)重要依據(jù)。本研究通過(guò)對(duì)表質(zhì)條紋(圖2)的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于光滑或不明顯，孔紋、點(diǎn)紋、凸紋或肋紋，縱線紋3種性狀來(lái)說(shuō)，螺旋形線紋這一性狀更為原始，推測(cè)表現(xiàn)為螺旋形線紋的裸藻屬、眼裸藻屬、鱗孔藻屬和扁裸藻屬有可能是較早出現(xiàn)的綠色裸藻類。通過(guò)對(duì)表質(zhì)硬化程度(圖2)的研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于形狀固定這一性狀來(lái)說(shuō)，易變形的性狀更為原始，推測(cè)表現(xiàn)為易變形的裸藻屬、眼裸藻屬、雙鞭藻屬、擬雙鞭藻屬、囊裸藻屬、陀螺藻屬和盤裸藻屬有可能是較早出現(xiàn)的綠色裸藻類。對(duì)后端形狀的研究(圖3)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于形狀不定、乳頭狀突出、圓形3種性狀來(lái)說(shuō)，漸尖或尖尾刺這一性狀更為原始，推測(cè)表現(xiàn)為后端漸尖或尖尾刺的裸藻屬、眼裸藻屬、扁裸藻屬、陀螺藻屬、盤裸藻屬和旋形藻屬有可能是較早出現(xiàn)的綠色裸藻類。對(duì)囊殼及鞭毛孔的研究(圖3)可以看出，對(duì)于有囊殼無(wú)領(lǐng)，具或無(wú)加厚環(huán)；無(wú)領(lǐng)，具加厚環(huán)；具矮領(lǐng)，具或無(wú)加厚環(huán)；具領(lǐng)，領(lǐng)緣具齒刻四種性狀來(lái)說(shuō)，無(wú)囊殼這一性狀更為原始，推測(cè)表現(xiàn)為無(wú)囊殼的裸藻屬、隱裸藻屬、柄裸藻屬、扁裸藻屬、鱗孔藻屬、雙鞭藻屬、旋形藻屬、擬雙鞭藻屬、眼裸藻屬和盤裸藻屬出現(xiàn)相對(duì)較早，而囊裸藻屬和陀螺藻屬出現(xiàn)較晚。對(duì)鞭毛長(zhǎng)度的研究(圖4)可知，鞭毛長(zhǎng)度在發(fā)展過(guò)程中，無(wú)特定的側(cè)重發(fā)展方向，各性狀出現(xiàn)頻率接近，不能推斷可能的祖先狀態(tài)。通過(guò)對(duì)葉綠體形狀的研究(圖4)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于星狀、小盤狀、球形3種性狀來(lái)說(shuō)，片狀、盾狀或大盤狀這一性狀更為原始，推測(cè)表現(xiàn)為葉綠體片狀、盾狀或大盤狀的囊裸藻屬、柄裸藻屬、隱裸藻屬、眼裸藻屬和裸藻屬可能較早出現(xiàn)。通過(guò)對(duì)葉綠體蛋白核的研究(圖5)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于無(wú)蛋白核、蛋白核被副淀粉顆粒包圍、蛋白核具鞘3種性狀來(lái)說(shuō)，蛋白核無(wú)鞘這一性狀更為原始，推測(cè)表現(xiàn)為具無(wú)鞘蛋白核的裸藻屬、囊裸藻屬和旋形藻屬有可能是比較原始的種類。通過(guò)對(duì)副淀粉粒形狀及數(shù)量的研究(圖5)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于具定形但不定數(shù)不定位的大顆粒、具定形定數(shù)定位的大顆粒2種性狀來(lái)說(shuō)，副淀粉粒為小顆粒狀且數(shù)量不定這一性狀更為原始，推測(cè)表現(xiàn)為副淀粉粒小顆粒狀且數(shù)量不定的裸藻屬、眼裸藻屬、雙鞭藻屬、擬雙鞭藻屬、囊裸藻屬、陀螺藻屬和柄裸藻屬植物較早出現(xiàn)。綜合8種性狀祖先重建結(jié)果來(lái)看，裸藻屬和眼裸藻屬植物具有所有原始性狀，可能是綠色裸藻類的祖先。

3 討 論

從研究結(jié)果看，雙鞭藻屬與擬雙鞭藻屬互為姐妹群，鱗孔藻屬和盤裸藻屬親緣關(guān)系較近，裸藻屬不是一個(gè)單系類群，這與之前有關(guān)文獻(xiàn)基于SSU rRNA的研究結(jié)果一致[19]。但扁裸藻屬、陀螺藻屬、隱裸藻屬、柄裸藻屬和旋形藻屬親緣關(guān)系則與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果有出入。另外，有些不同屬親緣關(guān)系很近，同時(shí)有的屬內(nèi)不同種類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是基于不同的基因會(huì)出現(xiàn)不同的結(jié)果。也有可能目前屬種的界定還不夠完善。因此，只有在更多分子序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，才可能構(gòu)建科學(xué)客觀的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

不同物種性狀的形態(tài)穩(wěn)定性對(duì)于重建復(fù)雜性狀的進(jìn)化史是必要的，以形態(tài)性狀和分子數(shù)據(jù)相結(jié)合重建性狀的發(fā)展過(guò)程，是科學(xué)發(fā)展的必然[19]。施之新曾基于形態(tài)性狀，對(duì)裸藻類進(jìn)行過(guò)分支分類分析，指出對(duì)于表質(zhì)的硬化程度及變形這一性狀的極性是沿柔軟變形向高度硬化而不變形的方向發(fā)展，對(duì)于表質(zhì)條紋這一性狀的極性是由螺旋形向縱向過(guò)渡，對(duì)于囊殼及鞭毛孔這一性狀的極性是由無(wú)囊殼向囊殼具領(lǐng)和加厚環(huán)過(guò)渡，對(duì)于副淀粉粒這一性狀的極性是由小顆粒狀且數(shù)量不定向具定形定數(shù)定位的大顆粒過(guò)渡[22]。本研究結(jié)果與其高度一致，可見(jiàn)基于葉綠體16S rRNA可以客觀反映綠色裸藻類的進(jìn)化過(guò)程。

本研究所選擇的葉綠體16S rRNA基本上可以客觀反映綠色裸藻類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，說(shuō)明該基因是植物類群系統(tǒng)發(fā)育的有效分子標(biāo)記之一，也說(shuō)明了葉綠體基因在反映植物系統(tǒng)發(fā)育研究中的重要性。但是采用單一的分子標(biāo)記也存在一定的缺陷。由于分子數(shù)據(jù)的局限以及分析方法存在一定程度的不足，因此祖先重建分析的結(jié)果可能只是基本上反映祖先性狀的演化過(guò)程。此外，還有一些其它性狀如細(xì)胞形狀、囊殼的分層以及囊殼的顏色等，雖然本研究尚未涉及，但是這些性狀在綠色裸藻類植物分類方面依然具有一定的價(jià)值。因此，進(jìn)一步積累分子數(shù)據(jù)，更為合理地對(duì)形態(tài)性狀進(jìn)行編碼，進(jìn)一步正確評(píng)價(jià)性狀及其分類學(xué)或系統(tǒng)學(xué)意義，值得進(jìn)一步深入研究。