不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘新球蜜荔’體胚發(fā)生的影響及其組織學(xué)觀察①

王 果 李煥苓 王樹軍 孫進(jìn)華 李 芳 王家保

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站 海南?？?71737)

荔枝（Litchi chinensisSonn.）屬無患子科荔枝屬常綠喬木，是我國(guó)南方重要的經(jīng)濟(jì)果樹之一［1］。產(chǎn)業(yè)中的病危害嚴(yán)重、采后損失較大、成花不穩(wěn)等問題迫切需要優(yōu)良品種。傳統(tǒng)的育種效率已經(jīng)難以滿足目前市場(chǎng)的需求，生物技術(shù)育種時(shí)效高成為當(dāng)前植物品種改良的主要手段，已經(jīng)成功應(yīng)用于香蕉［2］、番木瓜［3］、番茄［4］、苜蓿［5］、水稻［6］、蘋果［7］等植物品種改良中。建立高效穩(wěn)定離體再生技術(shù)體系是植物生物技術(shù)育種的基石，體胚發(fā)生是建立木本植物離體再生的主要途徑。體胚具有兩極性結(jié)構(gòu)，可以直接形成再生植株，在無性繁殖上具有較大優(yōu)越性［8］。開展荔枝體胚發(fā)生研究，對(duì)于植物基因工程、細(xì)胞工程、雜交育種、良種快繁、轉(zhuǎn)基因受體和突變體篩選等具有重大價(jià)值，同時(shí)有助于研究細(xì)胞離體培養(yǎng)中形態(tài)發(fā)生、細(xì)胞分化與胚胎發(fā)生等重大理論問題。

荔枝品種不同，其離體再生體系建立難易不同，體胚高頻發(fā)生是建立荔枝離體再生技術(shù)體系的基礎(chǔ)。目前僅有15 個(gè)荔枝品種獲得再生苗［9］，其離體再生體系不穩(wěn)定，再生率較低，最基本的原因在于未能建立高頻穩(wěn)定的體胚發(fā)生體系從而獲得大量體胚?！虑蛎劾蟆呛Ｄ显a(chǎn)的優(yōu)異荔枝資源品種，果實(shí)外觀好，風(fēng)味佳，產(chǎn)量好；生長(zhǎng)量小，栽培管理不復(fù)雜，建立‘新球蜜荔’離體再生技術(shù)體系，可為加快其在育種上的改良及生產(chǎn)推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。本研究擬以‘新球蜜荔’花藥為外植體獲得的胚性愈傷組織為材料，研究不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘新球蜜荔’體胚誘導(dǎo)的影響，建立體胚成熟及萌發(fā)體系，同時(shí)對(duì)體胚發(fā)生過程中的組織形態(tài)學(xué)觀察，揭示荔枝體胚發(fā)生和發(fā)育過程，為果樹體胚發(fā)生研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

‘新球蜜荔’花藥誘導(dǎo)保持所獲胚性愈傷組織為材料，比較不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘新球蜜荔’體胚高頻發(fā)生的影響。

1.2 方法

1.2.1 體胚發(fā)生

將繼代保持18 d 旺盛生長(zhǎng)的‘新球蜜荔’胚性愈傷組織接種到添加不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS 培養(yǎng)基上（表1）誘導(dǎo)體胚發(fā)生。每瓶接種約0.1 g，每個(gè)處理各接種10 瓶；接種后置于（25±2）℃環(huán)境中黑暗培養(yǎng)；以10瓶為一重復(fù)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行3次；約7 周時(shí)統(tǒng)計(jì)體胚個(gè)數(shù)，以直徑≥0.3 cm 的體胚為準(zhǔn)。

1.2.2 體胚成熟

參考王果［20］，體胚形態(tài)多樣，有雙子葉胚、團(tuán)狀胚、喇叭胚等9種形態(tài)，依據(jù)其顏色可分為乳白胚和透明胚，乳白胚即體胚乳白色，經(jīng)過成熟后有進(jìn)一步萌發(fā)的潛力。透明胚為淡黃色透明胚，在成熟過程中逐漸褐變死亡，不能萌發(fā)。

將誘導(dǎo)53 d、直徑≥0.3 cm 的‘新球蜜荔’乳白胚與透明胚分別轉(zhuǎn)接到不同濃度ABA 與PEG-600組合的成熟培養(yǎng)基上，每處理約接種30 個(gè)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立進(jìn)行2 次；約65 d 時(shí)觀察并記錄體胚成熟情況。

1.2.3 體胚萌發(fā)

將‘新球蜜荔’成熟胚轉(zhuǎn)接到萌發(fā)培養(yǎng)基上，對(duì)比不同成熟培養(yǎng)基上成熟體胚的萌發(fā)效果。每瓶接種約4個(gè)體胚，每個(gè)處理各接種20瓶；約30 d統(tǒng)計(jì)體胚萌發(fā)量，觀察并記錄體胚萌發(fā)過程。

1.2.4 愈傷組織形態(tài)學(xué)觀察

取‘新球蜜荔’T3、T7、T11 體胚培養(yǎng)基上培養(yǎng)3、6、9、12、15、18、21、24、27 d 培養(yǎng)物進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAA對(duì)體胚發(fā)生的影響

NAA 0.1 mg/L與KT 5 mg/L組合中，‘新球蜜荔’體胚發(fā)生率、發(fā)生數(shù)量、乳白胚比例都較未添加NAA 培養(yǎng)基上的明顯降低。分別添加NAA 0.1 mg/L與ZT 5 mg/L、TDZ 0.5 mg/L 的兩個(gè)組合中，‘新球蜜荔’體胚發(fā)生率、發(fā)生數(shù)量、乳白胚比例都比未添加NAA的高。

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)3 個(gè)荔枝品種體胚發(fā)生的影響

從圖1 與表1 可以看出，不同種類、不同濃度的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑（ZT、KT、TDZ）對(duì)‘新球蜜荔’體胚發(fā)生影響不同。影響較大的是TDZ，其次依次是ZT 與KT；其中添加TDZ 的培養(yǎng)基體胚發(fā)生率達(dá)100%，體胚發(fā)生數(shù)量最多，為6 010 個(gè)/g FW；添加ZT 的培養(yǎng)基體胚發(fā)生率均為100%，體胚數(shù)量最多達(dá)5 540 個(gè)/g FW；添加KT 的培養(yǎng)基體胚發(fā)生率最高只有90%，體胚數(shù)量為4 110 個(gè)/g FW。添加一定濃度ZT、KT 組合的培養(yǎng)基均發(fā)生體胚，數(shù)量最高達(dá)5 690個(gè)/g FW。

不同種類、不同濃度生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘新球蜜荔’體胚發(fā)生數(shù)量質(zhì)量影響都不同。添加TDZ 0.5 mg/L 培養(yǎng)基上體胚發(fā)生數(shù)量最多，達(dá)6 010 個(gè)/g FW，乳白色體胚占93.29%，多為球形胚與細(xì)長(zhǎng)子葉胚，直徑多在0.3～0.7 cm，有部分乳管胚直徑達(dá)1.7 cm；TDZ 濃度升高或降低，其體胚數(shù)量都急劇減少，且透明胚比例升高，在TDZ 0.1 mg/L時(shí)全部是透明胚。在添加不同濃度ZT 的培養(yǎng)基上，以添加5 mg/L ZT 培養(yǎng)基上的白色體胚發(fā)生率最高，乳白色體胚多為球形，不黏連，一碰即落，不似TDZ 中的球形胚成塊；體胚整體在0.3～0.6 cm，體積較TDZ、KT 培養(yǎng)基上的大小均一，無明顯差距；體胚數(shù)量較TDZ 0.5 mg/L培養(yǎng)基上的體胚數(shù)量少，隨著TDZ 濃度升高或降低，其體胚數(shù)量都減少，分化大量透明胚，透明胚體積相對(duì)較大。在添加不同濃度KT的培養(yǎng)基上，體胚發(fā)生數(shù)量較少，最高僅4 110個(gè)/g FW；乳白色體胚比例也較低，為1.95%；隨著KT濃度升高，其體胚發(fā)生率與白色體胚比例也增大，添加7 mg/L KT，體胚發(fā)生數(shù)量達(dá)3 810 個(gè)/g FW，沒有僅添加5 mg/LKT 培養(yǎng)基上的體胚數(shù)量多，但是乳白色體胚比例較其微高；添加KT 培養(yǎng)基上的胚性愈傷組織全部褐變。添加ZT 3 mg/L 與KT 2 mg/L 組合的培養(yǎng)基上體胚發(fā)生數(shù)量達(dá)5 690 個(gè)/g FW，乳白色體胚占89.7%；該培養(yǎng)基上體胚全分化，透明胚相對(duì)大，0.4 cm以上；且還分化較多0.1 cm 球形、小乳白胚；子葉胚彎曲，0.3 cm 且漸成熟轉(zhuǎn)綠。但同時(shí)添加ZT2 mg/L、KT 3 mg/L 培養(yǎng)基上的體胚則較多分化透明胚，體積形態(tài)不規(guī)則，可分化至子葉胚，球形胚較少。

由此可見，過高或過低生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)荔枝體胚發(fā)生都是不利的。確定‘新球蜜荔’體胚高頻發(fā)生的適宜培養(yǎng)基為添加TDZ 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L的MS培養(yǎng)基。

表1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)‘新球蜜荔’體胚發(fā)生的影響

2.3 ABA 及PEG 不同濃度組合對(duì)體胚成熟及萌發(fā)的影響

2.3.1 對(duì)體胚成熟的影響

無論是否添加ABA，體胚褐死率都隨著PEG-600濃度升高出現(xiàn)先降低后升高；而當(dāng)無添加PEG-600 時(shí)，褐死率隨著ABA 濃度升高出現(xiàn)先升后降，最低達(dá)42.22%；當(dāng)ABA 濃度為1 mg/L 時(shí)，褐死率明顯上升；當(dāng)ABA濃度為2 mg/L 時(shí)，褐死率微降后升。因此，僅添加PEG-600 或1 mg/L ABA 都能明顯降低體胚褐死率，但同時(shí)添加兩者其褐死率反而較單獨(dú)添加的高；不過，高濃度的ABA（2 mg/L）與高濃度PEG-600（50 g/L）組合其褐死率反而降低，接近單獨(dú)添加PEG-600的褐死率。

PEG-600 通過提高培養(yǎng)基滲透勢(shì)對(duì)體胚含水量起作用，而ABA 能改善體胚質(zhì)量，添加了ABA 的培養(yǎng)基處理乳白色體胚都較鮮白，飽滿。因此選擇PEG-600 25 g/L 促進(jìn)體胚成熟，在體胚的特定或某一階段選擇1 mg/L ABA來調(diào)控體胚狀態(tài)。在上述不同體胚成熟培養(yǎng)基上，透明胚逐漸褐變死亡，個(gè)別乳白胚褐變（表2）。

表2 不同濃度ABA及PEG組合對(duì)‘新球蜜荔’體胚成熟的影響

2.3.2 對(duì)體胚萌發(fā)的影響

不同來源成熟體胚在萌發(fā)培養(yǎng)基上表現(xiàn)不同。來源于有添加PEG-600的成熟體胚褐死較多。當(dāng)無PEG-600存在時(shí)，添加1 g/L ABA培養(yǎng)基上的體胚褐死最少；添加不同濃度PEG-600 后，ABA 對(duì)體胚褐死影響不是很大；而同時(shí)添加高濃度PEG-600 及ABA 后，體胚大多褐變；因此體胚成熟時(shí)單獨(dú)添加ABA對(duì)體胚萌發(fā)有促進(jìn)作用。

無添加ABA 時(shí)，低濃度PEG-600（25 g/L）對(duì)體胚萌發(fā)有抑制作用，隨著濃度升高，體胚較少褐變；而當(dāng)添加ABA 后，隨著PEG-600 濃度升高，其褐變程度加大。因此體胚成熟時(shí)單獨(dú)添加PEG-600對(duì)體胚萌發(fā)有促進(jìn)作用。

體胚萌發(fā)過程中全部變綠，僅有一個(gè)體胚抽出莖段，但無真葉展開。個(gè)別乳白胚再生出鮮乳白色次生胚，體積較小，約0.5～0.8 cm，該種體胚在光下不能變綠；透明胚在萌發(fā)過程中逐漸褐死。在萌發(fā)培養(yǎng)基上有少數(shù)類似于莖、芽，或彎曲或泡狀化的畸形結(jié)構(gòu)，有1 個(gè)體胚有不定根生成。

2.4 ‘新球蜜荔’體胚發(fā)生過程中的組織形態(tài)學(xué)變化

‘新球蜜荔’胚性愈傷組織細(xì)胞有橢圓形與圓形，細(xì)胞緊湊，內(nèi)含物豐富，可見細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核及淀粉粒（圖1 b 紅色箭頭所指）。胚性愈傷組織中夾雜非胚性細(xì)胞，非胚性細(xì)胞體積較大，細(xì)胞核質(zhì)比低，在體胚分化過程中逐漸裂解凋亡。胚性愈傷組織內(nèi)部或者表面可見大小不一的單個(gè)或兩個(gè)以上相對(duì)孤立的胚性細(xì)胞或胚性細(xì)胞團(tuán)，由此可推測(cè)胚性細(xì)胞可能起源于單個(gè)細(xì)胞，但不排除多個(gè)細(xì)胞的體胚發(fā)生方式；體胚發(fā)生的起源方式則同時(shí)有外起源（圖1 b 黃色箭頭所指）和內(nèi)起源（圖1b 紅色、紫色箭頭所指）兩種。

胚性細(xì)胞體積小，核大，細(xì)胞質(zhì)稠密，染色深，經(jīng)過對(duì)稱分裂形成胚性細(xì)胞團(tuán)。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，胚性細(xì)胞團(tuán)形成明顯凸起或長(zhǎng)條形原胚（圖1b 黃色箭頭所指），經(jīng)過不對(duì)稱分裂，原胚表現(xiàn)出極強(qiáng)烈的極性，胚頂端下凹兩邊凸起形成子葉原基，分化為心形胚；子葉原基接著分裂分化，子葉伸長(zhǎng)，發(fā)育成為魚雷形胚。魚雷形胚子葉繼續(xù)伸長(zhǎng)，根冠細(xì)胞裂解（圖2 KT-18 d），形成具有明顯頂端分生組織、原形成層帶、發(fā)育良好的子葉和根的子葉胚。體胚在形成過程中或與愈傷組織緊密相連，或在不同發(fā)育階段時(shí)從愈傷組織中游離開來，有的體胚則互相黏連，而形成連體胚（圖2TDZ-12 d）。

在不同體胚發(fā)生培養(yǎng)基上，體胚發(fā)生時(shí)間不一致。ZT、TDZ 培養(yǎng)基上的愈傷組織在初期（ZT-3 d，TDZ-3 d）已經(jīng)有原胚發(fā)生，ZT 培養(yǎng)基上，至9 d 時(shí)有多個(gè)原胚，12 d 時(shí)有心形胚及子葉胚出現(xiàn)，且12～15 d間出現(xiàn)大量心形胚及子葉胚；21～24 d主要是球形胚與魚雷形胚，至24 d 時(shí)多子葉胚居多。TDZ 體胚發(fā)生培養(yǎng)基上，12 d 時(shí)發(fā)現(xiàn)心形胚，15 d 時(shí)有大量心形胚出現(xiàn)，21 與24 d 出現(xiàn)大量的魚雷形胚及子葉胚，此時(shí)間是體胚開始大量形成子葉胚的階段。

KT 體胚發(fā)生培養(yǎng)基上，9 d 天時(shí)才隱約可見球形胚（圖2 KT-9 d），12 d 時(shí)球形胚大量發(fā)生，15～18 d時(shí)主要是球形胚及心形胚發(fā)生，21 d有子葉 胚出現(xiàn)，24 d子葉胚增多。

3 討論

3.1 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及水平對(duì)體胚誘導(dǎo)的影響

除基因型外，激素種類及水平是影響植物離體再生的主要因素。KT、ZT 是果樹體胚發(fā)生最常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，使用濃度范圍較大，在0.25～5 mg/L。橡膠［21］、荔枝［22］及芒果［23］等果樹上使用的KT 濃度較高，分別為1、3、5 mg/L，從而獲得大量體胚。雜交鵝掌楸［24］采用富含0.5 mg/L KT 或ZT 4 mg/L 獲得大量原胚。TDZ 常用于頑拗性植物體胚發(fā)生，其作用較強(qiáng)，使用濃度范圍較低。紅姜花［25］采用0.15 mg/L TDZ 誘導(dǎo)體胚，體胚誘導(dǎo)率高達(dá)4500 個(gè)/mL；當(dāng)TDZ 為0.003 mg/L時(shí)，杉木［26］體胚誘導(dǎo)率最高；尾巨桉［27］胚性愈傷組織在附加NAA 0.1 mg/L 與TDZ 0.1 mg/L 的MS 培養(yǎng)基上得到體胚。本試驗(yàn)通過添加NAA與不同濃度的細(xì)胞分裂素（KT、ZT、TDZ）對(duì)‘新球蜜荔’胚性愈傷組織體胚發(fā)生影響的比較發(fā)現(xiàn)，NAA、KT、ZT、TDZ對(duì)體胚發(fā)生均有作用，在添加TDZ 0.5 mg/L、NAA 0.1 mg/L MS 培養(yǎng)基上，體胚發(fā)生數(shù)量達(dá)6 010個(gè)/g FW。隨著激素濃度降低或升高，體胚發(fā)生數(shù)量都降低。適宜濃度KT、ZT組合對(duì)‘新球蜜荔’體胚發(fā)生相對(duì)也較好，體胚發(fā)生數(shù)量達(dá)5 690 個(gè)/g FW。

3.2 體胚成熟及萌發(fā)

ABA 是促進(jìn)體胚成熟最有效的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，常與滲透劑PEG用于促進(jìn)體胚成熟。幾乎所有針葉樹都采用ABA 及PEG 組合來促進(jìn)體胚成熟［28］，其組合ABA常用濃度為10～50 mg/L，PEG常用PEG-8000，使用濃度范圍較大，從20～200 g/L。在培養(yǎng)基中添加0.5 g/L ABA 及PEG 可顯著提高栓皮櫟體胚成熟［32］。香榧體胚成熟處理中PEG-6000 40～80 g/L、ABA10 mg/L 比 較 適 合 體 胚 成 熟［33］。在‘新球蜜荔’體胚成熟過程中，25 g/LPEG-600有一定促進(jìn)作用，ABA 1 mg/L 能改善體胚質(zhì)量。體胚萌發(fā)時(shí)，僅有一個(gè)體胚抽出莖段。因?qū)Τ墒祗w胚形態(tài)并無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，均以成熟體胚具有較高萌發(fā)率作為判斷體胚是否發(fā)育成熟的依據(jù)，很多研報(bào)道提出了可以促進(jìn)體胚成熟發(fā)育的因素但缺乏對(duì)其促進(jìn)機(jī)理的研究，因此探明體胚發(fā)生機(jī)理才能突破體胚成熟發(fā)育不完全，萌發(fā)低的瓶頸。

3.3 體胚發(fā)生過程中的組織形態(tài)學(xué)變化

植物體胚發(fā)生重演合子胚發(fā)生途徑，但體胚發(fā)生部位及發(fā)生方式隨植物種類及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用而異，大部分植物體胚發(fā)生都是單細(xì)胞起源。王天地［34］研究發(fā)現(xiàn)，橡膠體胚發(fā)生部位同時(shí)存在于愈傷組織表層及愈傷組織內(nèi)部的單個(gè)胚性細(xì)胞；Shirin［35］研究發(fā)現(xiàn)，疏花火燒蘭早期體胚起源于愈傷組織表層多個(gè)細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)；Shen［36］發(fā)現(xiàn)，萬年青體胚來源于愈傷組織表層的單個(gè)胚性細(xì)胞。荔枝體胚發(fā)生過程中的組織形態(tài)學(xué)變化已有研究報(bào)道。鄧朝軍［14］指出，三月紅荔枝體胚發(fā)生與合子胚發(fā)生途徑一致；吉訓(xùn)志［37］對(duì)比了2 個(gè)荔枝品種不同荔枝品種體胚發(fā)生初期愈傷組織的形態(tài)變化，指出愈傷組織形態(tài)不同，其體胚發(fā)生能力不同。王果［20］指出，‘妃子笑’荔枝愈傷組織形態(tài)不一，其體胚發(fā)生起源于愈傷組織內(nèi)部單個(gè)胚性細(xì)胞，重演合子胚發(fā)生過程。本研究發(fā)現(xiàn)，‘新球蜜荔’體胚發(fā)生部位既有內(nèi)部又有外部?jī)蓚€(gè)部位，都是單細(xì)胞起源。通過調(diào)整胚性愈傷組織狀態(tài)來改善‘新球蜜荔’體胚形態(tài)多樣且高度不同步化，體胚與愈傷組織黏連或其游離時(shí)間早晚與體胚成團(tuán)是否存在關(guān)系等有待于進(jìn)一步研究。