稀硫酸預(yù)處理對(duì)甘蔗渣成分和酶解效率的影響①

劉 洋 胡小文 姚艷麗

(1 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站 廣東湛江524013;2 廣東省旱作節(jié)水農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心 廣東湛江524013)

甘蔗是中國最大的制糖原料，南方蔗區(qū)甘蔗總產(chǎn)量7 000 多萬t，每年產(chǎn)生的甘蔗渣產(chǎn)量約為2 000 多萬t［1］。甘蔗渣是甘蔗榨糖后的產(chǎn)物，利用其生產(chǎn)燃料乙醇可以實(shí)現(xiàn)廢棄物的再利用。甘蔗渣收集、運(yùn)輸簡便，成本較低，因此利用甘蔗渣生產(chǎn)燃料乙醇具有廣闊的發(fā)展前景［2］。和其他生物質(zhì)原料一樣，甘蔗渣成分主要包括半纖維素、纖維素、木質(zhì)素、灰分等，由于甘蔗渣原料中的半纖維素、纖維素和木質(zhì)素纏繞在一起，阻礙了半纖維素和纖維素與纖維素酶的接觸，從而大大降低了酶解效率［3］，因此必須采取適當(dāng)?shù)念A(yù)處理手段打破原有的晶體結(jié)構(gòu)，增大酶和底物的接觸面積，提高酶解能力。現(xiàn)有的預(yù)處理技術(shù)主要有物理法、化學(xué)法、生物法等［4］，其中稀硫酸處理是一種普遍采用的方法，其優(yōu)點(diǎn)是稀硫酸可以將半纖維素徹底水解成單糖［5］。研究表明，甘蔗渣的半纖維素含量可達(dá)30%以上，因此用稀硫酸水解甘蔗渣可以得到更多的單糖，從而獲得更多的乙醇［6］。前人的研究發(fā)現(xiàn)，在121℃條件下，0.25%～7.0%的稀硫酸濃度和15～240 min 預(yù)處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣的水解效果有顯著影響，可產(chǎn)生24.5 g/L的總糖［7］。而賈彥西［8］的研究發(fā)現(xiàn)，處理溫度是影響還原糖轉(zhuǎn)化效率的最關(guān)鍵因素，稀硫酸濃度、保溫時(shí)間和固液比未見顯著性影響。Cheng等［9］還提出了通過電滲析進(jìn)行酸的再循環(huán)方法，此方法在一定程度上可以增加甘蔗渣中的還原糖產(chǎn)量以及酸的回收利用。為了進(jìn)一步弄清稀硫酸濃度、溫度、固液比和處理時(shí)間哪些條件是影響甘蔗渣預(yù)處理的關(guān)鍵因素，進(jìn)而對(duì)甘蔗渣稀硫酸預(yù)處理?xiàng)l件進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化，本文在前人研究的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)分析不同稀硫酸預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)甘蔗渣成分、固液比、物理結(jié)構(gòu)和酶解效率的影響，以期為今后開展甘蔗渣乙醇生產(chǎn)提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

甘蔗渣來自湛江大華甘蔗制糖企業(yè)，在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院湛江實(shí)驗(yàn)站實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

纖維素酶購自Solarbio 公司，檸檬酸、檸檬酸鈉、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、稀硫酸、苯酚和無水亞硫酸氫鉀購自上海麥克林公司，所用試劑均為分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

FW100 泰斯特粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）、723PCS 鳳凰紫外可見分光光度計(jì)（上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司）、SHZ-DIII 予華牌循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）、RU-T-15超純水系統(tǒng)（上海同田儀器有限公司）、THZ-82 國立恒溫氣浴搖床（常州市國立試驗(yàn)設(shè)備研究所）、DHG-9123A 鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、DS3200 普洛帝超聲波振蕩器（陜西普洛帝測控技術(shù)有限公司）、H1850R 湘儀冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 不同稀硫酸濃度處理

在100 mL 三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1∶20（g/mL）的固液比分別加入濃度（V/V）為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的稀硫酸溶液，使固體和液體充分混勻后在滅菌鍋內(nèi)120℃下反應(yīng)30 min，冷卻，中和，抽濾，然后將液體定容至100 mL容量瓶中，備用。

1.2.2 不同固液比處理

在100 mL 三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按固液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL）分別加入濃度（V/V）為2.0%的稀硫酸溶液，使固體和液體充分混勻后在滅菌鍋內(nèi)120℃下反應(yīng)30 min，冷卻，中和，抽濾，然后將液體定容至100 mL容量瓶中，備用。

1.2.3 處理溫度

在100 mL 三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1∶15（g/mL）的固液比分別加入濃度（V/V）為2.0%的稀硫酸溶液，使固體和液體充分混勻后在滅菌鍋內(nèi)105、110、115、120 和125℃的溫度下反應(yīng)30 min，冷卻，中和，抽濾，然后將液體定容至100 mL 容量瓶中，備用。

1.2.4 處理時(shí)間

在100 mL 三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1∶15（g/mL）的固液比分別加入濃度（V/V）為2.0%的稀硫酸溶液，使固體和液體充分混勻后在滅菌鍋內(nèi)120℃的溫度下分別反應(yīng)30、45、60、90、120 min，冷卻，中和，抽濾，然后將液體定容至100 mL容量瓶中，備用。

1.2.5 樣品水解液的總還原糖含量的測定

取適當(dāng)稀釋處理的濾液1 mL 于20 mL 比色管中，加入5 mL 去離子水，然后加入1.5 mL 的顯色液，塞好蓋搖勻，沸水浴5 min，取出流水冷卻后用去離子水定容至20 mL，于540 nm 波長下測定吸光度，通過下列公式計(jì)算還原糖含量：

1.2.6 固體得率的測定

試樣經(jīng)稀硫酸處理后固體部分用蒸餾水沖洗至中性，用G3號(hào)砂芯漏斗抽濾，于105℃烘箱烘至恒重，計(jì)算其固體得率。

1.2.7 纖維素酶液制備

檸檬酸鈉緩沖液0.05 mol/L pH 4.8 配制（分別配制A、B 液，然后按一定比例混合）參考賈彥西［8］的方法進(jìn)行。

1.2.8 酶活性測定

酶活測定依照美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室出版的方法《Measurement of Cellulase Activities》［10］和韋斌如［11］建立的pNPG 比色法。

還原糖濃度測定采用DNS法（3，5-二硝基水楊酸法）［12］。

1.2.9 甘蔗渣成分測定

甘蔗渣中半纖維、纖維素和木質(zhì)素測定參考國際生物能源中心提供的方法《Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Bio‐mass》（2007-6-1）［13］，Klason木質(zhì)素的測定參考國標(biāo)GB/T 747—2003［14］。

上述實(shí)驗(yàn)設(shè)置對(duì)照（CK）均為未經(jīng)過任何處理的甘蔗渣原料。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 7.0軟件中的單因素方差分析模塊（ANOVA） 進(jìn)行分析，p＜0.05 為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度稀硫酸處理對(duì)甘蔗渣主要成分的影響

不同濃度稀硫酸處理對(duì)半纖維素和纖維素影響較大，隨著酸濃度的增加，半纖維素和纖維素含量逐漸降低，在稀硫酸濃度為0.5%時(shí)，半纖維素含量和纖維素含量均最高，分別為11.44%和60.9%；在稀硫酸濃度為2.5%時(shí)，半纖維素含量和纖維素含量分別下降到0.09%和40.25%。木質(zhì)素含量隨著硫酸濃度的增大基本保存不變（圖1）。

不同溫度處理對(duì)半纖維素和纖維素影響較大，當(dāng)溫度上升到125℃時(shí)，半纖維素和纖維素含量下降到最低，為1.62%和46.25%；在溫度為105℃時(shí)，半纖維素和纖維素含量最高，為2.83%和50.23%；在105～125℃，溫度的升高對(duì)半纖維素和纖維素的含量影響并不十分顯著。隨著溫度的升高，木質(zhì)素含量從14.02%下降到13.02%，但下降幅度不大（圖2）。

相比稀硫酸濃度和溫度，固液比對(duì)甘蔗渣半纖維素含量影響不明顯，而對(duì)纖維素含量則呈先降低后升高的趨勢(shì)。在固液比為1∶25時(shí)，半纖維素和纖維素含量最低，為1.6%和31.28%；在固液比為1∶15時(shí)，木質(zhì)素含量最低，為12.58%。固液比為1∶10時(shí)，半纖維素含量、纖維素含量和木質(zhì)素 含 量 均 最 高， 分 別 為8.97%、 52.35% 和14.45%（圖3）。

隨著處理時(shí)間的增加，纖維素含量和木質(zhì)素含量均呈逐漸下降的趨勢(shì)，處理時(shí)間從30 min 到120 min，半纖維素含量由15.5%下降到1.87%，木質(zhì)素含量由14.02%下降到13.02%。纖維素含量在處理45 min后，基本保持不變，約49%（圖4）。

2.2 不同稀硫酸處理對(duì)甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)的影響

對(duì)不同稀硫酸處理后的甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)進(jìn)行電鏡觀察照相，結(jié)果表明：不同濃度稀硫酸、溫度、固液比和處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)都有不同程度的影響。沒有經(jīng)過稀硫酸處理的樣品結(jié)構(gòu)比較完整，原料表面平整光滑，纖維素排列整齊，沒有出現(xiàn)小孔和裂縫（圖5-A 和5-E）。而用1%或3%濃度的稀硫酸處理后，可清晰觀察到蔗渣原料結(jié)構(gòu)受到破壞，蔗渣內(nèi)部結(jié)構(gòu)變得疏松，蔗渣表面開始出現(xiàn)纖維碎片和小孔（圖5-D 和5-H）。125℃處理甘蔗渣后也可以觀察到甘蔗渣表面出現(xiàn)多個(gè)孔洞，甚至出現(xiàn)較大的縫隙，木質(zhì)素和纖維素結(jié)構(gòu)已基本破壞。不同固液比對(duì)甘蔗渣處理后甘蔗渣表面出現(xiàn)一定程度的破壞，但效果不明顯，大部分結(jié)構(gòu)還保持原狀（圖6-D）。固液比為1∶30時(shí)，甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)破壞較大（圖7）。處理時(shí)間對(duì)甘蔗渣影響較大，處理120 min 后，甘蔗渣表面開始出小孔，進(jìn)一步處理后，蔗渣表面變得凹凸不平，纖維素出現(xiàn)部分剝離，表面小孔增多（圖8-H）。

2.3 不同稀硫酸處理對(duì)酶解效率的影響

利用不同預(yù)處理?xiàng)l件下的稀硫酸預(yù)處理甘蔗渣，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：隨著稀硫酸濃度的增加，原料表面可及表面積逐漸增加，降解效率也逐漸提高，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增加；當(dāng)稀硫酸濃度超過1.5%后，隨著濃度增加，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加幅度略有放緩（圖9-A）。所以，選擇稀硫酸濃度為1.5%～2.5%。隨著溫度的升高，木質(zhì)素和纖維素分離加快，還原糖含量也不斷增加；當(dāng)溫度上升至115℃以后，糖含量增加趨勢(shì)放緩（圖9-B）。因此，選擇溫度范圍為115～125℃。隨著固液比的增加，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)先增加后趨于平穩(wěn)，固液比為1∶10 到1∶15 時(shí)，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加比較明顯，這是因?yàn)楫?dāng)固液比低于1∶10時(shí)，木質(zhì)素不易被脫除，當(dāng)增加到一定程度后，還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與固液比達(dá)到一個(gè)平衡點(diǎn)，因此最佳固液比為1∶20（圖9-C）。上述結(jié)果表明，如果處理時(shí)間太短，木質(zhì)素不能完全被稀硫酸脫除，水解效率將受到極大的影響；如果處理時(shí)間過長，纖維素部分容易被溶解而處理液中的糖含量減少。因此，考慮糖產(chǎn)量和節(jié)約時(shí)間的問題，處理時(shí)間90 min左右較為合理（圖9-D）。

固體得率隨著稀硫酸濃度、處理溫度和處理時(shí)間逐漸下降，當(dāng)下降到0.7左右時(shí)，下降速率明顯變慢，最終趨于平緩（圖10-A、9-B和9-C）。隨著固液比的增高，固體得率先下降，當(dāng)固液比為1∶20時(shí)，固體得率又有所上升（圖10-D）。

3 結(jié)論與討論

利用稀硫酸預(yù)處理甘蔗渣，不同的處理?xiàng)l件對(duì)甘蔗渣成分均存在一定程度的影響。隨著稀硫酸濃度、溫度和處理時(shí)間的增加，半纖維素、纖維素和木質(zhì)素逐漸降低，因?yàn)橛孟×蛩崽幚砀收嵩鼤r(shí)，酸可以破壞細(xì)胞壁，從而使半纖維素溶解，同時(shí)一部分木質(zhì)素也遭到破壞分解成糖醛酸和乙酸酯，從而降低纖維素的結(jié)晶度。通過該方法，可以將甘蔗渣中的半纖維素和纖維素水解，同時(shí)還可以消化部分木質(zhì)素［15-16］。稀硫酸的濃度和處理溫度越高，處理時(shí)間越長，甘蔗渣物理結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重，研究還表明，稀硫酸可以有效地降解木聚糖。因此，用稀硫酸處理甘蔗渣，不但可以提高纖維素酶的效率，還可以節(jié)省半纖維素酶的用量［17-18］。本研究還發(fā)現(xiàn)，稀硫酸濃度、處理時(shí)間和溫度對(duì)甘蔗渣影響較大，但不同固液比對(duì)甘蔗渣成分影響沒有明顯的規(guī)律，表明固液比不是稀硫酸預(yù)處理甘蔗渣的關(guān)鍵因素。

使用稀硫酸預(yù)處理甘蔗渣后，甘蔗渣的物理結(jié)構(gòu)破壞比較嚴(yán)重。綜合來看，稀硫酸濃度、處理時(shí)間和溫度對(duì)物理結(jié)構(gòu)影響較大。這是因?yàn)樵诟收嵩?，半纖維素主要以粘合劑方式存在于細(xì)胞壁各薄層間，且分布在纖維細(xì)胞壁的次生壁外層，因而用稀硫酸處理后，半纖維素被水解，纖維細(xì)胞壁開始分層，原料表面隨即變得粗糙并出現(xiàn)小孔［19］。進(jìn)一步增加酶解的時(shí)間或者溫度，蔗渣表面就會(huì)變得凹凸不平，纖維素開始剝離，表面小孔逐漸增多。但有些酶解后的原料殘?jiān)Y(jié)構(gòu)仍較完整，這是由于相比半纖維素來說，纖維素水解較為困難，酶解后的蔗渣仍含有較多未被水解的纖維素，它們與木素緊密連接在一起，很難被分離。

本研究發(fā)現(xiàn)，稀硫酸濃度和處理溫度對(duì)固體得率影響較大，1.5%左右的稀硫酸濃度和125℃左右的處理溫度，固體得率最低。當(dāng)下降到0.7左右時(shí)，下降速率明顯變慢，最終趨于平緩（圖9-A）。這也說明，當(dāng)稀硫酸濃度增高時(shí)，過量的稀硫酸對(duì)半纖維素和碳水化合物的損害作用增加，多余的稀硫酸還會(huì)使化學(xué)反應(yīng)變慢，使固體得率趨于平穩(wěn)。

和甘蔗渣成分相比較，酶解過程更為復(fù)雜，在較低的稀硫酸濃度、處理溫度和處理時(shí)間，還原糖含量上升比較明顯，但過高的稀硫酸濃度，預(yù)處理溫度和時(shí)間都會(huì)阻礙酶解的進(jìn)行。隨著濃度增加，有效酸對(duì)碳水化合物的損害作用增加，多余的稀硫酸會(huì)使纖維素遭到破壞。當(dāng)濃度上升至2.0%和溫度上升到120℃以后，還原糖含量增加速率開始變慢。這是由于當(dāng)濃度和溫度升高到一定值時(shí)，糖開始變得不穩(wěn)定，部分糖還會(huì)發(fā)生分解反應(yīng)，生成糠醛等副產(chǎn)物，使還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加變慢。

經(jīng)過不同處理對(duì)甘蔗渣處理的結(jié)果，得出最佳的處理?xiàng)l件為：稀硫酸濃度2.0%，溫度125℃，固液比1∶20，處理時(shí)間90 min。在這個(gè)條件下，甘蔗渣降解成還原糖的效率最高，還原糖濃度約在46%。