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    慢性乙型肝炎患者外周血TRECs與CD45+T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的臨床意義

    2018-12-18 01:15:10王琛張永樂(lè)潘克女
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2018年23期
    關(guān)鍵詞:實(shí)時(shí)熒光定量PCR慢性乙型肝炎

    王琛 張永樂(lè) 潘克女

    [摘要] 目的 探討慢性乙型肝炎患者外周血中T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)(TRECs)含量以及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的臨床意義。 方法 流式細(xì)胞技術(shù)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)32例輕度慢乙肝患者、42例中度慢乙肝患者、38例重度慢乙肝患者以及30例健康對(duì)照人群外周血中TRECs的含量以及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)。 結(jié)果 慢性乙型肝炎患者中輕、中、重組以及健康對(duì)照組間相比CD3+/CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+變化均無(wú)明顯差異(P>0.05);CD8+CD45RA+均有不同程度的下降,尤其在重度組中下降最為明顯,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),CD8+CD45RO+存在明顯的升高,同樣在重度組中升高最為顯著具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);TRECs含量慢乙肝組較正常對(duì)照組明顯降低(P<0.05);在慢性乙型肝炎患者中輕、中、重慢乙肝組間TRECs含量也存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論 TRECS是胸腺近期輸出功能指標(biāo),能夠反映慢性乙型肝炎近期免疫功能,外周血TRECS與CD45+T淋巴細(xì)胞亞群聯(lián)合檢測(cè)較常規(guī)CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群更能全面了解慢性乙型肝炎的進(jìn)展及預(yù)后。

    [關(guān)鍵詞] T細(xì)胞受體重排刪除環(huán);CD45;慢性乙型肝炎;實(shí)時(shí)熒光定量PCR;流式細(xì)胞技術(shù)

    [中圖分類號(hào)] R512.62 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2018)23-0008-04

    Clinical significance of TRECs and CD45+T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B

    WANG Chen1 ZHANG Yongle2 PAN Kenv1 LV Tiefeng1

    1.Department of Hepatology, Hangzhou XIXI Hospital, Hangzhou 310023, China; 2.Clinical Laboratory, Tongde Hospital of Zhejiang Province, Hangzhou 310012, China

    [Abstract] Objective To investigate the content of T cell receptor rearrangement(TRECs) and the expression of CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+, CD8+CD45RA+, CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with chronic hepatitis B. Methods The content of TRECs and the expression of CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+, CD8+CD45RA+, CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets in peripheral blood of 32 patients with mild chronic hepatitis B, 42 patients with moderate chronic hepatitis B, 38 patients with severe chronic hepatitis B and 30 healthy controls were detected by real-time fluorescence quantitative PCR and flow cytometry. Results There was no significant difference in CD3+/CD4+/CD8+, CD4+CD45RA+, CD4+CD45RO+T lymphocyte subsets between mild, moderate, recombinant and healthy controls in patients with chronic hepatitis B(P>0.05); CD8+CD45RA+T lymphocyte subsets decreased in all groups, especially in the severe group, and the difference was statistically significant(P<0.05); CD8+CD45RO+T lymphocyte subsets were significantly increased in all groups, the most significant increase in the severe group was statistically significant(P<0.05); Compared with the normal control group, the content of TRECs in the chronic hepatitis B group was significantly decreased(P<0.05); There was also a significant difference in TRECs content between mild, moderate and severe hepatitis B groups(P<0.05). Conclusion TRECs is a short-term output function of thymus, can respond to the recent immune function of chronic hepatitis B.Compared with conventional CD4+ and CD8+T lymphocyte subsets, TRECs and CD45+T lymphocyte subsets were able to fully understand the progression and prognosis of chronic hepatitis B.

    [Key words] T cell receptor rearrangement; CD45; chronic hepatitis B; Real-time fluorescence quantitative PCR; Flow cytometry

    乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染肝細(xì)胞后,HBV不是直接殺傷肝細(xì)胞,而是誘導(dǎo)被感染者主動(dòng)、被動(dòng)免疫應(yīng)答造成肝細(xì)胞損傷。T淋巴細(xì)胞亞群失衡、功能障礙是導(dǎo)致乙型肝炎慢性化的主要原因;胸腺是人體免疫特別是細(xì)胞免疫的重要器官,誘導(dǎo)T細(xì)胞分化和成熟,胸腺功能的表達(dá)在HBV感染慢性化的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后過(guò)程中具有重要的意義[1]。筆者采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)健康人群、不同程度(輕、中、重)的慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血PBMCs中TRECs的含量及外周血中CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)分析,探討慢性乙型肝炎的病情進(jìn)展與TRECs及CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞亞群間的關(guān)系。

    1 對(duì)象與方法

    1.1研究對(duì)象

    收集2016年1~12月在杭州市西溪醫(yī)院住院治療的慢性乙型肝炎患者112例,診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2015中國(guó)《慢性乙型肝炎防治指南》[2],排除其他嗜肝病毒感染致肝損以及其他導(dǎo)致肝臟損傷的相關(guān)疾病。其中32例輕度慢乙肝患者、42例中度慢乙肝患者、38例重度慢乙肝患者,男65例,女47例,年齡分布為25~40歲,平均年齡31.9歲;2016年本院職工健康體檢30例為對(duì)照組。各組年齡和性別分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,見表1。

    1.2 儀器與試劑

    流式細(xì)胞儀:美國(guó)Beckman Coulter公司CF 500流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀;高速冷凍離心機(jī)和連續(xù)可調(diào)移液器均為德國(guó)Eppendorf公司生產(chǎn);實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為美國(guó)AB公司生產(chǎn)型號(hào) Stepone Plus。試劑:美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)的淋巴細(xì)胞分離試劑以及CD3+/CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞和CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞試劑;PCR測(cè)定所需Buffer液、DNTP、Taq酶等原料購(gòu)自TaKaRa Biotec;引物、探針由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,廣州藍(lán)博生物科技有限公司生產(chǎn)外周淋巴細(xì)胞分離液及核酸抽提試劑。

    1.3 方法

    采用流式細(xì)胞計(jì)數(shù)進(jìn)行檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù);采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行TRECs含量檢測(cè)。

    1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用EDTA抗凝管抽取全血2 mL(每mL新鮮全血中加1.8 mg EDTA抗凝)。吸取CD3+PE/CD4+FTTC/CD8+PC5三色試劑10 μL,試劑批號(hào)為:SWP201602;吸取CD4+ FTTC/CD45RA+ PE/CD45RO+ PC5三色試劑10 μL,試劑批號(hào)為:SWP201605;吸取CD8+ FTTC/CD45RA+ PE/CD45RO+ PC5三色試劑10 μL,試劑批號(hào)為:SWP201604,分別置于三支潔凈試管中,再分別加入50 μL全血,充分混勻,室溫避光放置20 min。加入1 mL細(xì)胞裂解液,充分混勻,避光室溫放置15 min,加入2 mL PBS液充分混勻,1000 rpm離心5 min,棄上清用吸紙吸干殘留液體。向試管中加入0.5 mL PBS液混勻,進(jìn)行流式細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)。使用CXP系統(tǒng)設(shè)定檢測(cè)淋巴細(xì)胞數(shù)量>2000個(gè),對(duì)預(yù)檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行設(shè)門檢測(cè)。

    1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)TRECs EDTA抗凝血1 mL,用PBS 1:1進(jìn)行稀釋后,輕輕轉(zhuǎn)入1 mL的淋巴分離液中,水平冷凍離心機(jī)2500 rpm離心15 min,吸取中間層漂浮云霧狀物置于1.5 mL離心管,12000 rpm離心10 min棄上清,在沉淀中加入50 μL DNA抽提液100℃,煮沸10 min,12000 rpm離心5 min取上清5 μL為模板進(jìn)行下一步PCR檢測(cè)。TRECs實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)總反應(yīng)體系為50 μL,其中上下游引物各0.5 μmol/L; dNTP各0.2 mmol/L;Taq酶1.5U;熒光探針0.1 μmol/L;Mg2+ 4 mmol/L;模板或標(biāo)準(zhǔn)品5 μL;加雙蒸水補(bǔ)足50 μL;反應(yīng)條件設(shè)置為94℃ 2 min;94℃ 30 sec;56℃ 45 sec運(yùn)行40個(gè)循環(huán),保存結(jié)果,自動(dòng)分析。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以(x±s)表示,兩組數(shù)據(jù)間的關(guān)系采用線性相關(guān)分析法,多組數(shù)據(jù)比較采取單因素方差分析法;計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 淋巴細(xì)胞亞群在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間比較

    外周血CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+、CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+T細(xì)胞亞群百分比計(jì)數(shù)在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05),CD8+CD45RA+T細(xì)胞百分比在健康對(duì)照組以及慢性乙型肝炎輕度、中度、重度組中呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì),存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);CD8+CD45RO+T細(xì)胞百分比在健康對(duì)照組以及慢性乙型肝炎輕度、中度、重度組中呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì),存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表2。

    2.2 TRECs含量在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間比較

    TRECs含量在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間含量分別為(5.82±1.87)logcopies/106 PBMCs、(5.11±1.42)logcopies/106 PBMCs、(4.05±1.15)logcopies/106 PBMCs、(6.42±2.02)logcopies/106 PBMCs;各組間比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見表3。

    3討論

    乙肝病毒(HBV)感染可導(dǎo)致患者呈現(xiàn)急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化甚至肝癌的發(fā)生[3]。實(shí)驗(yàn)表明HBV感染的病情進(jìn)展與患者特異性的T細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)弱有著密切關(guān)系[4]。調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群,它能夠負(fù)向調(diào)節(jié)針對(duì)自身和外來(lái)抗原的免疫反應(yīng)[5-6]。在調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞中又可分為原始幼稚性CD45RA+T淋巴細(xì)胞(原始T淋巴細(xì)胞)和記憶性CD45RO+T淋巴細(xì)胞。CD45RO+T細(xì)胞表現(xiàn)為記憶細(xì)胞的特性,具有輔助誘導(dǎo)作用;而CD45RA+T細(xì)胞卻表現(xiàn)為初始的T細(xì)胞特點(diǎn),具有抑制免疫的作用[7-8]。因此CD45RA+T淋巴細(xì)胞和CD45RO+T淋巴細(xì)胞常用來(lái)作為疾病活動(dòng)、復(fù)發(fā)和療效的判斷,具有很重要的臨床意義[9]。

    本文對(duì)慢性乙型肝炎輕度、中度、重度以及健康對(duì)照者的外周血中CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+、CD8+CD45RA+、CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞表達(dá)進(jìn)行研究,通過(guò)實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)外周血CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+細(xì)胞亞群百分比計(jì)數(shù)在慢性乙型肝炎輕度、中度、重度及健康對(duì)照組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。慢性乙型肝炎輕度、中度、重度感染者與健康對(duì)照者相比CD8+CD45RA+T細(xì)胞明顯減低,CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞明顯增高,而CD4+CD45RA+、CD4+CD45RO+T細(xì)胞無(wú)明顯改變,這一結(jié)論提示,在慢性乙型肝炎感染中常規(guī)檢測(cè)CD3+/CD4+/CD8+細(xì)胞亞群并不能反映疾病感染的狀態(tài),與俞立飛等[10]報(bào)告一致。而CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞在乙型肝炎的慢性化過(guò)程中起到重要作用,與慢性乙型肝炎患者病情進(jìn)展呈正相關(guān)[11]。這一現(xiàn)象可能與CD8+CD45RA+T原始幼稚淋巴細(xì)胞的持續(xù)存在,當(dāng)乙肝病毒持續(xù)感染肝細(xì)胞時(shí)大量CD8+CD45RA+T原始幼稚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為CD8+CD45 RO+T記憶性淋巴細(xì)胞,因此出現(xiàn)隨著肝病程度的加重CD8+CD45RA+T百分比下降,而CD8+CD45RO+T百分比上升。CD8+CD45RO+T淋巴細(xì)胞的增多發(fā)揮其免疫誘導(dǎo)作用,進(jìn)而致使機(jī)體殺傷感染HBV肝細(xì)胞,導(dǎo)致更多的肝細(xì)胞壞死,加重肝臟的嚴(yán)重程度。

    在臨床實(shí)踐中獲取胸腺組織了解胸腺功能變化并不現(xiàn)實(shí)。因此,胸腺功能的評(píng)估通常使用能夠反映胸腺近期輸出功能的間接指標(biāo)[12]。TRECs是一種可穩(wěn)定存在的游離基因,其不隨T細(xì)胞分裂增殖而擴(kuò)增,而是隨著T細(xì)胞分裂增殖而逐漸稀釋,所以測(cè)定TRECs含量可以了解初始T細(xì)胞的含量[13]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究表明外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)中T細(xì)胞受體重排刪除環(huán)(TRECs)含量能反映機(jī)體近期胸腺輸出功能。如早在1998年,Douek等[14]首先報(bào)道使用TRECs來(lái)評(píng)價(jià)HIV-1感染者的胸腺功能;馬旭明等[15]發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者Treg細(xì)胞中TREC的數(shù)量明顯減少?;颊逤D31+ Treg比例的下調(diào)與Treg細(xì)胞中TRECs數(shù)量的減少呈正相關(guān);李文言等[16]利用TRECs含量評(píng)價(jià)丙種球蛋白缺乏血癥患兒的胸腺輸出功能;李曉勇等[17]通過(guò)切除小鼠胸腺后檢測(cè)TRECs含量證實(shí)胸腺切除后TRECs明顯降低,這一現(xiàn)象不僅發(fā)生在幼鼠對(duì)成年小鼠的影響也極其大。

    本文對(duì)慢性乙型肝炎輕度、中度、重度以及健康對(duì)照組的外周血進(jìn)行TRECs含量的檢測(cè),結(jié)果分別為(5.82±1.87)logcopies/106 PBMCs、(5.11±1.42)logcopies/106PBMCs、(4.05±1.15)logcopies/106PBMCs、(6.42±2.02)logcopies/106PBMCs,健康對(duì)照組的TRECS含量明顯高于慢性乙型肝炎患者(輕、中、重),在慢乙肝患者輕、中、重度組中也存在差異,隨著肝炎程度的加重TRECs含量也明顯降低,這一結(jié)論與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道一致[18-20],表明慢性乙型肝炎患者外周血T細(xì)胞數(shù)量減少與胸腺近期輸出功能降低有關(guān),并且肝臟炎癥程度越重機(jī)體免疫輸出功能越低。

    綜上所述,在慢性乙型肝炎感染患者中常規(guī)的CD3+/CD4+/CD8+細(xì)胞亞群百分比計(jì)數(shù)并不能評(píng)價(jià)患者的免疫狀態(tài),CD45 RA+/RO+T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)能反映出慢乙肝患者的原始幼稚淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)換記憶性淋巴細(xì)胞的過(guò)程,尤其CD8+CD45RO+T對(duì)慢性乙肝肝炎起到重要作用與病情呈正相關(guān);TRECs含量能反映出慢乙肝患者胸腺近期輸出的功能,因此在慢性乙型肝炎感染患者進(jìn)行CD8+CD45RO+T和TRECs檢測(cè)能全面評(píng)估患者免疫狀態(tài)。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2018-01-26)

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