液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測豬肉中20種違禁藥物殘留的研究

懷文輝，李 建，倪香艷，張晶晶，魏紫嫣，李文輝，趙 瑩，孫志文

（北京市獸藥監(jiān)察所，北京102600）

動物產(chǎn)品中的違禁藥物主要包括糖皮質(zhì)激素、腎上腺激素、性激素及β腎上腺素受體激動劑等，因其具有縮短動物生長周期的作用而常被用于養(yǎng)殖生產(chǎn)中［1］。該類藥物具有致突變、致畸形、致癌的潛在危害［2］。研究指出，兒童性早熟、婦女乳腺癌和子宮癌發(fā)病率的上升與動物源性食品中性激素攝入有關(guān)［3］。 農(nóng)業(yè)部相關(guān)公告曾明確規(guī)定［2］，孕激素、性激素、同化激素及化學合成類激素等在動物性食品中不得檢出，在體育比賽中為不得使用的違禁藥物。目前，違禁藥物殘留檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法［4］、液相色譜法［5］、氣相色譜-質(zhì)譜法［6］及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［7-8］等。酶聯(lián)免疫法具有較高靈敏度，但容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果［2］；HPLC法抗干擾能力較差，且靈敏度不能滿足痕量殘留檢測的要求；GC-MS法樣品衍生化前處理繁瑣耗時。LC-MS／MS方法由于無需對樣品進行衍生化處理，并具有抗干擾能力強、定性能力強、靈敏度高等優(yōu)點，是該類藥物殘留檢測的發(fā)展方向。但目前尚無同時檢測多大類違禁藥物殘留的高通量檢測方法，現(xiàn)有的LC-MS／MS檢測方法通常僅針對單類藥物的殘留檢測，檢測效率低，成本較高，難以滿足不斷增加的監(jiān)管檢測任務(wù)的要求。

本研究將樣品酸水解，以乙酸乙酯提取豬肉中的違禁藥物，并以低溫冷凍后離心結(jié)合固相萃取的方法除脂，建立了豬肉中20種違禁藥物殘留同時測定的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，具有快速、準確的優(yōu)點，可顯著提高違禁藥物多殘留檢測效率。

1 材 料

1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Waters公司，Xevo TQ-S）；電子分析天平（北京賽多利斯有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛明儀器有限公司）；冷凍離心機（美國Sigma公司）；氮吹儀（美國Caliper公司）；Oasis Prime HLB固相萃取柱（6 mL，200 mg）、固相萃取柱裝置（美國 Waters公司）。

1.2 試劑 克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、噴布特羅、西馬特羅、甲基睪酮、丙酸睪酮、大力補、群勃龍、睪酮、黃體酮、氟氫可的松、氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、玉米赤霉烯酮（Dr.Ehrenstorfer公司），純度≥98.0%。 甲醇、氨水、甲酸、乙腈、乙酸銨、甲酸銨、氫氧化鈉、硫酸鎂（國藥集團）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的配制

2.1.1 標準儲備液的配制 精密稱取10 mg克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、噴布特羅、西馬特羅、甲基睪酮、丙酸睪酮、大力補、群勃龍、睪酮、黃體酮、氟氫可的松、氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮、睪酮-D3、黃體酮-D9、玉米赤霉烯酮-D4、玉米赤霉醇-D5、地塞米松-D5、氟氫可的松-D5、克侖特羅-D9、萊克多巴胺-D5、沙丁胺醇-D3，分別置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為0.1 mg／mL標準貯備液。-20℃避光保存?？藗愄亓_、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林、噴布特羅、西馬特羅、甲基睪酮、丙酸睪酮、大力補、群勃龍、睪酮、黃體酮、氟氫可的松、氫化可的松、潑尼松、潑尼松龍、地塞米松、倍他米松、倍氯米松標準儲備液有效期6個月。玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮標準貯備液有效期3個月。

2.1.2 標準工作液的配制 精密量取 0.1 mg／mL 標準儲備液各1.0 mL，于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度為1 μg／mL混合標準工作液。 精密量取1 μg／mL混合標準工作液0.5 mL，于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度為0.05 μg／mL的混合標準工作液。

2.2 樣品前處理

2.2.1 樣品的提取 準確稱?。?±0.05）g 試樣于50 mL 離心管中，加入內(nèi)標工作液 0.1 mL，0.1 mol／L鹽酸2 mL，渦旋混勻后50℃超聲波處理20 min。以10 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 10.0。加入乙酸乙酯20 mL，振蕩 10 min。-20℃冷凍 30 min。5000 r／min離心10 min。上清轉(zhuǎn)移至雞心瓶。下層用乙酸乙酯20 mL如上重復(fù)提取1次，離心，合并上清。40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。加入乙腈氨水溶液（氨水 ∶乙腈 ∶水，3∶5∶92）5 mL溶解殘渣，備用。

2.2.2 樣品的凈化 Oasis Prime HLB固相萃取柱（6 mL，200 mg）依次用甲醇、水各6 mL活化，取全部備用液過柱，用乙腈氨水溶液（氨水∶乙腈 ∶水，3∶5∶92）6 mL淋洗，抽干。以洗脫液（乙酸乙酯 ∶甲醇，6∶4）6 mL洗脫，收集洗脫液，40℃下氮氣吹干。加入樣品復(fù)溶液（乙腈 ∶10 mmol／L甲酸銨溶液，5∶95）0.5 mL溶解殘余物，-20℃冷凍30 min。 15000 r／min 離心5 min，上清液過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.3 儀器測定條件

2.3.1 液相色譜條件 Waters Acquity BEH C18 反相色譜柱（規(guī)格 50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A：水，流動相 B：乙腈；流速：0.25 mL／min；進樣量：10 μL，柱溫40℃。梯度洗脫條件見表1。結(jié)果表明該色譜條件分離藥物效果良好（圖1、圖2）。

表1 色譜梯度洗脫條件Tab 1 Program of gradient elution

2.3.2 質(zhì)譜測定條件

2.3.2.1 正離子掃描模式 離子源：電噴霧（ESI）離子源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓：2.0 kV；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：150 L／h；霧化氣流速：700 L／h。母離子、子離子質(zhì)譜參數(shù)見表2。結(jié)果表明，在該條件下各藥物質(zhì)譜響應(yīng)靈敏度較高。

2.3.2.2 負離子掃描模式 離子源：電噴霧（ESI）離子源；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測；電離電壓：2.0 kV；霧化溫度：450℃；錐孔氣流速：150 L／h；霧化氣流速：700 L／h。母離子、子離子質(zhì)譜參數(shù)見表2。結(jié)果表明，在該條件下各藥物質(zhì)譜響應(yīng)靈敏度較高。

2.4 線性關(guān)系考察 取空白樣品，加入適量內(nèi)標，經(jīng)提取和凈化后，添加系列標準溶液，制得濃度為1、2、5、10、100 μg／kg 的基質(zhì)匹配標準溶液，40 ℃氮氣吹干。殘余物以樣品復(fù)溶液0.5 mL溶解，-20℃放置30 min。15000 r／min高速離心5 min，取上清過0.22 μm濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。以特征離子質(zhì)量色譜峰面積與相應(yīng)內(nèi)特征離子質(zhì)量色譜峰面積之比為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制基質(zhì)匹配標準曲線。結(jié)果見表3、表4。 表明本方法在 1～100 μg／kg濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 準確度和精密度考察 準確稱取空白樣品（5±0.05）g 于 50 mL 離心管，準確加入濃度為0.05 μg／mL 的混合標準工作液適量，配制成添加濃度分別為 0.5、5、10 μg／kg 的樣品，充分混勻。 按照2.2～2.4項方法進行測定，每個濃度設(shè)5個平行，連續(xù)做3 d，計算添加回收率、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)，結(jié)果見表 5。方法的回收率在63.9%～117%范圍內(nèi)。 批內(nèi)變異系數(shù) 1.9%～9.1%，批間變異系數(shù)4.9%～13.1%。表明方法準確度高，精密度較好。

2.6 檢出限和定量限的確定 準確稱取空白樣品，分別準確加入適量混合標準工作液，配制成不同濃度的添加樣品。按照2.2～2.4項方法進行測定，根據(jù)色譜峰對峰的響應(yīng)值比值，信噪比（S／N）等于3時的藥物濃度確定為方法檢出限，信噪比等于10時的藥物濃度確定為方法定量限。結(jié)果表明，本文建立的檢測方法的檢出限為0.5 μg／kg，定量限為 1.0 μg／kg。

2.7 樣本檢測結(jié)果 采用本方法對本地屠宰加工企業(yè)、養(yǎng)殖廠、大型批發(fā)市場豬產(chǎn)品開展樣品違禁藥物檢測。完成40個豬肉樣品的檢測。氫化可的松和黃體酮有少量檢出，濃度較低。

表2 藥物MRM參數(shù)Tab 2 Mass parameters of 20 banned drugs

表3 藥物標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r2）（ESI+）Tab 3 Regression equations， correlation coefficients of the banned drugs（r2）（ESI+）

表4 藥物標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)（r2）（ESI-）Tab 4 Regression equations， correlation coefficients of the banned drugs（r2）（ ESI-）

表5 豬肉添加樣品檢測準確度及精密度Tab 5 Recoveries and RSDs of the banned drugs spiked in porcine muscle samples

續(xù)表

圖1 藥物混合標準溶液提取離子色譜圖（ESI+）（1.0 ng／mL）Fig 1 Extracted ion chromatograms of the illicit drugs（ESI+）（1.0 ng／mL）

圖2 藥物混合標準溶液提取離子色譜圖（ESI-）（1.0 ng／mL）Fig 2 Extracted ion chromatograms of the illicit drugs（ESI-）（1.0 ng／mL）

3 討論與分析

3.1 提取方法的選擇 違禁藥物脂溶性通常較強，可溶于甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑，易溶于三氯甲烷，但三氯甲烷毒性較大，很少選用。相關(guān)研究指出［9-10］，乙酸乙酯和乙腈的提取效果較好?？紤]到提取過程中雜質(zhì)干擾和回收率測定，乙腈提取易使樣品結(jié)團，乙酸乙酯提取則不易結(jié)團，振蕩混勻效果好，且濃縮過程中耗時短，因此，選用乙酸乙酯為前處理提取試劑。

3.2 凈化方法的選擇 樣品雜質(zhì)主要為蛋白質(zhì)、脂類及極性小分子成分。本文建立的方法是同時檢測多大類藥物殘留，提取和檢測儀器方法原理存在差異，因此，盡量減低基質(zhì)效應(yīng)是方法要解決的關(guān)鍵問題。蛋白質(zhì)和極性小分子成分可通過有機試劑去除［11］。脂類對檢測響應(yīng)有較大干擾作用，常用去脂方法是正己烷萃取，但藥物中同化激素類藥物脂溶性強，正己烷除脂會造成部分檢測目標藥物的損失。根據(jù)相關(guān)報道［12-13］，采用低溫冷凍的方法可以有效去除脂類，本文在前處理階段采用了低溫除脂方法。由于部分藥物如β-受體激動劑等帶有含氮極性基團，有一定的水溶性，為使藥物提取充分，在提取液中加入適量氨水以保證得到理想的回收率。為進一步凈化，采用了Prime HLB固相萃取柱，該固相萃取柱為新型凈化產(chǎn)品，能有效去除磷脂等雜質(zhì)，并取得較好的凈化效果。

3.3 儀器方法的優(yōu)化 違禁藥物的分離多采用C18反相色譜柱［10，14-15］。 本研究采用 C18反相色譜柱分離，以乙腈+水（含10 mmoL／L甲酸銨）作為流動相，梯度洗脫。結(jié)果表明以乙腈+水（含10 mmoL／L甲酸銨）為流動相，檢測藥物有良好的色譜分離效果。同時流動相中加入低濃度揮發(fā)性的甲酸銨，可兼顧正離子和負離子模式的質(zhì)譜響應(yīng)，色譜峰峰形較優(yōu)。由于該類藥物化學結(jié)構(gòu)有較大差異，導(dǎo)致其對流動相、流速、色譜柱等的響應(yīng)和靈敏度不同，甚至會出現(xiàn)離子抑制或者增強效應(yīng)，所以需要考慮兼顧多數(shù)化合物的情況，同時進行適當?shù)姆侄尾杉纸M，以達到滿意的效果［10，16］。質(zhì)譜響應(yīng)類型分別適于正離子模式和負離子模式下檢測。本研究建立的方法，前處理過程通用于兩種離子化模式藥物的提取，樣品液可同時滿足正離子模式和負離子模式下的儀器測定。

3.4 樣本的測定 采用本文建立方法完成40個豬肉樣品的檢測。氫化可的松和黃體酮有少量檢出，濃度較低，應(yīng)為內(nèi)源性來源。根據(jù)我國農(nóng)業(yè)部235號公告等法規(guī)要求，該類藥物不得檢出。本研究目的是探索建立豬肉中糖皮質(zhì)激素類、性激素類、β-受體激動劑類、玉米赤霉醇類藥物殘留同時檢測方法。為全面了解違禁藥物的在豬肉中的殘留情況，還需要增加采樣環(huán)節(jié)、采樣地區(qū)以及擴大采樣量，進行更多樣本的檢測。

4 結(jié) 論

本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了豬肉樣品中多類違禁藥物殘留的快速篩查方法，對前處理條件、凈化方式、色譜和質(zhì)譜條件等進行了優(yōu)化，并進行了方法學考察。結(jié)果表明，該方法快速、靈敏、準確且穩(wěn)定；適用于動物性產(chǎn)品中不同離子模式多大類違禁藥物殘留同時分析檢測的要求，可顯著提高違禁藥物的檢測效率。