HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定硫酸新霉素可溶性粉中非法添加4種化學(xué)藥物

熊 玥，宋慧敏，汪云花，孫 瑤，石慧慧

（江蘇省獸藥飼料質(zhì)量檢驗(yàn)所，南京210036）

硫酸新霉素為氨基糖苷類抗生素，其制劑硫酸新霉素可溶性粉臨床上主要用于治療禽敏感的革蘭氏陰性菌所致的胃腸道感染，是常見的獸用處方藥［1］。甲硝唑?yàn)橄趸溥蝾惪乖x藥，用于牛毛滴蟲病、腸道原蟲病等，亦可廣泛用于厭氧菌所致感染［2］。水楊酸是一種脂溶性的有機(jī)酸，具有中等程度的抗真菌作用［2］。乙酰甲喹為喹啉類藥物，具有廣譜抗菌活性，主要用于密螺旋體所致的豬痢疾和細(xì)菌性腸炎［2］。甲氧芐啶為廣譜抗菌藥，對(duì)多種革蘭氏陽性菌及陰性菌均有抗菌作用，一般不單獨(dú)做抗菌藥使用，常作為增效劑與磺胺藥聯(lián)合應(yīng)用［3］。目前市場(chǎng)上一些不法獸藥生產(chǎn)企業(yè)為提高競(jìng)爭(zhēng)力，常在制劑中非法添加一種或多種處方外化學(xué)藥物以達(dá)到提高治療效果的目的，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)帶來了安全隱患。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已加大了對(duì)獸藥處方外非法添加的監(jiān)管與打擊力度，從2015年開始實(shí)施鑒別抽檢和摸底抽檢［4］，近年來又陸續(xù)發(fā)布了多個(gè)獸藥處方外非法添加物檢查的公告作為檢驗(yàn)依據(jù)。近期，在進(jìn)行非法添加常規(guī)篩查時(shí)［5］，發(fā)現(xiàn)兩批硫酸新霉素可溶性粉供試品圖譜中出現(xiàn)多個(gè)響應(yīng)值較高的未知色譜峰，對(duì)比前期收集的化合物紫外光譜特征圖，疑似檢出處方外成分甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶。本文建立了同時(shí)測(cè)定硫酸新霉素可溶性粉中非法添加甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶的高效液相色譜法，對(duì)疑似陽性樣品進(jìn)行了確證，方法簡(jiǎn)單可靠，從而為非法添加檢測(cè)方法研究提供了新的實(shí)驗(yàn)方法及數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters Arc高效液相色譜儀配2998 PDA二極管陣列檢測(cè)器和Empower 3色譜工作站軟件（美國(guó)Waters公司）、XS105DU型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、FE20型pH計(jì)（瑞士Mettler Toledo公司）、KQ-300DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥與試劑

1.2.1 試劑 甲醇、三乙胺均為色譜純（美國(guó)Merck公司）；磷酸二氫鈉、氫氧化鈉為分析純（南京化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。

1.2.2 對(duì)照品 甲硝唑?qū)φ掌罚ê浚?00.0%，批號(hào)：100191-201507，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、水楊酸對(duì)照品（含量：99.3%，批號(hào)：100106-201605，中國(guó)食品藥品檢定研究院）、乙酰甲喹對(duì)照品（含量：99.6%，批號(hào)：H0111505，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）、甲氧芐啶（含量：99.9%，批號(hào)：100031-201205，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。

1.2.3 供試品

1.2.3.1 硫酸新霉素可溶性粉制劑空白 經(jīng)檢驗(yàn)不含甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶的企業(yè)報(bào)批產(chǎn)品，批號(hào)為 16101709，規(guī)格為 100 g：32.5 g（325萬單位）。

1.2.3.2 疑似陽性樣品 兩個(gè)樣品均為2017年度國(guó)家獸藥風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)抽檢的產(chǎn)品，其中硫酸新霉素可溶性粉樣品 A，標(biāo)稱河北某企業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)為

20151004，規(guī)格為 100 g：3.25 g（325 萬單位）；硫酸新霉素可溶性粉樣品B，標(biāo)稱福建某企業(yè)生產(chǎn)，批號(hào)為 20151201，規(guī)格為 100 g：6.5 g（650 萬單位）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉3.0 g，加水1000 mL使溶解，加三乙胺0.5 mL，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié) pH 值至 7.0）-甲醇（70：30）為流動(dòng)相，流速：1.0 mL／min，柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，二極管陣列檢測(cè)器，采集波長(zhǎng)范圍為200～400 nm，分辨率

1.2 nm，記錄230 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液制備 取供試品 1.0 g，置 50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理15 min，靜置，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過。取濾液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液及系統(tǒng)適用性溶液制備

分別取甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶對(duì)照品各25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1 mg／mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液5 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.1 mg／mL 的系統(tǒng)適用性溶液。

2.2.3 硫酸新霉素可溶性粉制劑空白溶液制備取硫酸新霉素可溶性粉制劑空白 1.0 g，照 2.2.1 項(xiàng)下操作制成硫酸新霉素可溶性粉制劑空白溶液。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性及系統(tǒng)適用性考察 精密量取硫酸新霉素可溶性粉制劑空白溶液10 μL，照2.1項(xiàng)下色譜條件，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖及光譜圖。另取系統(tǒng)適用性溶液10 μL，同法操作。結(jié)果表明制劑空白溶液在4種被測(cè)物甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶相應(yīng)的出峰位置處不產(chǎn)生干擾，說明方法的專屬性強(qiáng)；4種被測(cè)物色譜峰與相鄰色譜峰之間的分離度良好，說明所選試驗(yàn)條件滿足測(cè)定要求（圖1、圖2）。

圖1 硫酸新霉素可溶性粉制劑空白溶液光譜指數(shù)圖Fig 1 Chromatogram and spectorgram of blank solution

圖2 系統(tǒng)適用性溶液光譜指數(shù)圖Fig 2 Chromatogram and spectrogram of system suitability solution

2.3.2 線性 精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 1、1、1、2、1、3 mL 分別置于 100、50、25、25、10、25 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制備成濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.12 mg／mL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。按峰面積與對(duì)應(yīng)的濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶對(duì)照品的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。結(jié)果表明4種被測(cè)物在0.01～0.12 mg／mL濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表1 4種被測(cè)物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢測(cè)限Tab 1 Calibration curves， correlation coefficients， linear ranges， limits of detection of 4 drugs

2.3.3 準(zhǔn)確度 以硫酸新霉素可溶性粉制劑空白加甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶對(duì)照品做回收率試驗(yàn)來考察方法的準(zhǔn)確度。回收率試驗(yàn)溶液配制：取硫酸新霉素可溶性粉制劑空白1.0 g，另精密稱取4種對(duì)照品各20 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理15 min，靜置，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過。取濾液1.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。平行配制上述試驗(yàn)溶液各6份。精密量取上述溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果顯示：甲硝唑回收率為 98.6%，RSD 為 0.4%；水楊酸回收率為98.0%，RSD為0.7%；乙酰甲喹回收率為99.4%，RSD 為 0.7%；甲氧芐啶回收率為 99.9%，RSD為1.0%，均符合方法學(xué)要求。

2.3.4 檢測(cè)限 參考文獻(xiàn)方法［6］配制不同濃度的加標(biāo)溶液，分析所得色譜圖及光譜圖，以光譜圖失真的最大濃度作為方法的檢測(cè)限［3］。取硫酸新霉素可溶性粉制劑空白1.0 g，置50 mL量瓶中，加甲醇40 mL，超聲處理15 min，靜置，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過。取濾液1.0 mL，置25 mL量瓶中，平行操作5份，分別精密加入系統(tǒng)適用性溶液（0.1 mg／mL）適量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL），加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。精密量取上述檢測(cè)限樣品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定檢測(cè)限，該色譜條件下甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶在硫酸新霉素可溶性粉中的檢出限見表1。

2.3.5 耐用性 從柱溫、流動(dòng)相pH值、色譜柱三個(gè)方面考察檢測(cè)方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為25、30、35℃，結(jié)果表明：隨著柱溫升高，4種被測(cè)物保留時(shí)間均有所提前；調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值為6.5、7.0和7.5，結(jié)果表明：在所調(diào)節(jié)范圍內(nèi)，4種被測(cè)物保留時(shí)間、光譜圖差別不大；選擇三款不同品牌色譜柱（資生堂 MG，250 mm×4.6 mm，5 μm；Waters Atlantis T3，250 mm×4.6 mm，5 μm；Waters SunFire C18，150 mm×4.6 mm，5 μm），考察不同色譜柱對(duì)檢測(cè)的影響，在所建檢測(cè)方法條件下，三種品牌色譜柱所得色譜峰的分離度、理論塔板數(shù)、對(duì)稱因子均符合規(guī)定，方法耐用性較好。

2.4 疑似陽性供試品測(cè)定結(jié)果 取疑似陽性的硫酸新霉素可溶性粉樣品照2.2.1項(xiàng)下方法制備成供試品溶液；取2.2.2項(xiàng)下系統(tǒng)適用性溶液作為建立對(duì)照品光譜數(shù)據(jù)庫的溶液，分別精密量取上述試驗(yàn)溶液各 10 μL，照 2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。 用Empower 3色譜工作站軟件建立對(duì)照品光譜數(shù)據(jù)庫，并對(duì)供試品溶液的峰純度和光譜匹配度進(jìn)行計(jì)算。峰純度檢查結(jié)果：樣品A與樣品B色譜圖中各峰的純度角度均小于純度閾值，結(jié)果表明樣品A與樣品B色譜圖中各峰均為單一物質(zhì)峰。光譜相似度檢查結(jié)果：樣品A色譜圖中，與乙酰甲喹、甲氧芐啶對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰的光譜圖及最大吸收波長(zhǎng)分別與乙酰甲喹、甲氧芐啶對(duì)照品的光譜圖及最大吸收波長(zhǎng)保持一致，且匹配角度均小于匹配閾值，光譜相似，為同一物質(zhì)；樣品B色譜圖中，與甲硝唑、水楊酸及乙酰甲喹對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰的光譜圖及最大吸收波長(zhǎng)分別與甲硝唑、水楊酸及乙酰甲喹對(duì)照品的光譜圖及最大吸收波長(zhǎng)保持一致，且匹配角度均小于匹配閾值，光譜相似，為同一物質(zhì)。結(jié)合保留時(shí)間、峰純度及光譜相似度檢查結(jié)果，綜合判定樣品A中非法添加了乙酰甲喹及甲氧芐啶，樣品B中非法添加了甲硝唑、水楊酸及乙酰甲喹。以2.2.2項(xiàng)下的系統(tǒng)適用性溶液作為對(duì)照進(jìn)樣，以外標(biāo)法按峰面積計(jì)算含量，樣品A中乙酰甲喹添加量約為150 g／kg，甲氧芐啶添加量約為60 g／kg。樣品B中甲硝唑添加量約為102 g／kg，水楊酸的添加量約為 31 g／kg，乙酰甲喹添加量約為107 g／kg。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 3、圖 4和表 2、表3。

圖3 樣品A溶液光譜指數(shù)圖Fig 3 Chromatogram and spectrogram of the sample A solution

圖4 樣品B溶液光譜指數(shù)圖Fig 4 Chromatogram and spectrogram of the sample B solution

表2 峰純度及光譜相似度檢查結(jié)果表Tab 2 Results of peak purity test and spectral similarity test

表3 保留時(shí)間及紫外光譜結(jié)果表Tab 3 Results of retention time and UV absorprion spectra

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)在非法添加初步篩查時(shí)，采用的是農(nóng)業(yè)部公號(hào)2448號(hào)中黃芪多糖注射液非法添加解熱鎮(zhèn)痛類化合物檢查方法［7］，使用的流動(dòng)相鹽濃度較高，故減少磷酸二氫鈉與三乙胺的使用量，調(diào)整為以磷酸鹽緩沖液（取磷酸二氫鈉3.0 g，加水 1000 mL 使溶解，加三乙胺 0.5 mL，用氫氧化鈉試液調(diào)節(jié) pH 值至 7.0）-甲醇（70：30）為流動(dòng)相，各色譜峰與相鄰色譜峰之間分離度最小值為4，且峰形良好，理論塔板數(shù)均大于8000。硫酸新霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)不具備特征的紫外發(fā)色團(tuán)，采用紫外檢測(cè)器直接測(cè)定，供試品色譜圖中并無色譜峰出現(xiàn)。綜合考慮4種被測(cè)化學(xué)藥品在該色譜條件下的最大吸收波長(zhǎng)，選取230 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)，保證各峰面積大小合適，便于結(jié)果的判定。

3.2 測(cè)定用溶劑的選擇 在非法添加高通量篩查工作中常以甲醇作為提取溶劑，且4種被測(cè)化學(xué)藥物在甲醇中均溶解性良好，故選擇甲醇作為提取溶劑。

3.3 檢查方法的擴(kuò)展使用 除硫酸新霉素可溶性粉外，當(dāng)采用該檢查方法用于其他獸藥制劑的檢查時(shí)，需進(jìn)行空白試驗(yàn)和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)，并測(cè)定方法的檢出限，注意調(diào)整供試品溶液或?qū)φ掌啡芤旱臐舛?，使兩者目?biāo)分析物的峰面積盡量接近，以便于結(jié)果的判定。

3.4 獸藥非法添加物檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)展望 隨著國(guó)家對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全的日益重視，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部對(duì)獸藥處方外非法添加的監(jiān)管與打擊力度也不斷加大，近年來發(fā)布了多批公告作為獸藥處方外非法添加物檢查的檢驗(yàn)依據(jù)，但相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制修訂還跟不上少數(shù)企業(yè)非法添加的步伐。如本實(shí)驗(yàn)中涉及的硫酸新霉素可溶性粉樣品，目前并無與之相關(guān)的非法添加檢驗(yàn)方法公告發(fā)布，獸藥中非法添加水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶已有多篇文獻(xiàn)報(bào)告，且農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告中已有檢測(cè)方法發(fā)布，但獸藥中非法添加甲硝唑，則既無文獻(xiàn)報(bào)道亦無公告發(fā)布，需要引起有關(guān)部門的重視。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部應(yīng)進(jìn)一步加快獸藥中非法添加檢測(cè)方法的制修訂工作，為嚴(yán)厲打擊非法添加違法行為提供依據(jù)。

本研究建立了HPLC-PDA法同時(shí)測(cè)定硫酸新霉素可溶性粉中非法添加甲硝唑、水楊酸、乙酰甲喹、甲氧芐啶的方法，方法簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)，為獸藥市場(chǎng)的安全監(jiān)管提供了一定的技術(shù)支撐。