泰地羅新注射液在藏香豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究

趙 森，吳利軍，邵志勇，楊文海，陳夏冰，陳 潔，金爾光，何 斌?

（1.青海省海西州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海海西州817099；2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430208）

泰地羅新（Tildipirosin，TIP）是一種新型大環(huán)內(nèi)酯類半合成抗菌藥，為泰樂菌素的衍生物，其注射液于2011年在歐洲被批準(zhǔn)生產(chǎn)上市［1］；它是一種廣譜、高效的抗微生物藥物［2］，對(duì)引起畜禽呼吸道疾病的病原菌，如胸膜肺炎放線桿菌［3］、多殺性巴氏桿菌［4］、支氣管敗血波氏桿菌［5］、副豬嗜血桿菌［6］、溶血性曼海姆菌［7］等具有特效，是治療畜禽呼吸道疾病極為理想的藥物［8］。目前，在我國正處于新獸藥研究階段，有關(guān)其藥物動(dòng)力學(xué)的研究報(bào)道較少，且未見其在藏香豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道，為了解其在藏香豬體內(nèi)的吸收、分布、轉(zhuǎn)化及排泄規(guī)律，本研究建立了泰地羅新高效液相色譜檢測(cè)方法，研究了其在藏香豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)特征，為其新獸藥的研發(fā)和臨床使用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品 泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：T440150，純度98.2%）購自美國加拿大 Trc公司，泰地羅新注射液（批號(hào)：1303001，規(guī)格 50 mL）由山東齊魯動(dòng)物保健品有限公司提供。乙腈、甲醇：色譜級(jí)，購自美國 Themo公司；甲酸、磷酸二氫鉀：分析純，購于國藥集團(tuán)。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 美國Agilent1200型高效液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器，Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm） ；TG-16W 高速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)有限公司；電子天平：±0.0001 g，德國賽多利斯公司；XH-B 渦旋混合器：江蘇康佳醫(yī)療器械有限公司；氮吹儀：NEVAPTM111型，美國路易公司。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 藏香豬，雌雄各半，8頭，體重：15.4±1.2 kg。 購于海西州藏香豬養(yǎng)殖戶。 自由飲水和采食，飼料為不含任何藥物的自配日糧，在試驗(yàn)前觀察豬群2周，試驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水，試驗(yàn)期間自由采食和飲水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 經(jīng)過多次試驗(yàn)，確立泰地羅新的高效液相色譜檢測(cè)條件為：色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測(cè)波長為289 nm；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（pH＝7.00）＝ （35 ∶30 ∶35）；流速為1.0 mL／min；進(jìn)樣量為 20 μL；柱溫為（30±0.1）℃。

1.2.2 藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)泰地羅新的推薦使用劑量，本試驗(yàn)8頭藏香豬以4 mg／kg.bw的劑量劑肌內(nèi)給藥。 給藥后，分別于 0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、24、48、72、96、120、144、192、240、288、336、384 h前腔靜脈采血5 mL，置于已添加肝素鈉的聚丙烯離心管中，以2000 r／min離心15 min，取上清液于-20℃冷凍保存，待測(cè)定。

1.2.3 血漿樣品處理 準(zhǔn)確吸取血漿 1.0 mL，分別加入3.0 mL乙腈提取2次，每次渦旋振蕩1 min，4000 r／min、4 ℃離心 10 min；合并 2 次，取上清液于10.0 mL尖底離心管中，45℃氮?dú)獯蹈?，再?00 μL 流動(dòng)相溶解，渦旋振蕩 1 min，4000 r／min、4℃離心10 min，取上清液即為待測(cè)樣品。

1.2.4 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 向8支10.0 mL聚丙烯離心管中各加入1.0 mL空白血漿，留一支作空白對(duì)照，然后依次加入泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)工作液，便得到藥物濃度依次為 0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、2.00、2.50 μg／mL 的血漿樣品。 分別按照泰地羅新血漿樣品處理方法處理后，進(jìn)樣分析。以測(cè)得泰地羅新的峰面積（A）為橫坐標(biāo)，藥物濃度（C）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出泰地羅新回歸方程。

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證 取空白血漿 1.0 mL，添加適量泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其濃度分別為2.00、1.00、0.10 μg／mL，按照血漿樣品的處理方法處理，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)平行，測(cè)定日內(nèi)變異系數(shù)；重復(fù)檢測(cè)5 d，測(cè)定日間變異系數(shù)；并計(jì)算其回收率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析 方法學(xué)驗(yàn)證考察數(shù)據(jù)采用SPSS軟件分析處理；藥-時(shí)曲線圖和消除動(dòng)態(tài)圖采用Excel軟件繪制；藥物動(dòng)力學(xué)模型擬合及參數(shù)計(jì)算均采用3P97藥動(dòng)學(xué)軟件分析，藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)可根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法專屬性 通過反復(fù)多次試驗(yàn)所建立的色譜條件，基線平穩(wěn)，藥物峰形對(duì)良好，泰地羅新在色譜條件下均能與雜質(zhì)峰良好分離。結(jié)果表明，本測(cè)定方法簡(jiǎn)便，雜質(zhì)峰干擾小、分離度良好，泰地羅新保留時(shí)間為14.2 min，空白血漿和血漿中添加藥物色譜圖如圖1、圖2。

圖2 血漿0.1μg／mL色譜圖（A為泰地羅新）Fig 2 Chromatograms of Tildipirosin in pigs plasma（0.1 μg／mL）

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立方法，以測(cè)得泰地羅新的峰面積（A）為橫坐標(biāo)，藥物濃度（C）為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖 3。 泰地羅新在 0.01～2.5 μg／mL 的濃度范圍內(nèi)，具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為C＝0.0008A-0.0005，相關(guān)系數(shù)為 0.9998。

圖3 泰地羅新在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 3 Standard curve of determination of Tildipirosin in pigs plasma

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證 在空白血漿中添加泰地羅新標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其濃度分別為 0.10、1.00、2.00 μg／mL，按血漿樣品處理，HPLC檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)平行，測(cè)定日內(nèi)變異系數(shù)在5%以內(nèi)；重復(fù)檢測(cè)5 d，測(cè)定日間變異系數(shù)在10%以內(nèi)；回收率為89.19%～91.36%；檢測(cè)限（LOD）、定量限（LOQ）分別為0.01、0.05 μg／mL；具體數(shù)據(jù)如表 1。

2.3 藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù) 按照試驗(yàn)設(shè)定方案進(jìn)行給藥和樣品處理，高效液相色譜分析檢測(cè)、軟件分析計(jì)算。肌內(nèi)注射泰地羅新各時(shí)間點(diǎn)藥濃度見表2，藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)見表3。

表1 泰地羅新在血漿中的方法學(xué)考察數(shù)據(jù)（n＝5）Tab 1 The result of method validation of Tildipirosin in plasma （n＝5）

續(xù)表

表2 肌內(nèi)注射泰地羅新 （4 mg／kg.bw）后各時(shí)間點(diǎn)的血藥濃度（n＝8）Tab 2 Plasma concentration vs time after a single 4 mg／kg bwim Tildipirosin injection in pigs（n＝8）

表3 泰地羅新4 mg／kg.bw在藏香豬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝8）Tab 3 Pharmacokinetic parameters of Tildipirosin （4 mg／kg.bw） in Tibetan pigs（n＝8）

由表1、表2可見，泰地羅新肌內(nèi)注射后，在藏香豬體內(nèi)吸收迅速，達(dá)峰時(shí)間快，達(dá)峰濃度較高，消除半衰期較長，藥-時(shí)曲線（圖4）符合有吸收三室開放模型，其藥-時(shí)方程為 C＝ 0.5660e-0.4751t+0.2800 e-0.0207t+0.0564e-0.0058t-0.9024e-7.4500t。

圖4 泰地羅新肌內(nèi)4 mg／kg bw給藥的血藥濃度-時(shí)間曲線Fig 4 Changing curve of Tildipirosin plasma concentration vs time after a single 4 mg／kg bwim Tildipirosin injection in Tibetan pigs

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件 本研究建立了泰地羅新的高效液相色譜檢測(cè)方法，與液質(zhì)聯(lián)用相比，本方法簡(jiǎn)單、快速、靈敏度較高。試驗(yàn)中選擇289 nm作為檢測(cè)波長，有效的提高了檢測(cè)的靈敏度，使藥物與雜質(zhì)得到了有效分離。流動(dòng)相選擇上使用了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸、甲醇-水，甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-鹽溶液等多種流動(dòng)相。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)甲醇和水相混合時(shí)易產(chǎn)生氣泡，影響系統(tǒng)壓力，在加入一定比例的乙腈時(shí)，系統(tǒng)較穩(wěn)定且洗脫能力有所增強(qiáng)；且在較高鹽濃度時(shí)易在系統(tǒng)中形成結(jié)晶，影響系統(tǒng)穩(wěn)定。經(jīng)過多次試驗(yàn)，最終確定甲醇-乙腈-0.05 mol／L 磷酸二氫鉀溶液（pH＝7.00）＝（35 ∶30 ∶35）為最終流動(dòng)相，泰地羅新與雜質(zhì)較好的分離，色譜峰峰形對(duì)稱性好。

3.2 樣品處理 為保證血漿樣品的提取回收率和檢測(cè)的準(zhǔn)確度與靈敏度，本研究采用了3倍血漿樣品體積的乙腈2次提取，既充分沉淀血漿中的蛋白雜質(zhì)，又有效的保證了樣品提取回收率。提取液經(jīng)氮?dú)獯蹈?，再用流?dòng)相溶解定容，對(duì)樣品進(jìn)行了10倍濃縮，有效的提高了檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和檢測(cè)限，減少實(shí)驗(yàn)誤差且保證數(shù)據(jù)更準(zhǔn)確。

3.3 藥動(dòng)學(xué)特征 藏香豬是我國特有的一種古老畜種資源，是西藏原始的瘦肉型豬種。研究泰地羅新在藏香豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)特征，對(duì)了解其在機(jī)體內(nèi)的變化規(guī)律，指導(dǎo)臨床合理科學(xué)的使用意義重大。本研究發(fā)現(xiàn)：?jiǎn)蝿┝考?nèi)注射泰地羅新（4 mg／kg bw）后，在藏香豬體內(nèi)的藥-時(shí)曲線符合有吸收三室開放模型；Tmax為 0.457±0.143 h，Cmax為0.759±0.192 μg／mL，t1／2為 120.518±10.181 h，AUC為 22.224±2.641 μg·h／mL。 Rose［9］等報(bào)道，豬單劑量給藥 4 mg／kg bw， Tmax為 0.38±0.14 h，Cmax為0.895 ± 0.453 μg／mL， t1／2為 106 ± 15 h， AUC 為11.012±2.989μg·h／mL；廖遠(yuǎn)軍［10］等報(bào)道，豬單劑量給藥 4 mg／kg bw ，Tmax為 0.389±0.18 h，Cmax為0.972±0.391 μg／mL，t1／2為 124.45±42.06 h，AUC 為15.75±5.19 μg·h／mL。 與 Rose［9］和廖遠(yuǎn)軍［10］等報(bào)道的結(jié)果相比較，其中 Tmax、Cmax基本一致，但t1／2與Rose［9］等報(bào)道相差較大，可能與地域和動(dòng)物品種有關(guān)；而藥時(shí)曲線下面積 AUC要優(yōu)于 Rose［9］和廖遠(yuǎn)軍［10］等的報(bào)道。 Menge［11］等報(bào)道，給牛單劑量皮下注射 4 mg／kg bw 泰地羅新，Tmax為 0.383 h，Cmax為 0.7 μg／mL。 T1／2為 216 h，與 Menge［11］等報(bào)道相比較，其中 Tmax、Cmax基本一致，但 t1／2相差較大，可能與動(dòng)物種屬有關(guān)。郭美珍［12］報(bào)道皮下注射泰地羅新在健康小鼠血漿、肺泡上皮細(xì)胞襯液和肺組織的 Tmax分別為 0.083h、0.381±0.238 h 和1.125±0.629 h；t1／2分別為 14.123±1.758 h、49.494±8.028 h、33.663±2.802 h。 與郭美珍［12］報(bào)道相比，泰地羅新在藏香豬體內(nèi)的Tmax與其在健康小鼠肺泡上皮細(xì)胞襯液中相近，較其在小鼠血漿中慢，比其在肺組織要快很多，但在t1／2較其在小鼠血漿、肺泡上皮細(xì)胞襯液和肺組織中均長很多，這可能是動(dòng)物種屬差異的原因。

研究結(jié)果表明，泰地羅新注射液在藏香豬體內(nèi)達(dá)峰時(shí)間短，在機(jī)體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)速度快，這可能與泰地羅新本身脂溶性較高有關(guān)；EMA［4］研究發(fā)現(xiàn)，泰地羅新在豬體內(nèi)絕大部分以原藥的形式排出體外，這與其他大環(huán)內(nèi)酯類藥物的代謝類似。泰地羅新在藏香豬體內(nèi)的半衰期約為120 h左右，說明其在動(dòng)物體內(nèi)消除慢、血漿清除率低，藥效持久；與大環(huán)內(nèi)酯類的其他藥物相比，泰地羅新的給藥方式和給藥劑量有所不同［5］，以單劑量肌肉注射給藥就可以保持較長的藥物濃度，不需要多次重復(fù)給藥，對(duì)耐藥性的控制和臨床治療效果的發(fā)揮具有較大的優(yōu)勢(shì)。泰地羅新注射液在藏香豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)研究結(jié)果將對(duì)其新獸藥研發(fā)和臨床使用提供重要參考。