偽狂犬病毒5基因缺失株體外重組獲得缺失基因的研究

陳曉春，韓 爽，吳華偉，鄧 永，曹明慧，李俊平?

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.青島信得藥業(yè)有限公司，山東青島266100）

偽狂犬病毒（Psedorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）水痘病毒屬（Varicellovirus）的豬皰疹病毒I（Suid herpesvirus I），為線狀雙股DNA病毒，基因組全長約150 kb，含有至少77個開放閱讀框編碼。病毒基因組有大量的復制非必需基因，如TK、gG、gE、gI等［1-3］。 這些基因編碼的蛋白大多與毒力有關，由單個或多個毒力基因缺失的偽狂犬病毒毒株制備的疫苗在應用上相對成熟［4］。如商品化偽狂犬病毒活疫苗（SA215株）為gE、gI、TK三基因缺失疫苗，豬偽狂犬病活疫苗（HB-98株）為TK和gG雙基因缺失疫苗，豬偽狂犬病活疫苗（Bartha-K61株）為gE、gI自然缺失疫苗。長期實踐證實，偽狂犬病毒基因缺失疫苗安全性良好，且在偽狂犬病的防控中起到重要的作用。但隨著我國養(yǎng)殖環(huán)境的改變和免疫壓力的增加，豬病流行呈現(xiàn)老病新發(fā)，新病不斷，混合感染突出等趨勢，導致一些病原變異加劇，毒力不斷增加。2011年以來，許多使用基因缺失活疫苗免疫的規(guī)模化豬場出現(xiàn)了疑似PR流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失，可見現(xiàn)有疫苗已不能對變異的PRV株產生100%的保護力［5-7］。

以一株偽狂犬流行毒株為親本株，人工構建了一株 5 基因缺失毒株（PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-），經試驗證實，該毒株在小鼠、家兔、山羊、仔豬和懷孕母豬上的安全性優(yōu)于Bartha-K61株。本研究將其與親本毒株在敏感細胞上共同培養(yǎng)，分析培養(yǎng)物中毒株的類型、所占比例及對家兔的安全性，以了解該毒株在體外從親本毒株中獲得缺失基因的能力及安全性，為偽狂犬缺失疫苗的研制和轉基因生物安全評價提供研究數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 病毒 偽狂犬病毒5基因缺失株PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株、PRV 野毒株 SX 株，均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所構建／分離、鑒定和保存。病毒含量分別為 107.5TCID50／mL、107.25TCID50／mL。

1.1.2 細胞 PK15細胞由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存。

1.1.3 主要試劑 DMEM 營養(yǎng)液，Gibco公司產品；胎牛血清，PΛA公司產品；低熔點瓊脂糖，Sigma公司產品；DNA／RNA抽提試劑盒，TIANGEN公司產品；KOD FX Neo DNA聚合酶購自TOYOBO公司；膠回收試劑盒購自Promega公司。

1.1.4 鑒定引物 自行設計了 TK、UL49.5、gE、gI、US9基因鑒定引物，引物序列及擴增信息見表1。

1.1.5 主要儀器設備 二氧化碳培養(yǎng)箱（三洋 ）、恒溫培養(yǎng)箱（三洋）、PCR儀（Biometra）、電泳儀、紫外成像儀等。

1.2 方法

1.2.1 病毒傳代 將 PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株病毒液和PRV野毒株SX株病毒液用DMEM營養(yǎng)液分別稀釋成病毒含量為 106.0TCID50／mL，分別取1 mL混合，接種已長成良好PK15細胞單層的25 cm2細胞瓶，培養(yǎng)至80%細胞出現(xiàn)細胞病變時，凍融3次，離心去除細胞碎片，取上清，記為F1，分裝成1 mL／管，凍存或進行下一代接種，每代取1 mL接種1瓶25 cm2的PK15細胞單層進行傳代。如此連續(xù)傳代10代，收獲病毒液，記為F10，分裝成1 mL／管，凍存。

表1 引物序列及擴增信息Tab 1 The information of primers and amplification

1.2.2 病毒含量測定 將收獲的F10病毒液用DMEM細胞培養(yǎng)液作10倍系列稀釋，取 10-2、10-3、10-4、10-5、10-65 個稀釋度，分別接種已長成良好PK15細胞單層、棄去細胞培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板，每個稀釋度接種8孔，每孔0.1 mL，同時設正常細胞對照8孔。置37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。記錄細胞病變情況，按Reed-Muench法計算TCID50。

1.2.3 病毒蝕斑挑選及培養(yǎng) 將收獲的F10代病毒液按10～20 TCID50劑量接種已長成良好PK15細胞單層的6孔細胞培養(yǎng)板，吸附1 h后，棄去吸附液，鋪上1%的低熔點瓊脂糖，繼續(xù)培養(yǎng)48～72 h，共挑取50個病毒蝕斑，各浸于1 mL DMEM營養(yǎng)液中，凍融1次后，分別接種已長成良好單層的PK15細胞6孔板，每個蝕斑接種1孔，培養(yǎng)至病變達50%以上，收獲病毒液，凍融 1次后，進行 TK、UL49.5、gE、gI、US9 基因鑒定。

1.2.4 重組情況分析

1.2.4.1 重組病毒PCR鑒定 將挑選的50個病毒蝕斑采用表1中的引物分別進行PCR鑒定，初步確定基因缺失類型，并計算病毒重組的百分率，即除流行株和5基因缺失株外能擴增出TK、UL49.5、gE／gI／US9中任一基因或多個基因的克隆斑數／50。

1.2.4.2 重組病毒基因序列測定 將擴增條帶大小一致的蝕斑各選取3個樣品進行序列測定，分析基因序列變異情況。

1.2.5 重組病毒安全性試驗 取12只 2.5 kg左右的健康易感家兔，隨機分成6組，每組2只。第1、2、3、4、5組分別皮下接種新出現(xiàn)的重組毒株，每只接種1 mL（含103.0TCID50）；第6 組不接種作為對照。隔離飼養(yǎng)觀察14 d，觀察有無偽狂犬病臨床癥狀。

2 結 果

2.1 病毒蝕斑挑選 PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株病毒液和PRV野毒株SX株病毒液混合后傳代，收獲F10代病毒液進行蝕斑挑選，隨機挑選出50個蝕斑（部分蝕斑圖片見圖1）。

2.2 蝕斑PCR鑒定結果 將隨機挑選的50個蝕斑采用 6d-F／9b-R、TK-F／TK-R、PUL50-F2／PUL50-R2三對引物進行PCR鑒定。結果（圖2-圖 4，表 2）發(fā)現(xiàn)，同時擴增出 gI／gE／US9、TK、gN 三段基因的有13個蝕斑（即野毒株），同時擴增出其中兩段基因的有26個蝕斑，擴增出其中一段基因的有10個蝕斑，僅1個蝕斑未擴增出全部的三段基因（即5基因缺失株），共存在7種不同類型的毒株。即除 PRV 野毒株和 PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株外，出現(xiàn)了5種新的基因組合類型，分別為PRV（ gE-／gI-／US9-／TK-）、 PRV （ gE-／gI-／US9-／gN-）、PRV（gE-／gI-／US9-）、PRV（TK-）、PRV（gN-），蝕斑個數分別為13個、1個、5個、5個、15個、6個、5個。病毒重組百分率＝（擴增出1段基因的蝕斑數+擴增出兩段基因的蝕斑數）×100%÷50＝（10+26）×100%÷50＝72%。 重組毒株中以gI／gE／US9三基因缺失型為主，占重組蝕斑數的41.7%，占挑選蝕斑數的30%，高于流行株的比例，成為主要的優(yōu)勢重組毒株。

圖1 部分蝕斑圖片（×200）Fig 1 The pictures of part plaques（×200）

圖2 gE／gI／US9三基因鑒定結果Fig 2 Identification of gE／gI／US9 gene

圖3 TK基因鑒定結果Fig 3 Identification of TK gene

圖4 gN基因鑒定結果Fig 4 Identification of gN gene

表2 50個蝕斑毒株類型、個數及所占比例Tab 2 Type，number and proportion of the 50 plaques

除流行株和5基因缺失株外，其他5種新類型按照單個基因擴增情況分析，擴增出gI／gE／US9段基因的蝕斑數為11個；擴增出TK基因的蝕斑數為25個，其中僅擴增出TK一段基因的有5個蝕斑，擴增出TK+gN或gI／gE／US9+TK兩段基因的有20個蝕斑；擴增出gN基因的蝕斑為26個，其中僅擴增出gN一段基因的有5個蝕斑，擴增出TK+gN或gI／gE／US9+gN兩段基因的有21個蝕斑。

2.3 擴增片段測序結果 對條帶大小一致的樣品隨機選取3個進行序列測定，結果顯示均未出現(xiàn)基因突變，說明出現(xiàn)任意兩個或單個基因的重組時，是整段插入或缺失，不存在基因的突變現(xiàn)象。

2.4 重組病毒安全性試驗 將新出現(xiàn)的5種毒株，即 PRV（gE-／gI-／US9-／TK-）、PRV（gE-／gI-／US9-／gN-）、 PRV （gE-／gI-／US9-）、 PRV （TK-）、PRV（gN-），經 PK15細胞增殖，測定病毒含量，分別稀釋成103.0TCID50／mL皮下接種健康易感家兔，觀察14 d，未見異常臨床反應。

3 討 論

對于偽狂犬病毒活疫苗的研制，人工致弱是篩選候選毒株的最有效的方法。目前我國市場上使用的多種人工致弱（毒力基因缺失）的偽狂犬病毒活疫苗都具有良好的安全性。但人工致弱株的毒力返強或基因重組一直備受關注。本研究通過同源重組的方式構建了偽狂犬病毒5基因缺失的人工致弱毒株，在此基礎上，通過體外細胞培養(yǎng)，了解5基因缺失株與野毒株的基因重組情況，為下一步疫苗開發(fā)提供數據。

研究結果顯示，5基因缺失株與野毒株混合培養(yǎng)，在體外連續(xù)傳代10代，共獲得包括野毒株和5基因缺失株在內的7種不同基因組合的毒株，符合偽狂犬病毒同源重組的規(guī)律。從缺失株PRV-gE-／gI-／US9-／△UL49.5／TK-株病毒與野毒株混合培養(yǎng)，獲得缺失基因的能力角度分析，除13個流行株蝕斑和 1 個五基因缺失 PRV（gE-／gI-／US9-／TK-／gN-）的蝕斑外，出現(xiàn)其余5種新類型的36個蝕斑的可能性有兩種：一是流行株在傳代培養(yǎng)過程中缺失了 gI／gE／US9、TK、gN 中一段或兩段基因；二是五基因缺失株在傳代培養(yǎng)的過程中分別獲得了gI／gE／US9、TK、gN 中一段或兩段基因。 但從分子生物學角度分析，單個基因缺失或同源重組的幾率應高于多個基因。在36個新類型的蝕斑中，有26個擴增出 gI／gE／US9、TK、gN 中的兩段基因，提示我們這26個蝕斑可能來自流行毒株的缺失，其中gI／gE／US9 段基因的缺失比例最高（15／36）。 有 10個擴增出TK、gN單個基因，提示我們這10個蝕斑可能來自5基因缺失株的同源重組。而且，未發(fā)現(xiàn)有僅擴增出gI／gE／US9段基因的蝕斑，可能因其長度較長（3550bp），同源重組的幾率較小，這也符合同源重組的分子生物學規(guī)律。

整體來看，流行毒株和 PRV（gE-／gI-／US9-）在10代培養(yǎng)物中所占比例較大，分別占26%（13／50）和30%（15／50），這說明流行株相對于5基因缺失株（僅1個蝕斑），仍屬于體外培養(yǎng)的優(yōu)勢毒株，雖然不能排除基因缺失株重新獲得5個基因的可能，但理論上有很大難度。而且其所占比列較培養(yǎng)前有所下降，也在一定程度上說明，缺失株同時獲得所有缺失基因的幾率很小。而 PRV（gE-／gI-／US9-）毒株所占比例較高，可能有兩個方面的原因：一是在10代的培養(yǎng)中不斷同源重組形成的，二是在最初幾代的同源重組中獲得細胞培養(yǎng)優(yōu)勢毒株，經多代不斷培養(yǎng)增殖形成。值得注意的是，PRV（gE-／gI-／US9-）與商品化疫苗 Bartha 株基因缺失情況基本一致，Bartha株屬于自然缺失株，進一步說明 PRV（gE-／gI-／US9-）類型毒株可能具有一定的遺傳優(yōu)勢。 此外 PRV（gE-／gI-／US9-／TK-）型與商品化 SA215 株（PRV-gE-／gI-／TK-／LacZ+）基因缺失疫苗的基因缺失情況相似。實踐證明，Bartha株、SA215株等活疫苗長期使用過程中未出現(xiàn)過安全問題?？梢酝茢啵狙芯砍霈F(xiàn)的PRV（gE-／gI-／US9-）、PRV（gE-／gI-／US9-／TK-）兩個類型的毒株是安全的，不存在引起烈性感染的危險。其他三種基因類型 PRV（gE-／gI-／US9-／gN-）、PRV（TK-）和PRV（gN-）蝕斑個數分別為5個、6個、5個，所占比例不高。家兔安全性試驗證實，新出現(xiàn)的5種基因類型的毒株以103.0TCID50劑量進行接種時，未見異常臨床反應，是安全的。

實踐證明，偽狂犬病毒弱毒疫苗無論是自然缺失株還是人工缺失致弱株，均具有良好的安全性［4］。本研究通過體外培養(yǎng)研究5基因缺失株與野毒株混合感染時重組情況，結果顯示病毒重組后基因構成整體上趨向于目前常見的自然缺失株，符合病毒重組特性，新重組的偽狂犬病毒株安全性良好，為該毒株今后作為疫苗候選毒株提供一些數據參考。