花椒精油對DSS誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響研究

孫琳 王瀟羽 張賢亮 王希雅

摘 要：葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）介導(dǎo)的 UC 模型小鼠與臨床上人類UC的發(fā)病機制相似。所以我們以葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）介導(dǎo)的UC模型小鼠為研究對象，以研究ZBEO對UC的作用。通過實驗，找到潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸道微生物含量、結(jié)構(gòu)、組分的變化，證明腸道菌群紊亂是造成潰瘍性結(jié)腸炎的原因之一。通過花椒精油給藥，證明花椒精油對UC小鼠的腸道菌群有有益的影響。

關(guān)鍵詞：花椒精油；潰瘍性結(jié)腸炎；腸道菌群

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）是一種是炎癥性腸?。↖nflammatory bowel diseases，IBD）的主要類型之一，屬于自身免疫性疾病。臨床主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、黏液血便等。病情輕重不等，多呈反復(fù)發(fā)作。近些年來，我國UC的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。每年大約有5%-10%的慢性UC患者轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)腸癌。因此研究UC以減少其發(fā)病率是極為必要的。

盡管 UC 的發(fā)病原因及發(fā)病機理仍不是十分清楚，但是紊亂的腸道微生物曾被指出與 UC的發(fā)病機理密切相關(guān)。腸道微生物是動物機體重要的組成部分，是一個種類繁多、數(shù)量龐大的微生物群體。越來越多的研究證明人類和動物的健康不僅與自身的基因組有關(guān)，還與其腸道定居的微生物有著不可分割的聯(lián)系。腸道菌群的構(gòu)成、數(shù)量及活力的相對恒定，是維護(hù)機體健康的必要條件。正常狀態(tài)下，腸道菌群、機體、外環(huán)境三者之間處于一種動態(tài)平衡。一旦機體受到某些因素影響，便會引起菌群的紊亂。當(dāng)人或動物腸道菌群紊亂時，一方面會使得有害的細(xì)菌代謝產(chǎn)物增加，有益的細(xì)菌代謝產(chǎn)物減少，大量內(nèi)毒素入血；另一方面大量抗原突破黏膜屏障，導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加，最終引起腸道炎癥。前期研究表明微生物種類和結(jié)構(gòu)的改變與 UC 的發(fā)病和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。在 UC 患者腸道內(nèi)，有益菌乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量明顯減少，有害細(xì)菌如大腸桿菌明顯增加。而有害細(xì)菌可以破壞腸黏膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生。這樣，腸道微生物紊亂也許是 UC 的另一種表現(xiàn)。因此，優(yōu)化和調(diào)節(jié)腸道微生物結(jié)構(gòu)，也為預(yù)防和治療UC 提供了一種策略。

當(dāng)前，UC 的治療主要以抗炎、抗免疫為主，如糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑類等藥物，但是這些藥物的價錢比較昂貴，且副作用比較嚴(yán)重，特別是長期治療危害更為嚴(yán)重，因此研究新的治療藥物非常必要。近些年來，自然植物成分在治療和預(yù)防疾病方面具有較好的效果。例如，氨基酸類，多酚類，精油類等均具有抗結(jié)腸炎的效果。因此，自然植物成分在預(yù)防或治療 UC 方面也許具有很好的情景?；ń穼儆谑|香科，被許多國家使用。從花椒中分離的精油具有廣泛的生物學(xué)性質(zhì)，如抗病原微生物，抗氧化、驅(qū)蟲、抗炎等。此外，其精油也被推薦用于治療胃腸功能紊亂性疾病，這也就暗示花椒精油（essential oil of Zanthoxylum bungeanum pericarp，ZBEO）可能具有抗UC 的效果。

葡聚糖硫酸鈉介導(dǎo)的 UC 模型小鼠與臨床上人類 UC 的發(fā)病機制相似。所以我們以葡聚糖硫酸鈉介導(dǎo)的 UC 模型小鼠為研究對象，以研究 ZBEO 對 UC 的作用，為臨床上UC 的防治提供理論依據(jù)的同時，也為與腸炎相關(guān)的疾病的防治提供一種可供選擇的參考。此外，也為花椒的開發(fā)以及在抗UC藥物方面的研發(fā)提供了新思路。

一、材料和方法

（一）ZBEO的制備及成分分析

取花椒果皮進(jìn)行干燥處理，通過油水分離器進(jìn)行油水分離，制備精油。然后利用氣相色譜-質(zhì)譜分析 ZBEO的主要化學(xué)成分。

（二）DSS誘導(dǎo)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的建立

取體重相似的小鼠，隨機分為6組，每組10只。第一組，對照組，讓其自由飲用純凈水，通過純凈水灌胃；第二組，DSS 模型組，讓其自由飲用純凈水，持續(xù)14天，從第15天開始自由飲用 2.5% DSS，持續(xù)7天；第三組，花椒精油低劑量干預(yù)組，自由飲用純凈水，灌胃ZBEO20 mg/kg，持續(xù)14天，從第15天開始自由飲用2.5% DSS，并添加ZBEO；第四組，花椒精油中劑量干預(yù)組，自由飲用純凈水，持續(xù)14天灌胃40 mg/kg ZBEO，接下來7天自由飲用2.5%DSS，同時灌胃等劑量ZBEO；第五組，花椒精油高劑量干預(yù)組，自由飲用純凈水，給小鼠灌胃60 mg/kg ZBEO，持續(xù)14天，從第15天開始自由飲用2.5% DSS，同時灌胃等劑量ZBEO，持續(xù)7天；第六組，花椒精油高劑量組，自由飲用純凈水，灌胃ZBEO80mg/kg，持續(xù)21天。

（三）小鼠疾病活動指數(shù)的評定

在第0，7，14，21 天記錄小鼠的體重。建立小鼠疾病活動指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)小鼠體重下降百分比評分、糞便潛血評分以及糞便松軟度評分進(jìn)行評定。在第21天后，處死小鼠，摘取出結(jié)腸，并測量其長度，隨后將后端結(jié)腸放入10%的甲醛溶液中固定，固定24 h以上。

（四）病理組織學(xué)觀察

將于甲醛固定的結(jié)腸進(jìn)行切片的制備：（1）樣本固定：將固定好的結(jié)腸取出。（2）脫水處理：用PBS清洗，重復(fù)3次，然后依次用 70%、80%、90%、95%和 100%的乙醇溶液進(jìn)行脫水。（3）透明處理：結(jié)腸組織用二甲苯I、II溶液進(jìn)行透明。（4）浸蠟：將組織轉(zhuǎn)入蠟槽中浸蠟。（5）包埋：浸蠟完成后，將結(jié)腸樣本置入石蠟中埋盒。（6）切片展片：將蠟塊置于切片機上進(jìn)行切片，并于溫水中舒展，烘干。（7）脫蠟：切片放入二甲苯I、II中，每次30 min，然后依次用100%、100%、95%、90%、80%、70%的乙醇溶液脫蠟，每次5 min。蒸餾水沖洗3次。（8）H.E.染色：依次用蘇木素染色5min，1%鹽酸溶液分化5-10s，蒸餾水，靜止3min，沖洗1 min。最后伊紅乙醇染色，1-2min。（9）脫水處理：依次用 95%、95%、100%和 100%的乙醇溶液進(jìn)行脫水。（10）透明封片：脫水完成后，在二甲苯I、II分別作用3min 和5min，封片。

（五）腸道細(xì)菌的培養(yǎng)和定量

在第21天時收集了每只小鼠的新鮮糞便，并稱重、記錄，檢測腸道內(nèi)有代表性的細(xì)菌的數(shù)量。隨后用PBS 進(jìn)行溶解和倍比稀釋，10倍稀釋若干梯度。乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基用于乳酸桿菌的培養(yǎng)和鑒定（厭氧條件），雙歧桿菌培養(yǎng)基用于雙歧桿菌的培養(yǎng)和鑒定（厭氧條件），麥康凱培養(yǎng)基用于大腸桿菌的計數(shù)（37℃需氧條件）。隨后進(jìn)行細(xì)菌計數(shù)、統(tǒng)計分析。

二、結(jié)語

通過實驗，找到UC小鼠腸道微生物含量、結(jié)構(gòu)、組分的變化，證明腸道菌群紊亂是造成UC的原因之一。通過花椒精油給藥，證明花椒精油對UC小鼠的腸道菌群有有益的影響。為降低治療UC的成本提供可能性，UC 的治療主要以糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑類等藥物為主，但是這些藥物的價錢比較昂貴?；ń肪妥鳛榛ń诽崛∥?，價格低廉。降低治療UC的過程中藥物產(chǎn)生的副作用。UC 的治療藥物糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑類等副作用比較嚴(yán)重，長期使用對人危害更大。花椒精油作為調(diào)味品對人體無副作用，簡化實際操作方法，糖皮質(zhì)激素類、免疫抑制劑類藥物實際生產(chǎn)操作復(fù)雜?；ń肪吞崛∵^程簡單。

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作者簡介：孫琳（1987.06- ），女，漢族，山東棗莊人，碩士，西安培華學(xué)院，助教，研究方向：抗感染免疫。