高鉛血癥兒童腸道菌群構(gòu)成變化研究

李樹然　李秋燕　彭鎮(zhèn)委

[摘要]目的探討高鉛血癥兒童腸道菌群構(gòu)成的變化。方法選取2013～2014年海華社康中心兒保門診兒童，高鉛血癥患兒29例，1：1配對健康對照兒童29例，檢測兩組兒童腸道菌群中雙歧桿菌、大腸桿菌、乳酸桿菌和腸球菌的數(shù)量以及腸道內(nèi)雙歧桿菌與大腸桿菌數(shù)量對數(shù)值的比值f即B/E值）。結(jié)果與對照組相比，高鉛血癥患者糞便中的乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量顯著下降（兩組P值均是0.000），大腸桿菌數(shù)量明顯升高（f=11.1，P=0.000），腸球菌在兩組中無統(tǒng)計學(xué)差異（t=0.497，P=0.623），高鉛血癥患兒B/E值為（0.75±0.34），顯著低于健康對照組（1.21±0.36）（t=-7.5，P=0.000）。結(jié)論高鉛血癥患兒體內(nèi)存在腸道菌群紊亂。

[關(guān)鍵詞]兒童；高鉛血癥；腸道菌群；構(gòu)成；變化

健康人的腸道棲息著1014個細(xì)菌，其中絕大多數(shù)為厭氧菌，主要有擬桿菌屬、梭菌、乳桿菌、大腸埃希菌屬和雙歧桿菌屬，大部分腸道細(xì)菌主要位于結(jié)腸、遠(yuǎn)端小腸，胃、十二指腸和空、回腸中也有菌群存在，腸道菌群構(gòu)成了人體胃腸道的生物學(xué)屏障，在維持腸道的正常結(jié)構(gòu)和生理功能上發(fā)揮著重要作用。兒童腸道菌群處于生理性演替過程中，年齡越小，其腸道的微生態(tài)平衡穩(wěn)定性越差，易于發(fā)生腸道微生態(tài)紊亂。鉛是一種不可降解的環(huán)境污染物。由于兒童代謝和發(fā)育的特點，在同等環(huán)境的人群中，鉛對其的毒性作用更明顯，尤其是對智力與行為能力的發(fā)育有重要影響。兒童通過鉛污染食物及消化道接觸鉛，占總接觸量的80%～90%以上。鉛在消化道的吸收部位主要在小腸，但大腸對鉛也有吸收。在吸收和排泄的過程中，鉛不可避免地會與腸道菌群接觸，但這二者之間的相互性未見報道。本研究通過分析高鉛血癥患兒的糞便中腸道菌群主要成分的菌落數(shù)變化和腸道內(nèi)雙歧桿菌和大腸桿菌數(shù)量對數(shù)值的比值（即B/E值），以對高鉛血癥與腸道菌群構(gòu)成的關(guān)系進(jìn)行了探討。現(xiàn)報道如下。

1.資料與方法

1.1一般資料

選擇2013～2014年寶安區(qū)海華社康中心兒保門診，近期未患感染性疾病或其他疾病的兒童，年齡2～6歲。采集靜脈血樣，送南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院專用實驗室統(tǒng)一用博暉BH-2100鎢舟原子吸收光譜儀檢測。按1991年美國國家疾病預(yù)防控制中心制定的兒童高鉛血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將血鉛值≥100ug/L（0.483umol/L）（無論是否有相應(yīng)臨床體征或其他血液、生化改變）兒童，納入高鉛血癥組：共29例，平均年齡（3.2±0.5）歲，男19例，女10例。為消除混雜因素的影響，采取1：1配對，選取同期參加體檢的，與病例組同年齡、同性別的29例健康兒童（血鉛值<100ug/L的兒童做為對照組。以上入選患兒均征得監(jiān)護人同意后簽訂知情同意書。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2腸道菌群檢測

（1）無菌方法采集受試兒童新鮮糞便（1h內(nèi)），80℃保存。（2）定量稱取標(biāo)本0.1g，予10倍系列稀釋至10-1～10-9，連同原液一共10個稀釋度；（3）用微量移液器抽取10uL，分別接種于MRSA、TPY、EMB、Pz選擇性培養(yǎng)基上，用L棒涂抹均勻，用于培養(yǎng)乳酸桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌以及腸球菌，計數(shù)時取菌落平均數(shù)。（4）將MRSA、TPY培養(yǎng)基放入?yún)捬豕拗校糜趨捬醍a(chǎn)氣袋封閉，再放入37℃的孵育箱中培養(yǎng)48h；同時將EMB、PZ培養(yǎng)基直接放人37℃的孵育箱中培養(yǎng)24h；（5）培養(yǎng)結(jié)束后選取特征性的菌落進(jìn)行菌落圖片染色及鏡檢，根據(jù)革蘭染色以及細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征判斷目的菌。在確定目的菌后，根據(jù)計算平板上的活菌計數(shù)以及稀釋度，用活菌計數(shù)公式計數(shù)，結(jié)果用每克糞便濕質(zhì)量中的菌落形成單位的對數(shù)值表示（即log CFU/g）。每毫升標(biāo)本中活菌集落單位（即CFU/mL）=（標(biāo)本質(zhì)量+稀釋量）/標(biāo)本質(zhì)量×稀釋度×菌落個數(shù)（或×10）（稀釋度即為稀釋倍數(shù)）。

1.3B/E值計算

B/E值為腸道內(nèi)雙歧桿菌與大腸桿菌數(shù)量對數(shù)值的比值，用來表示兒童腸道菌群構(gòu)成，可以反映腸道的功能狀況：B/E值<1表示腸道定植抗力降低，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂；≥1則表示正常。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計。實驗中的計量資料均符合正態(tài)分布，用（x±s）表示。組問菌落數(shù)和B/E值比較使用t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1高鉛血癥組與對照組腸道茵群數(shù)量比較

高鉛血癥患兒與對照組兒童的腸道菌群數(shù)量比較顯示，除腸球菌外，雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌組P=0.000，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

2.2高鉛血癥組與健康對照組腸道菌群B/E值比較

高鉛血癥患兒的腸道菌群B/E值為（0.785±0.34），<1。健康對照組的B/E值為（1.2132±0.36），>1。健康對照組的B/E值高于高鉛血癥組（t=7.6，P=0.00）

3.討論

研究顯示，大腸與小腸一樣，對鉛也有吸收，而且大腸是腸道菌群寄居的主要部位，腸道菌群為宿主提供能量底物，腸道菌群紊亂可導(dǎo)致體內(nèi)代謝混亂，從而可能影響腸道對鉛的吸收。國內(nèi)外對腸道菌群與人體內(nèi)鉛的吸收、排泄關(guān)系研究，主要如下：（1）腸道菌群發(fā)育不良動物的腸黏膜薄而干燥，腸道通透性較高，使一些原來不易進(jìn)入人體循環(huán)的大分子抗原等物質(zhì)能通過主動轉(zhuǎn)運和被動擴散等形式穿透腸道上皮。（2）腸道菌群的穩(wěn)定對維持人體正常排便機制具有重要作用，腸道菌群失調(diào)參與了便秘的產(chǎn)生與加重，從而引起鉛的吸收增加。（3）微量元素鈣、銅、鐵、鎂、鋅等在腸道吸收時與鉛共用同一部位的轉(zhuǎn)運蛋白，鉛一鈣、鉛一鐵、鉛鋅等之間均有拮抗作用，補充鈣、鋅劑等能降低血鉛。而腸道正常菌群如雙歧桿菌可通過對碳水化合物的發(fā)酵，使短鏈脂肪酸產(chǎn)物增多，降低腸道PH值，能促進(jìn)對鈣、鐵、鎂等離子的吸收。（4）一些益生菌具有驅(qū)鉛能力。芬蘭學(xué)者發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌、雙歧桿菌菌株具有快速清除被污染水中的重金屬鉛和鎘的能力。

在本研究中，高鉛血癥組患兒的雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌分別為（6.59±0.56）lg（CFU/g）、（6.73±1.05）1g（CFU/g）和（8.44±1.21）1g（CFU/g），與對照組兒童的腸道菌群數(shù)量比較顯示，高鉛血癥組患兒的雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量明顯減少，大腸桿菌明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明乳酸桿菌、雙歧桿菌菌株可能具有清除被污染水中的重金屬鉛和鎘的能力，這與芬蘭學(xué)者發(fā)現(xiàn)一致。同時，根據(jù)學(xué)者Teemu等發(fā)現(xiàn)，乳酸桿菌ME3和雙歧桿菌L46在人體外可通過可逆性的表面結(jié)合的方式，達(dá)到清除水溶液中的鉛和鎘?？紤]體內(nèi)的這些腸道益生菌具有和鉛結(jié)合的能力，這些益生菌數(shù)量的增加能直接降低鉛吸收。當(dāng)然，這有待更直接的實驗證據(jù)證實。

高鉛血癥患兒的腸道菌群B/E值<1，健康對照組的B/E值>1，結(jié)果顯示高鉛血癥患兒B/E值顯著低于健康對照組。這提示高鉛血癥患兒腸道定植抗力降低，腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

另一方面，本實驗發(fā)現(xiàn)高鉛血癥組患兒的腸球菌為（6.16±0.92）lg（CFU/g），與對照組兒童的腸球菌比較顯示，數(shù)量無明顯差異。這說明高鉛血癥患兒存在的腸道菌群紊亂主要體現(xiàn)在雙歧桿菌、乳酸桿菌等益生菌的影響上，而益生菌的減少易導(dǎo)致兒童消化不良，導(dǎo)致了便秘的產(chǎn)生與加重。這一研究結(jié)果與高鉛血癥患兒往往存在便秘、不規(guī)則腹痛、輕度消化不良的臨床表現(xiàn)現(xiàn)象一致。同時，便秘等導(dǎo)致鉛在消化道停留時間延長，引起鉛的吸收增加，這與Parslow的發(fā)現(xiàn)一致。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高鉛血癥患兒存在腸道菌群紊亂，且從現(xiàn)有線索可以推測腸道菌群影響著鉛的吸收與排泄，特別是消化道雙歧桿菌、乳酸桿菌的數(shù)量直接影響到消化道對鉛的吸收，這提示我們可以通過增加雙歧桿菌、乳酸桿菌的攝入，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，從而治療與防止高鉛血癥。